Name: pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase
Uploaded: 2020-09-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

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1. Schnelles Protokoll zur Reinigung der α- und β-Untereinheit und des rekombinierten α2β2StTS-Komplexes
<ol><li>DNA subklonieren in pETSUMO-Expressionsvektor<ol><li>Erhalten Sie das translational koppelnde Gen (trpA und trpB), das für die α-und β-Untereinheitender Tryptophansynthase aus dem Bakterium Salmonella enterica serovar typhimurium kodiert, das im pEBA-10-Expressionsvektor22geklont ist. Verwenden Sie den pEBA-10-V...

<ol>
	<li>Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+multienzyme+complex+with+an+intramolecular+tunnel.">Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel.</a> Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).</li><li>Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+mine+for+enzymologists.">Tryptophan synthase: a mine for enzymologists.</a> Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).</li><li>Dunn, M. 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A comparison between the native complex and the reconstituted complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).</li><li>Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+proteolytic+derivative+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase.+Identification+of+the+site+of+cleavage+and+characterization+of+the+fragments.">An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.</a> Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).</li><li>Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. 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Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).</li><li>Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crystallography+of+a+true+substrate,+indole-3-glycerol+phosphate,+bound+to+a+mutant+(alphaD60N)+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+reveals+the+correct+orientation+of+active+site+alphaGlu49.">Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).</li><li>Weyand, M., Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+wild-type+tryptophan+synthase+complexed+with+the+natural+substrate+indole-3-glycerol+phosphate.">Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate.</a> Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).</li><li>Sachpatzidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+studies+of+phosphonate-based+alpha-reaction+transition-state+analogues+complexed+to+tryptophan+synthase.">Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).</li><li>Yang, L. 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Wir haben erfolgreich mutierte Form α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T und α2β2 βS377A StTS-Komplexe für Struktur-Funktions-Korrelationsstudien entwickelt. Zunächst haben wir versucht, die Mutanten mit einem früheren Reinigungsprotokoll22zu reinigen, das α2β2StTS-Komplexkristallisation mit PEG 8000 und Spermin während der Reinigung erfordert. Obwohl die Kristallisationsrate von der mutant...

