Name: pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase
Uploaded: 2020-09-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (GM097569).

1. פרוטוקול מהיר לטיהור מתחם α β וה-α המחודש2β2StTS
<ol><li>החלפת דנ"א לווקטור הביטוי pETSUMO<ol><li>השג את הגן המצמד התרגומי (trpA ו- trpB) המקודד את α- ואת β-subunits של סינתאז טריפטופן מחיידק סלמונלה אנטטיקה ספירובה טיפימוריום משובט בווקטור הביטוי pEBA-1022. השתמש ...

<ol>
	<li>Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+multienzyme+complex+with+an+intramolecular+tunnel.">Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel.</a> Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).</li><li>Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+mine+for+enzymologists.">Tryptophan synthase: a mine for enzymologists.</a> Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).</li><li>Dunn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+substrate+channeling+and+catalysis+in+the+tryptophan+synthase+bienzyme+complex.">Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).</li><li>Chaudhary, K., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protozoan+genomics+for+drug+discovery.">Protozoan genomics for drug discovery.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).</li><li>Caldwell, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+in+Chlamydia+trachomatis+tryptophan+synthase+genes+differentiate+between+genital+and+ocular+isolates.">Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).</li><li>Kulik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+structural+basis+of+the+catalytic+mechanism+and+the+regulation+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium+and+BX1+from+maize,+two+evolutionarily+related+enzymes.">On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).</li><li>Barends, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanistic+implications+of+a+tryptophan+synthase+quinonoid+intermediate.">Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate.</a> Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).</li><li>Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+catalytic+properties+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase,+a+two-component+enzyme.">A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).</li><li>Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A+protein+of+the+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+Purification,+crystallization,+and+composition+studies.">The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).</li><li>Wilson, D. A., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+B+component+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase.">Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase.</a> Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).</li><li>Adachi, O., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+preparing+crystalline+beta+2+subunit+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli+in+high+yield.">A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).</li><li>Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystalline+alpha2+beta2+complexes+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+A+comparison+between+the+native+complex+and+the+reconstituted+complex.">Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).</li><li>Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+proteolytic+derivative+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase.+Identification+of+the+site+of+cleavage+and+characterization+of+the+fragments.">An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.</a> Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).</li><li>Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+crystallographic+data+of+the+tryptophan+synthase+alpha+2+beta+2+complex+from+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).</li><li>Miles, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+tryptophan+synthase.+Clarification+of+the+roles+of+histidine+86,+lysine+87,+arginine+148,+cysteine+170,+and+cysteine+230.">The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).</li><li>Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+K++or+Cs++for+Na++induces+local+and+long-range+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+the+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex.">Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex.</a> Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+mutant+(betaK87T)+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+with+ligands+bound+to+the+active+sites+of+the+alpha-+and+beta-subunits+reveal+ligand-induced+conformational+changes.">Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes.</a> Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).</li><li>Schneider, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop+closure+and+intersubunit+communication+in+tryptophan+synthase.">Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).</li><li>Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crystallography+of+a+true+substrate,+indole-3-glycerol+phosphate,+bound+to+a+mutant+(alphaD60N)+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+reveals+the+correct+orientation+of+active+site+alphaGlu49.">Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).</li><li>Weyand, M., Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+wild-type+tryptophan+synthase+complexed+with+the+natural+substrate+indole-3-glycerol+phosphate.">Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate.</a> Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).</li><li>Sachpatzidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+studies+of+phosphonate-based+alpha-reaction+transition-state+analogues+complexed+to+tryptophan+synthase.">Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).</li><li>Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+mutagenesis+and+overexpression+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium:+On+the+roles+of+beta+(2)+subunit+Lys-382.">PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382.</a> Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Lowry, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Measurement+with+the+Folin+Phenol+Reagent.">Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent.</a> Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+mutagenesis+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium.+Changing+arginine+179+to+leucine+alters+the+reciprocal+transmission+of+substrate-induced+conformational+changes+between+the+alpha+and+beta+2+subunits.">Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).</li><li>Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iMOSFLM:+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM.">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, 271-281 (2011).</li><li>Evans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+and+Assessment+of+Data+Quality.">Scaling and Assessment of Data Quality.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 72-82 (2006).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).</li><li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+replacement+with+MOLREP.">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 22-25 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 213-221 (2010).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 486-501 (2010).</li><li>Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+macromolecular+structures+by+the+maximum-likelihood+method.">Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, 240-255 (1997).</li><li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine.">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, 352-367 (2012).</li><li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+content+of+protein+crystals.">Solvent content of protein crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</li><li>Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coefficient+probabilities:+Improved+estimates+for+unit+cell+contents+of+proteins,+DNA,+and+protein-nucleic+acid+complex+crystals.">coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals.</a> Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).</li></ol>

תכננו בהצלחה צורת מוטציה α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T, ו- α2β2 מתחמי βS377A StTS למחקרי מתאם פונקציית מבנה. בתחילה, ניסינו לטהר את המוטציות באמצעות פרוטוקולטיהור קודם 22, אשר דורש α2β2סנטTS התגבשות מורכבת עם PEG 8000 וזרע במהלך הטיהור. למרות ש?...

