Name: pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase
Uploaded: 2020-09-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse National Institute of Health (GM097569).

1. Snel protocol om de α- en β-subeenheid en de opnieuw verbonden α2β2StTS complex te zuiveren
<ol><li>DNA-subcloning in pETSUMO-expressievector<ol><li>Verkrijg het translationeel koppelingsgen (trpA en trpB) dat codeert voor de α- en β- subeenheden van het tryptofaansynthase van de bacterie Salmonella enterica serovar typhimurium gekloond in de pEBA-10 expressievector22. Gebruik pEBA-10 vector als DNA-sjabloon. OPMERKIN...

<ol>
	<li>Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+multienzyme+complex+with+an+intramolecular+tunnel.">Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel.</a> Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).</li><li>Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+mine+for+enzymologists.">Tryptophan synthase: a mine for enzymologists.</a> Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).</li><li>Dunn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+substrate+channeling+and+catalysis+in+the+tryptophan+synthase+bienzyme+complex.">Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).</li><li>Chaudhary, K., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protozoan+genomics+for+drug+discovery.">Protozoan genomics for drug discovery.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).</li><li>Caldwell, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+in+Chlamydia+trachomatis+tryptophan+synthase+genes+differentiate+between+genital+and+ocular+isolates.">Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).</li><li>Kulik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+structural+basis+of+the+catalytic+mechanism+and+the+regulation+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium+and+BX1+from+maize,+two+evolutionarily+related+enzymes.">On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).</li><li>Barends, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanistic+implications+of+a+tryptophan+synthase+quinonoid+intermediate.">Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate.</a> Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).</li><li>Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+catalytic+properties+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase,+a+two-component+enzyme.">A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).</li><li>Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A+protein+of+the+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+Purification,+crystallization,+and+composition+studies.">The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).</li><li>Wilson, D. A., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+B+component+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase.">Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase.</a> Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).</li><li>Adachi, O., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+preparing+crystalline+beta+2+subunit+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli+in+high+yield.">A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).</li><li>Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystalline+alpha2+beta2+complexes+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+A+comparison+between+the+native+complex+and+the+reconstituted+complex.">Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).</li><li>Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+proteolytic+derivative+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase.+Identification+of+the+site+of+cleavage+and+characterization+of+the+fragments.">An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.</a> Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).</li><li>Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+crystallographic+data+of+the+tryptophan+synthase+alpha+2+beta+2+complex+from+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).</li><li>Miles, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+tryptophan+synthase.+Clarification+of+the+roles+of+histidine+86,+lysine+87,+arginine+148,+cysteine+170,+and+cysteine+230.">The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).</li><li>Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+K++or+Cs++for+Na++induces+local+and+long-range+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+the+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex.">Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex.</a> Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+mutant+(betaK87T)+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+with+ligands+bound+to+the+active+sites+of+the+alpha-+and+beta-subunits+reveal+ligand-induced+conformational+changes.">Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes.</a> Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).</li><li>Schneider, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop+closure+and+intersubunit+communication+in+tryptophan+synthase.">Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).</li><li>Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crystallography+of+a+true+substrate,+indole-3-glycerol+phosphate,+bound+to+a+mutant+(alphaD60N)+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+reveals+the+correct+orientation+of+active+site+alphaGlu49.">Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).</li><li>Weyand, M., Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+wild-type+tryptophan+synthase+complexed+with+the+natural+substrate+indole-3-glycerol+phosphate.">Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate.</a> Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).</li><li>Sachpatzidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+studies+of+phosphonate-based+alpha-reaction+transition-state+analogues+complexed+to+tryptophan+synthase.">Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).</li><li>Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+mutagenesis+and+overexpression+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium:+On+the+roles+of+beta+(2)+subunit+Lys-382.">PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382.</a> Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Lowry, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Measurement+with+the+Folin+Phenol+Reagent.">Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent.</a> Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+mutagenesis+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium.+Changing+arginine+179+to+leucine+alters+the+reciprocal+transmission+of+substrate-induced+conformational+changes+between+the+alpha+and+beta+2+subunits.">Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).</li><li>Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iMOSFLM:+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM.">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, 271-281 (2011).</li><li>Evans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+and+Assessment+of+Data+Quality.">Scaling and Assessment of Data Quality.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 72-82 (2006).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).</li><li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+replacement+with+MOLREP.">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 22-25 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 213-221 (2010).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 486-501 (2010).</li><li>Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+macromolecular+structures+by+the+maximum-likelihood+method.">Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, 240-255 (1997).</li><li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine.">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, 352-367 (2012).</li><li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+content+of+protein+crystals.">Solvent content of protein crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</li><li>Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coefficient+probabilities:+Improved+estimates+for+unit+cell+contents+of+proteins,+DNA,+and+protein-nucleic+acid+complex+crystals.">coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals.</a> Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).</li></ol>