Der Tryptophansynthase (TS) Bienzymkomplex (α2β2)ist ein allosterisches Enzym, das die letzten beiden Schritte in der Biosynthese der Aminosäure L-Tryptophan in Bakterien, Pflanzen und Pilzen katalysiert1,2,3. Das Bakterium Salmonella enterica serovar typhimurium (St) verursacht eine schwere Magen-Darm-Infektion bei Menschen und anderen Tieren. Da Menschen und höhere Tiere kein TS (EC 4.2.1.20) haben, wurde die Hemmung von S. typhimurium α2β2 TS-Komplex (α2β2StTS) als potenzielles Wirkstoffziel für die Behandlung von Kryptosporidiose und Tuberkulose4, Genital- und Augeninfektionen5und für den möglichen Herbizideinsatz in der Landwirtschaft6untersucht. Die α-Untereinheit katalysiert die aldolytische Spaltung von Indol-3-Glycerinphosphat (IGP) zu Glyceraldehyd-3-phosphat (GAP) und Indol, durch die Bildung eines Indolenin-Tautomer-Zwischen- und anschließenden Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungsspaltungsspaltung zur Herstellung von GAP und Indol3,6. Die β-katalytische Stelle enthält ein pyridoxalen 5′-Phosphat (PLP)-Cofaktormolekül, das über eine Schiff-Base an β-Lys87 gebunden ist, das im Verlauf der Reaktionen am Enzym β-Untereinheit3,7als Elektronensenke fungiert. Die β-Stelle katalysiert den Ersatz des L-Serin-Seitenkettenhydroxyls durch Indol, um L-Tryptophan und ein Wassermolekül in einer PLP-abhängigen Reaktion zu erhalten. St. TS dient als langjähriges Modell zur Untersuchung der Substratkanalisierung und allosterischen Kommunikation innerhalb von Multienzymkomplexen2,3. Die bidirektionale allosterische Kommunikation zwischen den α- und β-Untereinheiten von TS ist notwendig, um die katalytischen Schritte zu synchronisieren und die Indolfreisetzung während der L-Tryptophan-Synthese zu verhindern3. Um diese Bemühungen zu erweitern, haben wir mehrere Mutanten (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr und β-Ser377Ala) durch Einzelpunktmutation vorbereitet, die bei weiteren Untersuchungen der Beziehung zwischen Enzymstruktur, Mechanismus und Funktion an der katalytischen Stelle der St.TS-β-Untereinheit verwendet werden sollen.
Detaillierte Forschungen zum katalytischen Mechanismus von α2β2StTS wurden von der Forschungsgruppe von Edith W. Miles initiiert. Frühe Studien mit nativen Escherichia coli α2β2 TS-Komplex konzentrierten sich auf die Reinigung und Charakterisierung der isolierten α-Untereinheit8,9, isolierten β-Untereinheit10,11 und die Rekonstitution des α2β2 TS-Komplexes aus den isolierten Untereinheiten12. Die Reinigung erfolgte durch Ammoniumsulfatfällung, Probendialyse, DEAE-Sephadex-Chromatographie, Dialyse und eine zweite chromatographische Runde auf einer DEAE-Sephadex-Säule12. In einem anderen Protokoll wurde die Reinigung desselben Komplexes verbessert, indem das geklärte Zelllysat auf eine DEAE-Sephadex-Säule geladen wurde, gefolgt von einem chromatographischen Schritt auf einer Sepharose-4B-Säule, Ammoniumsulfatfällung und Dialyse13. Beide Reinigungsprotokolle dauern 4-5 Tage. Escherichia coli α2β2 TS Komplex kristallisiert, aber Kristalle waren zu dieser Zeit nicht für die Röntgenbeugung geeignet.
In einer neuartigen Studie wurden rekombinante und Wildtypformen von S. typhimurium α2β2 TS-Komplex gereinigt undkristallisiert 14,15. Der rekombinante α2β2StTS-Komplex wurde im E. coli-Stamm CB149 überexprimiert, der den pEBA-10-Expressionsvektor trug. Erste Kristallisations- und Röntgenbeugungsdatenerfassung und Analyse des α2β2StTS-Komplexes wurden berichtet14. Lange und dünne Nadeln wie α2β2StTS-Kristalle beeinträchtigten jedoch die Strukturstudien. In einem Versuch, bessere Röntgenbeugungsdaten zu sammeln, wurde ein anderes Reinigungsprotokoll beschrieben, um den Wildtyp und die mutierten Formen des α2β2StTS-Komplexes15zu reinigen. Die Reinigung erfolgte mit einer anfänglichen Ausfällung mit Spermin und PEG 8.000 in das geklärte Zelllysat und ein großer sperriger Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt. Die überstandige Fraktion, die hohe Mengen an α2β2StTS-Komplex enthielt, wurde 16-48 h bei 4 °C gelagert, bis gelbe Kristalle ausbrachen. Kristalle wurden gewaschen und ausgiebig gegen verschiedene Puffer dialysiert. Proteinkomplex wurde in Ammoniumsulfat enthaltenden Puffer rekristallisiert und dialysiert15. Obwohl die Proteinkristallisation von den Protein- und Fällungsmittelkonzentrationen in Lösung abhängt, ist es schwierig, die Reinigung für andere mutierte Formen des α2β2StTS-Komplexes in Lösung zu überwachen, vorherzusagen und zu reproduzieren. Dieses Protokoll hat den Vorteil, dass es keine chromatographischen Methoden verwendet; Die Nachteile sind jedoch die lange Reinigungszeit, die zum Kristallisieren, Dialysieren und Rekristallisieren erforderlich ist und typischerweise 5-7 Tage benötigt. Um Kristalle zu erhalten, die für die Röntgendatenerfassung geeignet sind, wurden mehr als 600 Kristallisationsbedingungen unter Verwendung einer Kombination und Variation von Proteinkonzentration, Temperatur, Fällungsmitteln (PEG 4.000, 6.000 und 8.000) und Additiven (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, Cadaverin, Putrescin, Spermin oder Spermidin)bewertet 15. Kristalle hatten eine bessere kristalline Form und wuchsen schneller unter Bedingungen, die 12% PEG 8.000 und 2 mM Spermin enthielten. Die Kristallisation war bei 25 °C günstiger als bei 4, 30 oder 42 °C und wuchs innerhalb von 3 Tagen auf maximale Abmessungenan 15. Mehrere α2β2StTS Kristallstrukturen wurden damals (1996-1999) berichtet16,17,18,19,20,21 und viele andere Strukturen wurden bis heute veröffentlicht.
Hier besteht der Hauptzweck darin, alternative Protokolle zur Reinigung der Tryptophansynthase und zur Optimierung der Proteinkristallisation vorzustellen. Die vorliegende Arbeit zeigt signifikante Verbesserungen zur Reinigung des Wildtyps isoliert α-Untereinheit (αStTS), isolierter β-Untereinheit (βStTS), rekonstituiert α2β2StTS-Komplexes aus den isolierten Untereinheiten, und Wildtyp- und Mutantenformen des α2β2StTS-Komplexes. Die Vorteile gegenüber früheren Protokollen sind beträchtlich, da die Reinigungszeit deutlich verkürzt und Kristallisation und Kryoprotektion optimiert wurden. Mutantenformen von α2β2StTS-Komplexes, die in dieser Arbeit entwickelt wurden, haben sich in der Nähe des gleichen Zustands kristallisiert, der für die Wildtypform verwendet wird. Eine Feinkristallisationsoptimierung war jedoch notwendig, um große Einkristalle von ausreichender Qualität für die Strukturbestimmung bei nahezu atomarer Auflösung zu erhalten. Bis heute sind in der Protein Data Bank (PDB) 134 Tryptophansynthase-Kristallstrukturen hinterlegt, die 101, 31 bzw. 2 Kristallstrukturen für Bakterien, Archaeen und Eukaryoten ausmachen. Schönerweise gehören 73 Strukturen zu S. enterica serovar typhimurium und 5 Kristallstrukturen des α2β2StTS-Komplexes haben Auflösungsgrenzen von mehr als 1,50 Angström. Es überrascht nicht, dass 4 von 5 in unserer Forschungsgruppe vorbereitet wurden (PDB IDs: 5CGQ bei 1,18 Å, 4HT3 bei 1,30 Å, 4HPJ bei 1,45 Å, 6DZ4 bei 1,45 Å Auflösung). Die raffinierten Kristallstrukturen der mutierten Form von α2β2StTS-Komplexes sollen neue Einblicke in den Mechanismus und die Rolle liefern, die essentielle Aminosäurereste bei der L-Tryptophan-Synthese spielen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL 10 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL 100 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430489</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-141</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cryschem Plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-158</td>
			<td>24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td>centrifuge conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB15 ACCUMET Basic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB15</td>
			<td>pH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td>Agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S35836</td>
			<td>incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2646100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 Digital Sonifier</td>
			<td>Brason</td>
			<td>B450</td>
			<td>Cell disruptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP210-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC213601000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1391</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>HF polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10-297-018</td>
			<td>dNTPs set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42">Excella E25R Orbital Shaker</td>
			<td>Eppendorf New Brunswick</td>
			<td>M1353-0004</td>
			<td>Orbital incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>8149-30-0004</td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210012</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0104S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-5255-01</td>
			<td>5 mL Histrap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelvinator Series-100</td>
			<td>Kelvinator</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Ultra low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Liquid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Solid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0193S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA affinity beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R90115</td>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-865-0</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxal phosphate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC228170010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-200 HR</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-000-196</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-5B centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1004</td>
			<td>Floor cetrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC132750010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-002-491</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>DNA liagse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubl-specific protease 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12588018</td>
			<td>SUMO Protease</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase

Strukturstudien mit Tryptophansynthase (TS) Bienzymkomplex (α2β2 TS) aus Salmonella typhimurium wurden durchgeführt, um seinen katalytischen Mechanismus, sein allosterisches Verhalten und Details der enzymatischen Umwandlung von Substrat in Ein produkt in PLP-abhängigen Enzymen besser zu verstehen. In dieser Arbeit ermöglichte ein neuartiges Expressionssystem zur Herstellung der isolierten α- und isolierten β-Untereinheit die Reinigung hoher Mengen reiner Untereinheiten und α2β2StTS-Komplexes aus den isolierten Untereinheiten innerhalb von 2 Tagen. Die Reinigung erfolgte durch Affinitätschromatographie, gefolgt von Spaltung des Affinitäts-Tags, Ammoniumsulfat-Fällung und Größenausschlusschromatographie (SEC). Um die Rolle von Schlüsselrückständen am Enzym β besser zu verstehen, wurde in früheren Strukturstudien eine ortsseitige Mutagenese durchgeführt. Ein weiteres Protokoll wurde erstellt, um den Wildtyp und die Mutanten α2β2StTS-Komplexen zu reinigen. Ein einfaches, schnelles und effizientes Protokoll mit Ammoniumsulfatfraktionierung und SEC ermöglichte die Reinigung von α2β 2StTS-Komplexes aneinemeinzigen Tag. Beide in dieser Arbeit beschriebenen Reinigungsprotokolle haben erhebliche Vorteile im Vergleich zu früheren Protokollen zur Reinigung desselben Komplexes mit PEG 8000 und Spermin, um den α2β2StTS-Komplex entlang des Reinigungsprotokolls zu kristallisieren. Die Kristallisation von Wildtyp- und einigen Mutiertenformen erfolgt unter leicht unterschiedlichen Bedingungen, was die Reinigung einiger Mutanten mit PEG 8000 und Spermin beeinträchtigt. Um Kristalle vorzubereiten, die für röntgenkristallographische Untersuchungen geeignet sind, wurden mehrere Anstrengungen unternommen, um Kristallisation, Kristallqualität und Kryoprotektion zuoptimieren. Die hier vorgestellten Methoden sollten allgemein zur Reinigung von Tryptophansynthase-Untereinheiten und Wildtyp- und Mutanten-α2β2StTS-Komplexen anwendbar sein.

