Name: pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase
Uploaded: 2020-09-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

この研究は、米国国立衛生研究所(GM097569)によって支援されました。

1. αおよびβサブユニットと再結合されたα 2βStTS 複合体を浄化するための高速プロトコル
<ol><li>pETSUMO発現ベクターにサブクローニングするDNA<ol><li>pEBA-10発現ベクター22にクローン化されたサルモネラ・腸膜腸筋腸球菌からトリプトファンシンターゼのα−およびβ-サブユニットをコードする翻訳結合遺伝子(trpAおよびtrpB)を?...

<ol>
	<li>Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+multienzyme+complex+with+an+intramolecular+tunnel.">Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel.</a> Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).</li><li>Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+mine+for+enzymologists.">Tryptophan synthase: a mine for enzymologists.</a> Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).</li><li>Dunn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+substrate+channeling+and+catalysis+in+the+tryptophan+synthase+bienzyme+complex.">Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).</li><li>Chaudhary, K., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protozoan+genomics+for+drug+discovery.">Protozoan genomics for drug discovery.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).</li><li>Caldwell, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+in+Chlamydia+trachomatis+tryptophan+synthase+genes+differentiate+between+genital+and+ocular+isolates.">Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).</li><li>Kulik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+structural+basis+of+the+catalytic+mechanism+and+the+regulation+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium+and+BX1+from+maize,+two+evolutionarily+related+enzymes.">On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).</li><li>Barends, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanistic+implications+of+a+tryptophan+synthase+quinonoid+intermediate.">Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate.</a> Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).</li><li>Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+catalytic+properties+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase,+a+two-component+enzyme.">A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).</li><li>Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A+protein+of+the+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+Purification,+crystallization,+and+composition+studies.">The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).</li><li>Wilson, D. A., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+B+component+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase.">Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase.</a> Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).</li><li>Adachi, O., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+preparing+crystalline+beta+2+subunit+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli+in+high+yield.">A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).</li><li>Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystalline+alpha2+beta2+complexes+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+A+comparison+between+the+native+complex+and+the+reconstituted+complex.">Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).</li><li>Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+proteolytic+derivative+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase.+Identification+of+the+site+of+cleavage+and+characterization+of+the+fragments.">An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.</a> Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).</li><li>Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+crystallographic+data+of+the+tryptophan+synthase+alpha+2+beta+2+complex+from+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).</li><li>Miles, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+tryptophan+synthase.+Clarification+of+the+roles+of+histidine+86,+lysine+87,+arginine+148,+cysteine+170,+and+cysteine+230.">The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).</li><li>Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+K++or+Cs++for+Na++induces+local+and+long-range+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+the+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex.">Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex.</a> Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+mutant+(betaK87T)+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+with+ligands+bound+to+the+active+sites+of+the+alpha-+and+beta-subunits+reveal+ligand-induced+conformational+changes.">Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes.</a> Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).</li><li>Schneider, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop+closure+and+intersubunit+communication+in+tryptophan+synthase.">Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).</li><li>Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crystallography+of+a+true+substrate,+indole-3-glycerol+phosphate,+bound+to+a+mutant+(alphaD60N)+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+reveals+the+correct+orientation+of+active+site+alphaGlu49.">Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).</li><li>Weyand, M., Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+wild-type+tryptophan+synthase+complexed+with+the+natural+substrate+indole-3-glycerol+phosphate.">Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate.</a> Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).</li><li>Sachpatzidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+studies+of+phosphonate-based+alpha-reaction+transition-state+analogues+complexed+to+tryptophan+synthase.">Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).</li><li>Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+mutagenesis+and+overexpression+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium:+On+the+roles+of+beta+(2)+subunit+Lys-382.">PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382.</a> Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Lowry, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Measurement+with+the+Folin+Phenol+Reagent.">Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent.</a> Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+mutagenesis+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium.+Changing+arginine+179+to+leucine+alters+the+reciprocal+transmission+of+substrate-induced+conformational+changes+between+the+alpha+and+beta+2+subunits.">Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).</li><li>Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iMOSFLM:+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM.">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, 271-281 (2011).</li><li>Evans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+and+Assessment+of+Data+Quality.">Scaling and Assessment of Data Quality.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 72-82 (2006).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).</li><li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+replacement+with+MOLREP.">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 22-25 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 213-221 (2010).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 486-501 (2010).</li><li>Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+macromolecular+structures+by+the+maximum-likelihood+method.">Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, 240-255 (1997).</li><li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine.">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, 352-367 (2012).</li><li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+content+of+protein+crystals.">Solvent content of protein crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</li><li>Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coefficient+probabilities:+Improved+estimates+for+unit+cell+contents+of+proteins,+DNA,+and+protein-nucleic+acid+complex+crystals.">coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals.</a> Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).</li></ol>