We hebben met succes mutante vorm α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T, en α2β2 βS377A StTS complexen voor structuur-functie correlatie studies. Aanvankelijk hebben we geprobeerd de mutanten te zuiveren met behulp van een eerder zuiveringsprotocol22, dat α2β2StTS-complex kristallisatie met PEG 8000 en spermine vereist tijdens zuivering. Hoewel de kristallisatiesnelheid afhangt van de mutante vo...

Het tryptofaan synthase (TS) bi-enzym complex (α2β2) is een allosterisch enzym, dat de laatste twee stappen in de biosynthese van het aminozuur L-tryptofaan in bacteriën, planten en schimmels1,2,3katalyseert. Bacterie Salmonella enterica serovar typhimurium (St) veroorzaakt een ernstige gastro-intestinale infectie bij mens en andere dieren. Aangezien mensen en hogere dieren geen TS hebben (EC 4.2.1.20), is deremmingvan S. typhimurium α 2 β2 TS-complex (α2β2StTS) onderzocht als een potentieel geneesmiddeldoel voor de behandeling van cryptosporidiose en tuberculose4, genitale en oculaire infecties5, en voor potentieel herbicidegebruik in de landbouw6. De α-subeenheid katalyseert het aldolytische decolleté van indool-3-glycerolfosfaat (IGP) tot glyceraldehyde-3-fosfaat (GAP) en indool, door de vorming van een indolytine tautomeer intermediair en vervolgens koolstof-koolstofbindingssplitsing om GAP en indool3,6te produceren . De β-katalytische plaats bevat een pyridoxaal 5′-fosfaat (PLP) cofactormolecuul gebonden aan β-Lys87 via een Schiff-basis, dat functioneert als een elektronenzinking in de loop van de reacties op het enzym β-subeenheid3,7. De β-site katalyseert de vervanging van de L-Serine side-chain hydroxyl door indool om L-tryptofaan en een watermolecuul in een PLP-afhankelijke reactie te geven. Sint TS dient als een reeds lang bestaand model voor het onderzoek naar substraatangeulering en allosterische communicatie binnen multi-enzymcomplexen2,3. Bidirectionele allosterische communicatie tussen de α- en β-subeenheden van TS is noodzakelijk om de katalytische stappen te synchroniseren en indoolafgifte tijdens L-tryptofaansynthese te voorkomen3. Om deze inspanning uit te breiden, hebben we verschillende mutanten (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr en β-Ser377Ala) voorbereid door eenpuntsmutatie om te worden gebruikt bij verdere verkenningen van de relatie tussen enzymstructuur, mechanisme en functie op de katalytische locatie van de StTS β-subeenheid.
Gedetailleerd onderzoek naar het katalytische mechanisme van α2β2StTS is geïnitieerd door de onderzoeksgroep van Edith W. Miles. Vroege studies met inheemse Escherichia coli α2β2 TS-complex hebben zich gericht op de zuivering en karakterisering van het geïsoleerde α-subeenheid8,9, geïsoleerde β-subeenheid10,11 en de reconstitutie van het α2β2 TS-complex van de geïsoleerde subeenheden12. De zuivering werd uitgevoerd door ammoniumsulfaatprecipitatie, monsterdialyse, DEAE-Sephadexchromatografie, dialyse en een tweede chromatografische ronde op een DEAE-Sephadex kolom12. In een ander protocol werd de zuivering van hetzelfde complex verbeterd door het geklaarde cellysaat op een DEAE-Sephadex-kolom te laden, gevolgd door een chromatografische stap op een Sepharose 4B-kolom, ammoniumsulfaatprecipitatie en dialyse13. Beide zuiveringsprotocollen duren 4-5 dagen. Escherichia coli α2β2 TS complex gekristalliseerd, maar kristallen waren op dat moment niet geschikt voor röntgendiffractie.
In een nieuwe studie werden recombinante en wilde typevormen van S. typhimurium α2β2 TS-complex gezuiverd en gekristalliseerd14,15. Het recombinant α2β2StTS complex werd overexpressie in E. coli stam CB149 met de pEBA-10 expressievector. Initiële kristallisatie en röntgendiffractiegegevensverzameling en analyse van de α2β2StTS-complex werden gerapporteerd14. Lange en dunne naalden zoals α2β2StTS-kristallen hebben echter de structurele studies aangetast. In een poging om betere röntgendiffractiegegevens te verzamelen, werd een ander zuiveringsprotocol beschreven om het wilde type en de mutante vormen van de α2β2StTS-complex15te zuiveren. Zuivering werd uitgevoerd met een eerste neerslag met spermine en PEG 8.000 in het geklaarde cellysaat en een groot omvangrijk neerslag werd verwijderd door centrifugeren. De supernatansfractie met grote hoeveelheden α2β2StTS-complex werd 16-48 uur bij 4 °C bewaard totdat gele kristallen neersloegen. Kristallen werden gewassen en uitgebreid gedialyseerd tegen verschillende buffers. Eiwitcomplex werd opnieuw gekeerd in buffer met ammoniumsulfaat en gedialyseerd15. Hoewel eiwitkristallisatie afhankelijk is van eiwit- en precipitante concentraties in oplossing, is het moeilijk om zuivering te controleren, te voorspellen en te reproduceren voor andere mutante vormen van α2β2StTS-complex in oplossing. Dit protocol heeft als voordeel dat het geen chromatografische methoden gebruikt; de nadelen zijn echter de lange zuiveringstijd die nodig is om te kristalliseren, dialyseren en recrystalliseren, meestal 5-7 dagen. Om kristallen te verkrijgen die geschikt zijn voor het verzamelen van röntgengegevens, werden meer dan 600 kristallisatieomstandigheden geëvalueerd met behulp van een combinatie en variatie van eiwitconcentratie, temperatuur, precipitanten (PEG 4.000, 6.000 en 8.000) en additieven (CaCl2,MnCl2,ZnCl2,cadaverine, putrescine, spermine of spermidine)15. Kristallen hadden een betere kristallijne vorm en groeiden sneller in omstandigheden met 12% PEG 8.000 en 2 mM spermine. Kristallisatie was gunstiger bij 25 °C in plaats van bij 4, 30 of 42 °C en groeide binnen 3 dagen15uit tot maximale afmetingen. Verschillende α2β2StTS kristalstructuren werden gemeld op dat moment (1996-1999)16,17,18,19,20,21 en vele andere structuren zijn tot op heden gepubliceerd.
