Name: in vitro assessment of myocardial protection following hypothermia-preconditioning in a human cardiac myocytes model
Uploaded: 2020-10-27T14:45:00
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Este trabajo fue financiado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81970265, 81900281,81700288), la Fundación china de ciencias postdoctorales (2019M651904); y el Programa Nacional clave de investigación y desarrollo de China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).

La información relativa a los reactivos e instrumentos comerciales figura en la Tabla de Materiales.
La línea celular cardiomiocito humano AC16 se derivó de la fusión de células primarias del tejido cardíaco ventricular adulto con fibroblastos humanos transformados en SV4017,que fueron comprados a BLUEFBIO (Shanghai, China). La línea celular desarrolla muchas características bioquímicas y morfológicas características de los miomiocitos. Adem?...

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	<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Ischemia+Induces+SDF-1alpha+Release+in+Cardiac+Surgery+Patients.">Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).</li><li>Klein, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Less+invasive+ventricular+reconstruction+for+ischaemic+heart+failure.">Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure.</a> EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).</li><li>Otto, K. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp90aa1:+a+novel+target+gene+of+miR-1+in+cardiac+ischemia/reperfusion+injury.">Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury.</a> Sci Rep. 6, 24498 (2016).</li><li>Castedo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hypothermia+on+right+atrial+cardiomyocyte+apoptosis+in+patients+undergoing+aortic+valve+replacement.">Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).</li><li>Krech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+therapeutic+hypothermia+induces+multimodal+protective+effects+in+oxygen-glucose+deprivation/reperfusion+injured+cardiomyocytes.">Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes.</a> Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).</li><li>Cooper, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermic+circulatory+arrest+causes+multisystem+vascular+endothelial+dysfunction+and+apoptosis.">Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis.</a> ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).</li><li>Kajimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cerebral+perfusion+prevents+abnormalities+in+glutamate+cycling+and+neuronal+apoptosis+in+a+model+of+infant+deep+hypothermic+circulatory+arrest+and+reperfusion.">Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion.</a> JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Hypothermic+Circulatory+Arrest+Does+Not+Show+Better+Protection+for+Vital+Organs+Compared+with+Moderate+Hypothermic+Circulatory+Arrest+in+Pig+Model.">Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model.</a> Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).</li><li>Davidson, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-146a+attenuates+apoptosis+and+modulates+autophagy+by+targeting+TAF9b/P53+pathway+in+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">miR-146a attenuates apoptosis and modulates autophagy by targeting TAF9b/P53 pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Cell Death Discovery. 10 (9), 668 (2019).</li><li>Schmitt, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+modulates+IL-6+release+and+cytotoxicity+from+hypothermic+brain+cells+and+inhibits+hypothermia-induced+axonal+outgrowth.">S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth.</a> NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).</li><li>Tong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+hypothermia+therapy+attenuates+LPS-induced+microglia+neuroinflammation+via+the+STAT3+pathway.">Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway.</a> Neuroscience. 358, 201-210 (2017).</li><li>Yu, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troxerutin+attenuates+oxygenglucose+deprivation+and+reoxygenationinduced+oxidative+stress+and+inflammation+by+enhancing+the+PI3K/AKT/HIF1alpha+signaling+pathway+in+H9C2+cardiomyocytes.">Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes.</a> Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).</li><li>Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+hypothermia+protect+cardiomyocytes+during+cardioplegic+ischemia.">How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia.</a> European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).</li><li>Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. 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S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinued+stimulation+of+cardiomyocytes+provides+protection+against+hypothermia-rewarming-induced+disruption+of+excitation-contraction+coupling.">Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling.</a> EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).</li><li>Yarbrough, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibition+attenuates+contractile+dysfunction+following+cardioplegic+arrest+and+rewarming+in+the+setting+of+left+ventricular+failure.">Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure.</a> Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).</li><li>Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia-induced+spatially+discordant+action+potential+duration+alternans+and+arrhythmogenesis+in+nonhibernating+versus+hibernating+mammals.">Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals.</a> AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).</li><li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+Hypothermia+Modifies+Coronary+Hemodynamics+and+Endothelium-Dependent+Vasodilation+in+a+Porcine+Model+of+Temperature+Management.">Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).</li><li>Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ECG-biomarker+for+cardiac+arrest+during+hypothermia.">A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation &amp; Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).</li></ol>

Las complejidades de los animales intactos, incluidas las interacciones entre diferentes tipos de células, a menudo impiden estudios detallados de componentes específicos de lesiones de E/S. Por lo tanto, es necesario establecer un modelo celular in vitro que pueda reflejar con precisión los cambios moleculares después de la isquemia in vivo. La investigación sobre modelos OGD se ha divulgado previamente13,22, y muchos métodos sofisticados se han establecid...