קומפלקס הדו-אנזים (TS) (α2β2)הוא אנזים אלוסטרית, המזרז את שני השלבים האחרונים בביוסינתזה של חומצת האמינו L-טריפטופן בחיידקים, צמחים ופטריות1,2,3. חיידק סלמונלה אנטטיקה שרף שרף ( St) גורם לזיהום חמור במערכת העיכול בבני אדם ובבעלי חיים אחרים. מאז בני אדם ובעלי חיים גבוהים אין TS (EC 4.2.1.20), עיכוב של S. טיפוס α2β2 תסביך TS (α2β2StTS) נחקר כיעד תרופה פוטנציאלי לטיפול cryptosporidiosis ושחפת4, זיהומים באברי המין והעיקולים5, ועל ניצול פוטנציאלי של קוטלי עשבים בחקלאות6. α-subunit מזרז את המחשוף האלדוליטי של אינדול-3-גלייצרול-פוספט (IGP) כדי הגליצרלדהיד-3-פוספט (GAP) והאינדול, באמצעות היווצרות של טאוטומר אינדולנין ביניים ולאחר מכן מחשוף קשר פחמן-פחמן כדי לייצר GAP ו indole3,6. האתר β-קטליטי מכיל מולקולת קופקטור פירידוקסלית 5′-פוספט (PLP) הקשורה β-Lys87 דרך בסיס שיף, המתפקד ככיור אלקטרונים במהלך התגובות באנזים β-subunit3,7. האתר β מזרז את החלפת ההידרוקסיל בצד L-Serine על ידי אינדול כדי לתת L-טריפטופן ומולקולת מים בתגובה תלויה PLP. סנט TS משמש מודל ארוך שנים לחקירת תקשור מצע ותקשורת אלוסטרה בתוך מתחמים מרובי אנזימים2,3. תקשורת אלוסטרית דו-כיוונית בין α ואיחודי המשנה β של TS נחוצה כדי לסנכרן את השלבים הקטליטיים ולמנוע שחרור אינודול במהלך סינתזה L-טריפטופן3. כדי להאריך את המאמץ הזה, הכנו מספר מוטציות (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr, ו- β-Ser377Ala) על ידי מוטציה של נקודה אחת שישמשו לחקר נוסף של הקשר בין מבנה האנזים, המנגנון והתפקוד באתר הקטליטי של stTS β-subunit.
מחקר מפורט על המנגנון הקטליטי של α2β2סנטTS יזם על ידי קבוצת המחקר של אדית וו מיילס. מחקרים מוקדמים עם ילידי Escherichia coli α2β2 TS מורכבים התמקדו בטיהור ואפיון של α-subunit מבודד8,9, מבודד β-subunit10,11 ואת השבת α2β2 מתחם TS מן subunits מבודד12. הטיהור בוצע על ידי משקעים אמוניום גופרתי, דיאליזה לדוגמה, כרומטוגרפיה DEAE-Sephadex, דיאליזה, וסיבוב כרומטוגרפי שני על טור DEAE-Sephadex12. בפרוטוקול אחר, הטיהור של אותו קומפלקס שופר על ידי טעינת lysate התא המובהר על עמוד DEAE-Sephadex ואחריו צעד כרומטוגרפי על עמוד Sepharose 4B, משקעים אמוניום גופרתי ודיאליזה13. שני פרוטוקולי הטיהור נמשכים 4-5 ימים. Escherichia coli α2β2 TS מורכב מגובש אבל גבישים לא היו מתאימים עקיפה רנטגן באותו זמן.
במחקר חדשני, צורות רקומביננטיות ופראיות של S. typhimurium α2β2 תסביך TS טוהרו וגובשו14,15. מתחם ה-CB149 של α רקומביננטי2β 2StTS הובע יתר עלהמידהבזן E. coli CB149 הנושא את וקטור הביטוי pEBA-10. התגבשות ראשונית ואיסוף וניתוח נתוני עקיפה של קרני רנטגן של מתחם α2β2StTS דווחו14. עם זאת, מחט ארוכה ודקה כמו α2β2גבישיסנטTS לקוי מחקרים מבניים. בניסיון לאסוף נתוני עקיפה טובים יותר של קרני רנטגן, תואר פרוטוקול טיהור נוסף כדי לטהר את הסוג הפראי ואת צורות המוטציה של α2β2StTSמתחם 15. הטיהור בוצע עם משקעים ראשוניים באמצעות זרע ו PEG 8,000 לתוך ליסאט התא המובהק ומצרף גדול מגושם הוסר על ידי צנטריפוגה. השבר העל-טבעי המכיל כמויות גבוהות של α2β2StTS מתחם אוחסנו במשך 16-48 שעות ב 4 °C (70 °F) עד גבישים צהובים מזורם. גבישים נשטפו ודיאליגו בהרחבה כנגד מאגרים שונים. קומפלקס החלבון היה recrystallized במאגר המכיל אמוניום גופרתי וחיוג15. אמנם, התגבשות חלבון תלויה בחלבון ובריכוזים מזרזים בתמיסה, קשה לפקח, לחזות ולהתרבות טיהור לצורות מוטנטיות אחרות של α2β2StTS תסביך. לפרוטוקול זה יש יתרון בכך שהוא אינו משתמש בשיטות כרומטוגרפיות כלשהן; עם זאת, החסרונות הם זמן הטיהור הארוך הדרוש כדי להתגבש, לחייג ולבטל, הדורש בדרך כלל 5-7 ימים. כדי להשיג גבישים המתאימים לאיסוף נתוני רנטגן, יותר מ -600 תנאי התגבשות הוערכו באמצעות שילוב וריאציה של ריכוז חלבון, טמפרטורה, משקעים (PEG 4,000, 6,000, ו 8,000), ותוספים (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, cadaverine, putrescine, זרע, או זרע)15. גבישים היו בצורת גבישית טובה יותר וגדלו מהר יותר בתנאים המכילים 12% PEG 8,000 ו 2 mM זרעון. ההתגבשות הייתה חיובית יותר ב 25 °C (75 °F) ולא ב 4, 30, או 42 °C (5 °F) גדל לממדים מקסימליים בתוך 3 ימים15. כמה α2βשנימבני גבישסנטTS דווחו באותה תקופה (1996-1999)16,17,18,19,20,21 ומבנים רבים אחרים פורסמו עד כה.
כאן, המטרה העיקרית היא להציג פרוטוקולים חלופיים כדי לטהר סינתאז טריפטופן ולמטב את התגבשות חלבון. העבודה הנוכחית מציגה שיפורים משמעותיים כדי לטהר את סוג הפרא מבודד α-subunit (αStTS), מבודד β-subunit (βStTS), מחדש α2β2סנטTS המתחם מן subunits מבודד, וסוג פראי וצורות מוטציה של α2β2מתחם סנטTS. היתרונות על פני פרוטוקולים קודמים ניכרים שכן זמן הטיהור צומצם באופן משמעותי והתגבשות והגנה קריו-הגנתית היו מותאמים. צורות מוטנטיות של α2β2 מתחםסנטTS מהונדס בעבודה זו התגבשו ליד אותו מצב המשמש עבור צורת סוג הבר. עם זאת, אופטימיזציה התגבשות בסדר היה צורך להשיג גבישים יחיד גדול באיכות מספקת לקביעת מבנה ברזולוציה אטומית קרובה. עד כה, ישנם 134 מבני קריסטל סינתאז טריפטופן שהופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB), חשבונאות 101, 31 ו -2 מבני קריסטל, בהתאמה, עבור חיידקים, ארכאי ואאוקריוטה. יפה, 73 מבנים שייכים S. enterica serovar typhimurium ו 5 מבני קריסטל של α2β2סנטTS מתחם יש מגבלות רזולוציה גבוהות יותר מ 1.50 אנגסטרום. באופן לא מפתיע, 4 מתוך 5 הוכנו בקבוצת המחקר שלנו (מזהי PDB:5CGQ ב 1.18 Å, 4HT3 ב 1.30 Å, 4HPJ ב 1.45 Å, 6DZ4 ברזולוציה 1.45 Å). מבני הגביש המעודנים של צורה מוטנטית של α2β2StTS קומפלקס צפויים לספק תובנות חדשות על המנגנון והתפקידים שיחקו שאריות חומצת אמינו חיונית המעורבים בסינתזה L-טריפטופן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL 10 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL 100 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430489</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-141</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cryschem Plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-158</td>
			<td>24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td>centrifuge conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB15 ACCUMET Basic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB15</td>
			<td>pH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td>Agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S35836</td>
			<td>incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2646100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 Digital Sonifier</td>
			<td>Brason</td>
			<td>B450</td>
			<td>Cell disruptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP210-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC213601000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1391</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>HF polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10-297-018</td>
			<td>dNTPs set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42">Excella E25R Orbital Shaker</td>
			<td>Eppendorf New Brunswick</td>
			<td>M1353-0004</td>
			<td>Orbital incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>8149-30-0004</td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210012</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0104S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-5255-01</td>
			<td>5 mL Histrap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelvinator Series-100</td>
			<td>Kelvinator</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Ultra low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Liquid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Solid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0193S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA affinity beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R90115</td>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-865-0</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxal phosphate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC228170010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-200 HR</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-000-196</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-5B centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1004</td>
			<td>Floor cetrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC132750010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-002-491</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>DNA liagse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubl-specific protease 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12588018</td>
			<td>SUMO Protease</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase

מחקרים מבניים עם קומפלקס ביאנזים טריפטופן (TS) (α2β 2 TS) מ טיפוס סלמונלה בוצעו כדי להבין טוב יותר את המנגנון הקטליטי שלה, התנהגות אלוסטרית, ופרטים על הטרנספורמציה אנזימטית של מצע למוצר באנזימים תלויי PLP. בעבודה זו, מערכת ביטוי חדשנית לייצור α המבודדת והמבודדת β-subunit אפשרה טיהור של כמויות גבוהות של תת-קהילות טהורות ו-α2β2מתחם סנטTS ממתחם התת-קרקעי המבודד תוך יומיים. הטיהור בוצע על ידי כרומטוגרפיה של זיקה ואחריו מחשוף של תג הזיקה, משקעים אמוניום גופרתי, כרומטוגרפיה אי הכללת גודל (SEC). כדי להבין טוב יותר את התפקיד של שאריות מפתח באנזים β-אתר, מוטגנזה ישירה באתר בוצעה במחקרים מבניים קודמים. פרוטוקול נוסף נוצר כדי לטהר את הסוג הפראי ואת המוטציה α2β2מתחמי סנטTS. פרוטוקול פשוט, מהיר ויעיל באמצעות שבר אמוניום גופרתי ו- SEC אפשרטיהורשל מתחם α 2 β2StTS ביום אחד. שני פרוטוקולי הטיהור המתוארים בעבודה זו יש יתרונות ניכרים בהשוואה לפרוטוקולים קודמים כדי לטהר את אותו קומפלקס באמצעות PEG 8000 ו spermine כדי לגבש את α2β2StTS מורכב לאורך פרוטוקול הטיהור. התגבשות של סוג פראי וכמה צורות מוטנטיות מתרחשת בתנאים שונים במקצת, ופוגעת בטיהור של כמה מוטציות באמצעות PEG 8000 וזרעון. כדי להכין גבישים המתאימים למחקרי קריסטלוגרפיה רנטגן נעשו מספר מאמצים כדי לייעל התגבשות, איכות קריסטל ו cryoprotection. השיטות המוצגות כאן צריכות להיות ישימות בדרך כלל לטיהור של תת-units טריפטופן סינתאז וסוג פראי ומוטנטים α2β2מתחמיסנטTS.