Hier is het belangrijkste doel om alternatieve protocollen te presenteren om tryptofaansynthase te zuiveren en eiwitkristallisatie te optimaliseren. Het huidige werk toont significante verbeteringen om het wilde type geïsoleerde α-subeenheid (αStTS), geïsoleerde β-subeenheid (βStTS) te zuiveren, gereconstitueerd α2β2StTS-complex van de geïsoleerde subeenheden, en wilde type en mutante vormen van de α2β2StTS complex. De voordelen ten opzichte van eerdere protocollen zijn aanzienlijk omdat de zuiveringstijd aanzienlijk werd verkort en kristallisatie en cryoprotectie werden geoptimaliseerd. Mutante vormen van α2β2StTS complex ontworpen in dit werk hebben gekristalliseerd in de buurt van dezelfde voorwaarde gebruikt voor de wild type vorm. Echter, fijne kristallisatie optimalisatie was nodig om grote enkele kristallen van voldoende kwaliteit te verkrijgen voor structuurbepaling bij bijna atoomresolutie. Tot op heden zijn er 134 tryptofaan synthase kristalstructuren afgezet in de Protein Data Bank (PDB), respectievelijk 101, 31 en 2 kristalstructuren voor bacteriën, archaea en eukaryote. Mooi, 73 structuren behoren tot S. enterica serovar typhimurium en 5 kristalstructuren van de α2β2StTS complex hebben resolutielimieten hoger dan 1,50 Angstroms. Het is niet verwonderlijk dat 4 van de 5 werden voorbereid in onze onderzoeksgroep (PDB ID's: 5CGQ om 1,18 Å, 4HT3 om 1,30 Å, 4HPJ om 1,45 Å, 6DZ4 om 1,45 Å-resolutie). De verfijnde kristalstructuren van mutante vorm van α2β2StTS complex zullen naar verwachting nieuwe inzichten verschaffen in het mechanisme en de rollen die worden gespeeld door essentiële aminozuurresiduen die betrokken zijn bij de L-tryptofaansynthese.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL 10 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL 100 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430489</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-141</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cryschem Plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-158</td>
			<td>24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td>centrifuge conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB15 ACCUMET Basic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB15</td>
			<td>pH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td>Agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S35836</td>
			<td>incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2646100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 Digital Sonifier</td>
			<td>Brason</td>
			<td>B450</td>
			<td>Cell disruptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP210-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC213601000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1391</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>HF polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10-297-018</td>
			<td>dNTPs set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42">Excella E25R Orbital Shaker</td>
			<td>Eppendorf New Brunswick</td>
			<td>M1353-0004</td>
			<td>Orbital incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>8149-30-0004</td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210012</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0104S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-5255-01</td>
			<td>5 mL Histrap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelvinator Series-100</td>
			<td>Kelvinator</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Ultra low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Liquid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Solid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0193S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA affinity beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R90115</td>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-865-0</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxal phosphate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC228170010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-200 HR</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-000-196</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-5B centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1004</td>
			<td>Floor cetrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC132750010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-002-491</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>DNA liagse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubl-specific protease 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12588018</td>
			<td>SUMO Protease</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase

Structurele studies met tryptofaan synthase (TS) bi-enzym complex (α2β2 TS) van Salmonella typhimurium zijn uitgevoerd om het katalytische mechanisme, allosterisch gedrag en details van de enzymatische transformatie van substraat naar product in PLP-afhankelijke enzymen beter te begrijpen. In dit werk maakte een nieuw expressiesysteem om de geïsoleerde α- en geïsoleerde β-subeenheid te produceren, de zuivering van grote hoeveelheden zuivere subeenheden en α2β2StTS-complex van de geïsoleerde subeenheden binnen 2 dagen mogelijk. De zuivering werd uitgevoerd door affiniteitschromatografie gevolgd door decolleté van de affiniteitstag, ammoniumsulfaatprecipitatie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). Om de rol van belangrijke residuen in het enzym β-site beter te begrijpen, werd site-directe mutagenese uitgevoerd in eerdere structurele studies. Een ander protocol werd gemaakt om het wilde type en mutant te zuiveren α2β2StTS complexen. Een eenvoudig, snel en efficiënt protocol met ammoniumsulfaatfractie en SEC maakte zuivering van α2β2StTS-complex in één dag mogelijk. Beide zuiveringsprotocollen die in dit werk worden beschreven, hebben aanzienlijke voordelen in vergelijking met eerdere protocollen om hetzelfde complex te zuiveren met BEHULP van PEG 8000 en spermine om de α2β2StTS-complex langs het zuiveringsprotocol te kristalliseren. Kristallisatie van het wilde type en sommige mutante vormen vindt plaats onder iets andere omstandigheden, waardoor de zuivering van sommige mutanten met PEG 8000 en spermine wordt aangetast. Om kristallen voor te bereiden die geschikt zijn voor röntgenkristallografische studies werden verschillende inspanningen geleverd om kristallisatie, kristalkwaliteit en cryoprotectie teoptimaliseren. De hier gepresenteerde methoden moeten algemeen toepasbaar zijn voor de zuivering van tryptofaansynthasesubeenheden en wilde α2β2StTS-complexen.

Zuivering van de α- en β- subeenheden van het tryptofaansynthase De α-subeenheid (αStTS) en de β-subeenheid (βStTS) van het Salmonella typhimurium tryptofaan synthase werden gesubclod in de gemodificeerde pET SUMO vector. Figuur 1A toont representatieve SDS-PAGE resultaten van twee sterke banden die overeenkomen met de His6-SUMO-αStTS (...

Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Dit artikel presenteert een reeks opeenvolgende methoden voor de expressie en zuivering van Salmonella typhimurium tryptofaan synthase comp dit protocol een snel systeem om het eiwitcomplex in een dag te zuiveren. Behandelde methoden zijn site-gerichte mutagenese, eiwitexpressie in Escherichia coli,affiniteitschromatografie, gelfiltratiechromatografie en kristallisatie.

PCR Mutagenese, Klonen, Expressie, Snelle Eiwitzuiveringsprotocollen en Kristallisatie van het Wilde Type en Mutante Vormen van Tryptofaan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Proteïne Expressie, Kristallisatie en Biofysische Studies van a<em&gt; Bacillus</em&gt; -conserveerd nucleotide pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Geautomatiseerd protocollen voor macromoleculaire kristallisatie bij het MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Cafeïne-extractie, enzymatische activiteit en genexpressie van cafeïne Synthase uit plantaardige cel schorsingen

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Meningsuiting, solubilisatie en zuivering van eukaryotische boraat Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Expressie en zuivering van Nuclease-vrije zuurstof Scavenger Protocatechuate 3, 4-dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening om kristalhits te verkrijgen voor eiwitkristallografie

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...