La disfunción miocárdica derivada de la isquemia/reperfusión es un escenario clínico común en pacientes después de la cirugía cardíaca1,2. Durante la perfusión de bajo flujo nopulsatile y los períodos de detención circulatoria total, todavía se producen daños que involucran todo tipo de células cardíacas. En particular, la sensibilidad de los cardiomiocitos a lesiones isquémicas es mayor que la de otras poblaciones celulares. En la actualidad, la hipotermia terapéutica (TH) ofrece una protección sustancial contra un insulto isquémico esperado en pacientes sometidos a cirugía cardíaca3,4. TH se define como una temperatura corporal central de 14-34 °C, aunque no existe consenso con respecto a una definición de enfriamiento durante la cirugía cardíaca5,6,7. En 2013, un panel internacional de expertos propuso un sistema de presentación de informes estandarizado para clasificar varios rangos de temperatura de la detención circulatoria hipotérmica sistémica8. Basándose en estudios de electroencefalografía y metabolismo del cerebro, dividieron la hipotermia en cuatro niveles: hipotermia profunda (≤ 14 °C), hipotermia profunda (14.1-20 °C), hipotermia moderada (20.1-28 °C) e hipotermia leve (28.1-34 °C). El consenso de expertos proporcionó una clasificación clara y uniforme, permitiendo que los estudios fueran más comparables y proporcionaran resultados más relevantes clínicamente. Esta protección otorgada por TH se basa en su capacidad para reducir la actividad metabólica de las células, limitando aún más su tasa de consumo de fosfatos de alta energía9,10. Sin embargo, el papel de la TH en la protección miocárdica es controvertido y puede tener múltiples efectos dependiendo del grado de hipotermia.
La E/R miocárdica es bien conocida por el aumento de la apoptisis celular11. Informes recientes han observado que la muerte programada de cardiomiocitos aumenta durante la cirugía a corazón abierto, y puede coincidir con necrosis, aumentando así el número de células miocárdicas muertas12. Por lo tanto, reducir la apoptosis cardiomiocito es un enfoque terapéutico útil en la práctica clínica. En el modelo de cardiomiocito HL-1 auricular del ratón, se demostró hipotermia terapéutica para reducir la liberación mitocondrial de citocromo c y factor inductor de apoptosis (AIF) durante la reperfusión13. Sin embargo, el efecto de la temperatura en la regulación de la apoptosis es controvertido y parece depender del grado de hipotermia. Cooper y sus colegas observaron que en comparación con un grupo de control de bypass cardiopulmonar normotérmico, la tasa de apoptosis de tejido miocárdico de cerdos con el arresto circulatorio hipotérmico profundo se incrementó14. Además, los resultados de algunos estudios han sugerido que la hipotermia profunda puede activar la vía de la apoptosis, mientras que la hipotermia menos agresiva parece inhibir la vía12,15,16. La razón de este resultado puede deberse a efectos confusos asociados con lesiones isquémicas y la falta de comprensión de los mecanismos por los cuales la temperatura afecta el tejido miocárdico. Por lo tanto, los límites de temperatura en los que se mejora o atenua la apoptosis deben definirse con precisión.
Para obtener una mejor comprensión de los mecanismos asociados con la eficacia de la hipotermia y proporcionar una base racional para su implementación en seres humanos, es esencial identificar una condición de cultivo similar a las condiciones in vivo que pueden producir daños similares a los observados para la condición clínica de una manera reproducible. Un paso esencial hacia la consecución de este objetivo es establecer las condiciones óptimas para inducir la apoptosis cardiomiocito. En consecuencia, en el presente estudio, exploramos los detalles metodológicos con respecto a los experimentos de privación de oxígeno y glucosa con células cultivadas, un modelo in vitro fácil de isquemia-reperfusión. Además, evaluamos el efecto de diferentes tiempos hipoxico-isquémicos en la apoptosis cardiomiocito, y verificamos nuestra hipótesis sobre el efecto de diferentes condiciones de temperatura en la apoptosis celular in vitro.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1062M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac myocyte growth supplement</td>
			<td>Sciencell,USA</td>
			<td>6252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3 activity assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 8 activity assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, no glucose</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>CytoFLEX,USA</td>
			<td>B49007AF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human myocardial cells</td>
			<td>BLUEFBIO,China</td>
			<td>BFN60808678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive oxygen species assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-gas incubator</td>
			<td>Memmert,Germany</td>
			<td>ICO50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of myocardial protection following hypothermia-preconditioning in a human cardiac myocytes model

