Name: pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase
Uploaded: 2020-09-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health degli Stati Uniti (GM097569).

1. Protocollo veloce per purificare la subunità α e β e il complesso TS α2β2Stricombinato
<ol><li>Subclonazione del DNA nel vettore di espressione pETSUMO<ol><li>Ottenere il gene di accoppiamento traslazionale (trpA e trpB) che codifica per le subunità α- e β- del triptofano sintasi dal batterio Salmonella enterica sierovar typhimurium clonato nel vettore di espressione pEBA-1022. Usa il vettore pEBA-10 come modello di DN...

<ol>
	<li>Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+multienzyme+complex+with+an+intramolecular+tunnel.">Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel.</a> Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).</li><li>Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+mine+for+enzymologists.">Tryptophan synthase: a mine for enzymologists.</a> Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).</li><li>Dunn, M. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanistic+implications+of+a+tryptophan+synthase+quinonoid+intermediate.">Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate.</a> Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).</li><li>Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+catalytic+properties+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase,+a+two-component+enzyme.">A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).</li><li>Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. 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A comparison between the native complex and the reconstituted complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).</li><li>Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+proteolytic+derivative+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase.+Identification+of+the+site+of+cleavage+and+characterization+of+the+fragments.">An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.</a> Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).</li><li>Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+crystallographic+data+of+the+tryptophan+synthase+alpha+2+beta+2+complex+from+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).</li><li>Miles, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+tryptophan+synthase.+Clarification+of+the+roles+of+histidine+86,+lysine+87,+arginine+148,+cysteine+170,+and+cysteine+230.">The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).</li><li>Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop+closure+and+intersubunit+communication+in+tryptophan+synthase.">Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).</li><li>Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crystallography+of+a+true+substrate,+indole-3-glycerol+phosphate,+bound+to+a+mutant+(alphaD60N)+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+reveals+the+correct+orientation+of+active+site+alphaGlu49.">Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).</li><li>Weyand, M., Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+wild-type+tryptophan+synthase+complexed+with+the+natural+substrate+indole-3-glycerol+phosphate.">Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate.</a> Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).</li><li>Sachpatzidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+studies+of+phosphonate-based+alpha-reaction+transition-state+analogues+complexed+to+tryptophan+synthase.">Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).</li><li>Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+mutagenesis+and+overexpression+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium:+On+the+roles+of+beta+(2)+subunit+Lys-382.">PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382.</a> Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Lowry, O. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).</li><li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+replacement+with+MOLREP.">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 22-25 (2010).</li><li>Adams, P. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+content+of+protein+crystals.">Solvent content of protein crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</li><li>Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coefficient+probabilities:+Improved+estimates+for+unit+cell+contents+of+proteins,+DNA,+and+protein-nucleic+acid+complex+crystals.">coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals.</a> Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).</li></ol>

Abbiamo progettato con successo forme mutanti α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T e complessi α2β2 βS377A StTS per studi di correlazione struttura-funzione. Inizialmente, abbiamo cercato di purificare i mutanti utilizzando un precedente protocollo di purificazione22, che richiede α2β2StTS complesso cristallizzazione con PEG 8000 e spermina durante la purificazione. Sebbene il tasso di cristall...