טיהור α- ואיחודי המשנה βשלסינתאז טריפטופן α-subunit (αstTS) ואת β-subunit (βStTS) של סלמונלה טיפוס טריפטופן סינתאז היו subcloned בווקטור PET SUMO שונה. איור 1A מציג תוצאות מייצגות של SDS-PAGE של שתי רצועות חזקות המתאימות ?...

Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

מאמר זה מציג סדרה של שיטות רצופות לביטוי וטיהור של סלמונלה טיפוס סינתאז comp פרוטוקול זה מערכת מהירה כדי לטהר את קומפלקס החלבון ביום. שיטות מכוסות הן מוטאגנסיס מכוונת אתר, ביטוי חלבון ב Escherichia coli, כרומטוגרפיה זיקה, כרומטוגרפיה סינון ג'ל, והתגבשות.

PCR מוטגנסיס, שיבוט, ביטוי, פרוטוקולי טיהור חלבונים מהירים והתגבשות של סוג הבר וצורות מוטציה של טריפטופן סינתאז

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

ביטוי חלבון רקומביננטי, התגבשות, מחקרים ביופיסיקליים של א<em&gt; Bacillus</em&gt; -שמר Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

אוטומטית פרוטוקולים עבור התגבשות Macromolecular במעבדה MRC של הביולוגיה המולקולרית

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

מיצוי קפאין, פעילות אנזימטיות, ביטוי גנים של קפאין סינתאז מ המתלים תא צמח

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...