La disfunción miocárdica derivada de la isquemia/reperfusión es un escenario clínico común en pacientes después de una cirugía cardíaca. En particular, la sensibilidad de los cardiomiocitos a lesiones isquémicas es mayor que la de otras poblaciones celulares. En la actualidad, la hipotermia ofrece una protección considerable contra un insulto isquémico esperado. Sin embargo, las investigaciones sobre cambios moleculares complejos inducidos por hipotermia siguen siendo limitadas. Por lo tanto, es esencial identificar una condición de cultivo similar a las condiciones in vivo que pueden inducir daños similares a los observados en la condición clínica de una manera reproducible. Para imitar condiciones similares a la isquemia in vitro, las células de estos modelos fueron tratadas por la privación de oxígeno/glucosa (OGD). Además, aplicamos un protocolo estándar de temperatura de tiempo utilizado durante la cirugía cardíaca. Además, proponemos un enfoque para utilizar un método simple pero completo para el análisis cuantitativo de la lesión miocárdica. La apoptosis y los niveles de expresión de proteínas asociadas a la apoptosis fueron evaluados por la citometría de flujo y utilizando un kit ELISA. En este modelo, probamos una hipótesis sobre los efectos de diferentes condiciones de temperatura en la apoptosis cardiomiocito in vitro. La fiabilidad de este modelo depende de un estricto control de temperatura, procedimientos experimentales controlables y resultados experimentales estables. Además, este modelo se puede utilizar para estudiar el mecanismo molecular de cardioprotección hipotérmica, que puede tener implicaciones importantes para el desarrollo de terapias complementarias para su uso con hipotermia.

El efecto de la exposición a OGD en la viabilidad de los HHCM fue determinado por el ensayo CCK-8. En comparación con la observada en el grupo de control, la viabilidad celular se redujo significativamente de manera dependiente del tiempo (Figura 2A). Las tasas de apoptosis de los HHCM en diferentes momentos después de la reperfusión mostraron una tendencia específica, donde de 0 a 16 h, las tasas de apoptosis aumentaron gradualmente y alcanzaron la tasa máxima en el punto de tiempo de...

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In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

Los distintos efectos de los diferentes grados de hipotermia en la protección miocárdica no han sido evaluados a fondo. El objetivo del presente estudio era cuantificar los niveles de muerte celular tras diferentes tratamientos de hipotermia en un modelo humano basado en cardiomiocitos, sentando las bases para futuras investigaciones moleculares en profundidad.

Evaluación in vitro de la protección miocárdica después del preaccondicionamiento de hipotermia en un modelo de miocitos cardíacos humanos

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Trasplante de células madre en un In vitro Simulación de isquemia / reperfusión modelo

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Investigación

Medicina

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

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Evaluación de la función cardiaca y la morfología de miocardio utilizando pequeñas Look-locker Recuperación Inversion Animal (SALLI) MRI en ratas

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Infarto de miocardio y la evaluación de resultados funcionales en los cerdos

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Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

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Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Carrera

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Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

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A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

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Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Implantación de parches hiPSC derivado de músculo cardiaco después de lesión del miocardio en un modelo del conejillo de Indias

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...