Reinigung der α-und β-Untereinheiten der Tryptophan-Synthase Die α-Untereinheit(αStTS) und die β-Untereinheit (βStTS) der Salmonella typhimurium tryptophan synthase wurden im modifizierten pET SUMO-Vektor subkloniert. Abbildung 1A zeigt repräsentative SDS-PAGE-Ergebnisse von zwei starken Bändern, die dem Fusionsprotein His6-SUMO-αStT...

Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Dieser Artikel stellt eine Reihe von aufeinanderfolgenden Methoden zur Expression und Reinigung von Salmonella typhimurium tryptophan synthase vor, die dieses Protokoll zu einem schnellen System zur Reinigung des Proteinkomplexes an einem Tag machen. Abgedeckte Methoden sind ortsgerichtete Mutagenese, Proteinexpression in Escherichia coli,Affinitätschromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Kristallisation.

PCR-Mutagenese, Klonierung, Expression, schnelle Proteinreinigungsprotokolle und Kristallisation des Wildtyps und der mutierten Formen der Tryptophan-Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em&gt; S</em&gt; -Citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Forschung

Biochemie

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinante Protein Expression, Kristallisation und biophysikalische Studien von a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konservierte Nucleotid-Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Automatische Protokolle für makromolekulare Kristallisation am MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein-Extraktion, enzymatische Aktivität und Genexpression von Koffein-Synthase aus Anlage Zellsuspensionen

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...