Il complesso bienzimatico della triptofano sintasi (TS) (α2β2)è un enzima allosterico, catalizzando gli ultimi due passaggi nella biosintesi dell'amminoacido L-triptofano in batteri, piante e funghi1,2,3. Bacterium Salmonella enterica serovar typhimurium (St) provoca una grave infezione gastrointestinale nell'uomo e in altri animali. Poiché gli esseri umani e gli animali superiori non hanno TS (EC 4.2.1.20), l'inibizione del complesso S. typhimurium α2β2 TS (α2β2StTS) è stata esplorata come potenziale bersaglio farmacologico per il trattamento della criptosporidiosi e della tubercolosi4, genitali e infezioni oculari5e per il potenziale utilizzo di erbicidi in agricoltura6. La α-subunità catalizza la scissione aldolitica dell'indolo-3-glicerolo-fosfato (IGP) a gliceraldeide-3-fosfato (GAP) e indolo, attraverso la formazione di un intermedio tautomero indolenino e successivamente scissione del legame carbonio-carbonio per produrre GAP e indolo3,6. Il sito β-catalitico contiene una molecola cofattore piridossiale 5′-fosfato (PLP) legata a β-Lys87 tramite una base di Schiff, che funziona come un dissipatore di elettroni nel corso delle reazioni all'enzima β-subunità3,7. Il sito β catalizza la sostituzione dell'idrossile della catena laterale L-Serina con l'indolo per dare L-triptofano e una molecola d'acqua in una reazione PLP-dipendente. St TS funge da modello di lunga data per lo studio della canalizzazione del substrato e della comunicazione allosterica all'interno di complessi multienzimatici2,3. La comunicazione allosterica bidirezionale tra le subunità α e β di TS è necessaria per sincronizzare le fasi catalitiche e prevenire il rilascio di indolo durante la sintesi di L-triptofano3. Per estendere questo sforzo, abbiamo preparato diversi mutanti (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr e β-Ser377Ala) per mutazione a punto singolo da utilizzare in ulteriori esplorazioni della relazione tra struttura enzimatica, meccanismo e funzione nel sito catalitico della subunità β StTS.
Una ricerca dettagliata sul meccanismo catalitico di α2β2StTS è stata avviata dal gruppo di ricerca di Edith W. Miles. I primi studi con il complesso nativo di Escherichia coli α2β2 TS si sono concentrati sulla purificazione e caratterizzazione della α-subunitàisolata 8,9,isolata β-subunità10,11 e sulla ricostituzione del complesso TS α 2β2 dalle subunitàisolate 12. La purificazione è stata effettuata mediante precipitazione del solfato di ammonio, dialisi del campione, cromatografia DEAE-Sephadex, dialisi e un secondo round cromatografico su una colonna DEAE-Sephadex12. In un altro protocollo, la purificazione dello stesso complesso è stata migliorata caricando il lisato cellulare chiarificato su una colonna DEAE-Sephadex seguita da una fase cromatografica su una colonna Sepharose 4B, precipitazione del solfato di ammonio e dialisi13. Entrambi i protocolli di purificazione durano 4-5 giorni. Escherichia coli αcomplesso TS 2β2 cristallizzato, ma i cristalli non erano adatti per la diffrazione a raggi X in quel momento.
In un nuovo studio, le forme ricombinanti e selvatiche di S. typhimurium α2β2 TS complesso sono state purificate e cristallizzate14,15. Il complesso α2β2StTS ricombinante è stato sovraespresso nel ceppo CB149 di E. coli che trasporta il vettore di espressione pEBA-10. Sono stati riportati dati iniziali di cristallizzazione e diffrazione a raggi X e analisi del complesso α2β2StTS14. Tuttavia, l'ago lungo e sottile come α2β2StTS cristalli ha compromesso gli studi strutturali. Nel tentativo di raccogliere migliori dati di diffrazione a raggi X, è stato descritto un altro protocollo di purificazione per purificare il tipo selvatico e le forme mutanti del complesso α2β2StTS15. La purificazione è stata effettuata con una precipitazione iniziale utilizzando spermina e PEG 8.000 nel lisato cellulare chiarificato e un grande precipitato voluminoso è stato rimosso mediante centrifugazione. La frazione surnatante contenente elevate quantità di α2β2StTS è stata conservata per 16-48 ore a 4 °C fino a quando i cristalli gialli non sono precipitati. I cristalli sono stati lavati e ampiamente dializzati contro diversi buffer. Il complesso proteico è stato ricristallizzato in tampone contenente solfato di ammonio e dializzato15. Sebbene la cristallizzazione delle proteine dipenda dalle concentrazioni di proteine e precipitanti in soluzione, è difficile monitorare, prevedere e riprodurre la purificazione per altre forme mutanti di αcomplesso TS 2β2Stin soluzione. Questo protocollo ha il vantaggio di non utilizzare alcun metodo cromatografico; tuttavia, gli svantaggi sono il lungo tempo di purificazione necessario per cristallizzare, dializzare e ricristallizzare, in genere richiedendo 5-7 giorni. Per ottenere cristalli adatti alla raccolta di dati a raggi X, sono state valutate più di 600 condizioni di cristallizzazione utilizzando una combinazione e variazione di concentrazione proteica, temperatura, precipitanti (PEG 4.000, 6.000 e 8.000) e additivi (CaCl2,MnCl2,ZnCl 2,cadaverina, putrescina, spermina o spermidina)15. I cristalli avevano una forma cristallina migliore e crescevano più velocemente in condizioni contenenti il 12% di PEG 8.000 e 2 mM di spermina. La cristallizzazione era più favorevole a 25 °C piuttosto che a 4, 30 o 42 °C e cresceva fino alle dimensioni massime entro 3 giornie 15. Diverse strutture cristalline α2β2StTS sono state segnalate in quel momento (1996-1999)16,17,18,19,20,21 e molte altre strutture sono state pubblicate fino ad oggi.
Qui, lo scopo principale è quello di presentare protocolli alternativi per purificare la triptofano sintasi e ottimizzare la cristallizzazione delle proteine. Il presente lavoro mostra miglioramenti significativi per purificare la subunità α isolata di tipo selvatico (αStTS), la subunità β isolata (βStTS), ricostituita α complessoTS 2β2Stdalle subunità isolate e forme wild type e mutanti del complesso α2β2StTS. I vantaggi rispetto ai protocolli passati sono considerevoli poiché il tempo di purificazione è stato ridotto in modo significativo e la cristallizzazione e la crioprotezione sono state ottimizzate. Le forme mutanti del complesso α 2 β2StTS progettate in questo lavoro si sono cristallizzate vicino allastessacondizione utilizzata per la forma wild type. Tuttavia, l'ottimizzazione della cristallizzazione fine era necessaria per ottenere grandi cristalli singoli di qualità sufficiente per la determinazione della struttura a risoluzione quasi atomica. Ad oggi, ci sono 134 strutture cristalline di triptofano sintasi depositate nella Protein Data Bank (PDB), che rappresentano rispettivamente 101, 31 e 2 strutture cristalline per batteri, archaea ed eucarioti. Piacevolmente, 73 strutture appartengono a S. enterica serovar typhimurium e 5 strutture cristalline del complesso α2β2StTS hanno limiti di risoluzione superiori a 1,50 Angstrom. Non sorprende che 4 su 5 siano stati preparati nel nostro gruppo di ricerca (PDB IDs: 5CGQ a 1,18 Å, 4HT3 a 1,30 Å, 4HPJ a 1,45 Å, 6DZ4 a 1,45 Å risoluzione). Si prevede che le raffinate strutture cristalline della forma mutante del complesso α 2β2StTS forniranno nuove informazioni sul meccanismo e sui ruoli svolti dai residui di aminoacidi essenziali coinvolti nella sintesi di L-triptofano.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL 10 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL 100 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430489</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-141</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cryschem Plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-158</td>
			<td>24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td>centrifuge conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB15 ACCUMET Basic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB15</td>
			<td>pH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td>Agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S35836</td>
			<td>incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2646100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 Digital Sonifier</td>
			<td>Brason</td>
			<td>B450</td>
			<td>Cell disruptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP210-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC213601000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1391</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>HF polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10-297-018</td>
			<td>dNTPs set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42">Excella E25R Orbital Shaker</td>
			<td>Eppendorf New Brunswick</td>
			<td>M1353-0004</td>
			<td>Orbital incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>8149-30-0004</td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210012</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0104S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-5255-01</td>
			<td>5 mL Histrap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelvinator Series-100</td>
			<td>Kelvinator</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Ultra low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Liquid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Solid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0193S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA affinity beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R90115</td>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-865-0</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxal phosphate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC228170010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-200 HR</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-000-196</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-5B centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1004</td>
			<td>Floor cetrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC132750010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-002-491</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>DNA liagse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubl-specific protease 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12588018</td>
			<td>SUMO Protease</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase

Sono stati condotti studi strutturali con il complesso bienzimatico triptofano sintasi (TS) (α2β2 TS) da Salmonella typhimurium per comprendere meglio il suo meccanismo catalitico, il comportamento allosterico e i dettagli della trasformazione enzimatica del substrato in prodotto in enzimi PLP-dipendenti. In questo lavoro, un nuovo sistema di espressione per produrre la subunità β isolata α e isolata ha permesso la purificazione di elevate quantità di subunità pure e α complessoTS 2β2Stdalle subunità isolate entro 2 giorni. La purificazione è stata effettuata mediante cromatografia di affinità seguita da scissione del tag di affinità, precipitazione del solfato di ammonio e cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). Per comprendere meglio il ruolo dei residui chiave nell'enzima β-sito, la mutagenesi diretta del sito è stata eseguita in precedenti studi strutturali. Un altro protocollo è stato creato per purificare il tipo selvatico e i complessi mutanti α2β2StTS. Un protocollo semplice, veloce ed efficiente che utilizza il frazionamento del solfato di ammonio e SEC ha permesso la purificazione di α2β2StTS complesso in un solo giorno. Entrambi i protocolli di purificazione descritti in questo lavoro hanno notevoli vantaggi rispetto ai protocolli precedenti per purificare lo stesso complesso utilizzando PEG 8000 e spermina per cristallizzare il complesso α2β2StTS lungo il protocollo di purificazione. La cristallizzazione del tipo selvatico e di alcune forme mutanti avviene in condizioni leggermente diverse, compromettendo la purificazione di alcuni mutanti utilizzando PEG 8000 e spermina. Per preparare cristalli adatti agli studi cristallografici a raggi X sono stati fatti diversi sforzi per ottimizzare la cristallizzazione, la qualità dei cristalli e la crioprotezione. I metodi qui presentati dovrebbero essere generalmente applicabili per la purificazione delle subunità della triptofano sintasi e dei complessi wild type e mutanti α2β2StTS.

Purificazione delle subunità α-e β-del triptofano sintasi La α-subunità (αStTS) e la β-subunità (βStTS) della Salmonella typhimurium triptofano sintasi sono state subclonate nel vettore PET SUMO modificato. La Figura 1A mostra i risultati rappresentativi SDS-PAGE di due bande forti corrispondenti alla proteina di fusione His6-SUMO-αSt</em...

Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Questo articolo presenta una serie di metodi consecutivi per l'espressione e la purificazione della Salmonella typhimurium triptofano sintasi compo questo protocollo un sistema rapido per purificare il complesso proteico in un giorno. I metodi trattati sono la mutagenesi diretta al sito, l'espressione proteica in Escherichia coli,la cromatografia di affinità, la cromatografia di filtrazione su gel e la cristallizzazione.

Mutagenesi PCR, clonazione, espressione, protocolli di purificazione rapida delle proteine e cristallizzazione del tipo selvatico e delle forme mutanti di triptofano sintasi

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

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