2 β 2 βの変異型α、α 2 β 2βK167T、α 2 β 2βS377A StTS複合体の構造機能相関研究に成功しました。 当初、我々は、精製中にPEG8000とスペルミンでα 2 β 2StTS複合体結晶化を必要とする以前の精製プロトコル22を用いて変異体を精製しようと試みた。結晶化速度は、変異体の形態および溶液中の複合体の?...

トリプトファン合成酵素(TS)バイ酵素複合体(α 2 β 2)は、アクロステリック酵素であり、細菌、植物、および真菌1、2、3におけるアミノ酸L-トリプトファンの生合成における最後の2つのステップを触媒する。サルモネラ菌腸管腸炎セロバル腸管(St)は、ヒトおよび他の動物において重篤な胃腸感染症を引き起こす。ヒトおよび高等動物はTS(EC 4.2.1.20)を有しないため、S.チフィムリウムα 2 β 2 TS複合体(α 2 β 2StTS)の阻害は、クリプトスポリジウム症および結核4、生殖器および眼感染症5の治療のための潜在的な薬物標的として探求されてきた。 αサブユニットは、インドール-3-グリセロールリン酸(IGP)からグリセアルデヒド-3-リン酸(GAP)およびインドールへのアルドー分解切断を触媒し、インドールトタクマー中間体の形成を経て、その後、炭素結合切断を経てGAPとインドール3,6を生成する。β触媒部位には、シッフ塩基を介してβ-Lys87に結合したピリドキサール5′リン酸(PLP)補因子分子が含まれており、これは酵素βサブユニット3,7での反応の過程で電子シンクとして機能する。β部位は、L-トリプトファンおよびPLP依存反応中の水分子を与えるためにインドールによるL-セリン側鎖ヒドロキシルの置換を触媒する。セントTSは、多酵素複合体2,3内における基質チャネリングおよびアロステリック通信の調査のための長年のモデルとして機能する。TSのαとβサブユニット間の双方向のアロステリック通信は、触媒ステップを同期させ、L-トリプトファン合成中のインドール放出を防止するために必要である3。この取り組みを拡張するために、StTS βサブユニットの触媒部位における酵素構造、メカニズムおよび機能の関係をさらに探求するために、単一点突然変異(β-Gln114Ala、β-Lys167Thr、およびβ-Ser377Ala)によっていくつかの変異体を調製しました。
α2β2StTS の触媒機構に関する詳細な研究は、エディス W. マイルズの研究グループによって開始されました。天然大腸菌α 2 β 2TS複合体を用いた初期の研究は、単離されたαサブユニット8、9、単離βサブユニット10、11、およびα 2 β 2TS複合体の分離サブユニット12からの再構成の精製および特徴付けに焦点を当てている。精製は硫酸アンモニウム沈殿、サンプル透析、DEAE-セファデックスクロマトグラフィー、透析、およびDEAE-セファデックスカラム12上の第2のクロマトグラフィーラウンドによって行った。別のプロトコルでは、同じ複合体の精製は、明確化された細胞リセートをDEAE-Sephadexカラムにロードし、続いてセファローズ4Bカラムにクロマトグラフィーステップを行い、硫酸アンモニウム沈殿および透析13を行うことで改善された。両方の精製プロトコルは4〜5日間続きます。エシェリヒア・コリα 2 β 2TS錯体が結晶化したが、当時のX線回折には結晶が適していなかった。
新規研究では、S.チフィムリウムα 2 β 2TS複合体の組換えおよび野生型形態を精製し、14,15を結晶化した。組換えα 2 β 2St TS複合体は、pEBA-10発現ベクターを担持した大腸菌株CB149において過剰発現した。初期結晶化およびX線回折データの収集と分析2stTS複合体β α 2の収集と分析は、14を報告した。しかし、2 β 2StTS結晶αのような長くて細い針は構造研究を損なった。より良いX線回折データを収集する試みにおいて、α 2 β St TS複合体15の野生型および変異型を精製する別の精製プロトコルが記載された。精製は、スペルミンおよびPEG8,000を用いた初期沈殿を用いて精製した細胞リセートに行い、遠心分離により大きなかさばる沈殿物を除去した。高量のα 2 β 2StTS複合体を含む上清画分を、黄色の結晶が析出するまで4°Cで16〜48時間保存した。結晶を洗浄し、異なるバッファーに対して広範囲に透析した。タンパク質複合体は、硫酸アンモニウムを含む緩衝液中で再結晶化し、15.15を透析した。タンパク質の結晶化は、溶液中のタンパク質および沈殿物濃度に依存するが、α 2 β 2StTS複合体の他の変異型の精製を、溶液中で監視、予測、再生することは困難である。このプロトコルには、クロマトグラフィー法を使用しないという利点があります。しかしながら、欠点は、結晶化、透析、再結晶化に必要な長い精製時間であり、典型的には5〜7日を要する。X線データ収集に適した結晶を得るために、600以上の結晶化条件を、タンパク質濃度、温度、沈殿物(PEG4,000、6,000、および8,000)の組み合わせおよび変動を用いて評価した。結晶はより良い結晶形態を持ち、12%PEG 8,000および2 mMのスペルミンを含む条件でより速く成長した。結晶化は4、30、または42°Cではなく25°Cでより好ましく、3日以内に最大寸法15に成長した。当時のα 2 β 2StTS結晶構造(1996-1999)16、17、18、19、20、21、その他多くの構造がこれまでに発表されています。 
ここで、主な目的は、トリプトファン合成酵素を精製し、タンパク質の結晶化を最適化するための代替プロトコルを提示することです。本研究は、野生型単離αサブユニット(α St TS)、単離βサブユニット(β St TS)、2 β 2stTS複合体 αを単離されたサブユニットから再構成し、α 2 β 2St TS複合体の野生型および変異型を精製するための有意な改善を示す。 精製時間が大幅に短縮され、結晶化と凍結保護が最適化されるため、過去のプロトコルに対する利点はかなり高いものです。本研究で設計されたα 2 β 2St TS複合体の変異型は、野生型形態に使用される同じ条件付近で結晶化している。しかし、微細結晶化最適化は、原子分解に近いところで構造決定に十分な品質の大きな単結晶を得る必要があった。現在までに、タンパク質データバンク(PDB)に堆積した134のトリプトファン合成酵素結晶構造があり、細菌、古細菌および真核生物に関してそれぞれ101、31、2の結晶構造を考慮しています。うまく、73の構造はS.エンテラバーチフィムリウムに属し、α 2 β 2StTS複合体の5つの結晶構造は1.50オングストロームよりも高い解像度制限を有する。当然のことながら、4アウト5は、私たちの研究グループ(PDB ID:5CGQは1.18 Å、4HT3は1.30 Å、4HPJは1.45 Å、6DZ4は1.45 Å解像度で)で作成されました。2stTS複合体α 2 βの変異型の洗練された結晶構造は、L-トリプトファン合成に関与する必須アミノ酸残基が果たすメカニズムおよび役割に関する新たな洞察を提供することが期待される。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL 10 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL 100 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430489</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-141</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cryschem Plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-158</td>
			<td>24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td>centrifuge conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB15 ACCUMET Basic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB15</td>
			<td>pH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td>Agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S35836</td>
			<td>incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2646100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 Digital Sonifier</td>
			<td>Brason</td>
			<td>B450</td>
			<td>Cell disruptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP210-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC213601000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1391</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>HF polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10-297-018</td>
			<td>dNTPs set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42">Excella E25R Orbital Shaker</td>
			<td>Eppendorf New Brunswick</td>
			<td>M1353-0004</td>
			<td>Orbital incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>8149-30-0004</td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210012</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0104S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-5255-01</td>
			<td>5 mL Histrap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelvinator Series-100</td>
			<td>Kelvinator</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Ultra low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Liquid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Solid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0193S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA affinity beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R90115</td>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-865-0</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxal phosphate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC228170010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-200 HR</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-000-196</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-5B centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1004</td>
			<td>Floor cetrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC132750010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-002-491</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>DNA liagse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubl-specific protease 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12588018</td>
			<td>SUMO Protease</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase

サルモネラチフィムリウム由来のトリプトファン合成酵素(TS)バイ酵素複合体(α 2 β 2 TS)を用いた構造研究が行われ、その触媒機構、アロステリック挙動、およびPLP依存酵素における生成物への酵素的形変換の詳細を理解することが行われている。本研究では、単離されたαおよび単離されたβサブユニットを生成する新規発現系により、2日以内に分離されたサブユニットから2 β st TS複合体をα大量に精製した。精製は、アフィニティー・クロマトグラフィーにより行い、続いて親和性タグの切断、硫酸アンモニウム沈殿、およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行った。β部位の酵素における重要な残基の役割をよりよく理解するために、部位特異的突然変異誘発は、以前の構造研究で行われた。野生型および変異型α 2stTS複合体βを精製する別のプロトコルが作成されました。硫酸アンモニウム分画とSECを用いたシンプルで高速かつ効率的なプロトコルにより、1日で2stTS複合体α 2 β精製が可能になりました。この研究で説明した両方の精製プロトコルは、PEG 8000およびシュペルミンを使用して同じ複合体を精製する前のプロトコルと比較して、精製プロトコルに沿ってα 2 β 2StTS複合体を結晶化する場合にかなりの利点を有する。野生型および変異型の結晶化は、わずかに異なる条件下で生じ、PEG 8000およびスペルミンを用いた一部の変異体の精製を損なう。X線結晶学研究に適した結晶を調製するために、結晶化、結晶質、および凍結保護を最適化するためにいくつかの努力がなされた。ここで提示される方法は、一般に、2st TS複合体のトリプトファン合成酵素サブユニットおよび野生型および変異型α 2 β 2の精製に適用されるべきである。

トリプトファン合成酵素のαとβサブユニットの精製 α-subunit(αSt TS)およびサルモネラ・チフィムリウム・トリプトファンシンターゼのβサブユニット(β StTS)を、改変pET SUMOベクター中でサブクローニングした。 図1Aは、His6-SUMO-α St TS(lane αON)およびHis6-SUMO-β St TS(レ?...

Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

本稿では 、サルモネラ・チフィムリウム・ トリプトファン合成酵素の発現と精製のための一連の連続的な方法を提示し、このプロトコルは、1日でタンパク質複合体を精製するための急速なシステムをコンプする。対象となる方法は、部位特異的変異誘発、 大腸菌におけるタンパク質発現、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および結晶化である。

PCR変異生成、クローニング、発現、高速タンパク質精製プロトコルおよびトリプトファン合成酵素の野生型および変異型の結晶化

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化<em&gt; S</em&gt; - シタロプラム

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

S100A12の発現、精製および抗菌活性

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

組換えタンパク質の発現、結晶化、および生物物理学的研究<em&gt;バチルス</em&gt;保有ヌクレオチドピロホスホリラーゼ、BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

カフェイン抽出、酵素活性、植物細胞懸濁液からのカフェイン合成酵素の遺伝子発現

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

ヌクレアーゼフリー酸素スカベンジャープロトカテク酸プロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼの発現と精製

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

タンパク質結晶構造解析のためのクリスタルヒットを得るためのハイスループットスクリーニング(英語)

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...