Name: pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase
Uploaded: 2020-09-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA (GM097569).

1. Protocolo rápido para purificar a subunidade α e β e o complexo de α2β2StSrecombinado
<ol><li>Subcloning de DNA no vetor de expressão pETSUMO<ol><li>Obtenha o gene de acoplamento traduções (trpA e trpB) codificando as α- e βsubunidades do sintetizador triptofano da bactéria Salmonella enterica serovar typhimurium clonado no vetor de expressão pEBA-1022. Use o vetor pEBA-10 como modelo de DNA. NOTA: Alternativame...

<ol>
	<li>Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+multienzyme+complex+with+an+intramolecular+tunnel.">Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel.</a> Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).</li><li>Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+mine+for+enzymologists.">Tryptophan synthase: a mine for enzymologists.</a> Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).</li><li>Dunn, M. 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A comparison between the native complex and the reconstituted complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).</li><li>Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+proteolytic+derivative+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase.+Identification+of+the+site+of+cleavage+and+characterization+of+the+fragments.">An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.</a> Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).</li><li>Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+crystallographic+data+of+the+tryptophan+synthase+alpha+2+beta+2+complex+from+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).</li><li>Miles, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+tryptophan+synthase.+Clarification+of+the+roles+of+histidine+86,+lysine+87,+arginine+148,+cysteine+170,+and+cysteine+230.">The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).</li><li>Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crystallography+of+a+true+substrate,+indole-3-glycerol+phosphate,+bound+to+a+mutant+(alphaD60N)+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+reveals+the+correct+orientation+of+active+site+alphaGlu49.">Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).</li><li>Weyand, M., Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+wild-type+tryptophan+synthase+complexed+with+the+natural+substrate+indole-3-glycerol+phosphate.">Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate.</a> Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).</li><li>Sachpatzidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+studies+of+phosphonate-based+alpha-reaction+transition-state+analogues+complexed+to+tryptophan+synthase.">Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).</li><li>Yang, L. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+content+of+protein+crystals.">Solvent content of protein crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</li><li>Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coefficient+probabilities:+Improved+estimates+for+unit+cell+contents+of+proteins,+DNA,+and+protein-nucleic+acid+complex+crystals.">coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals.</a> Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).</li></ol>

Nós projetamos com sucesso a forma mutante α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T, e α2β2 complexos βS377A StTS para estudos de correlação estrutura-função. Inicialmente, tentamos purificar os mutantes usando um protocolo de purificação anterior22, que requer α2β cristalização do complexoStTS2com PEG 8000 e espermatozoide durante a purificação. Embora a taxa de cristalização dependa ...

O complexo de xodó-sintéria triptofano (TS) (α2β2) é uma enzima alusicana, catalisando os dois últimos passos na biossíntese do aminoácido L-Triptofano em bactérias, plantas e fungos1,2,3. A bactéria Salmonella enterica serovar typhimurium (St)causa uma grave infecção gastrointestinal em humanos e outros animais. Uma vez que os seres humanos e animais superiores não possuem TS (EC 4.2.1.20), a inibição de S. typhimurium αcomplexo 2β2 TS (α2β2StTS) tem sido explorado como um potencial alvo de drogas para o tratamento de criptosporidiose e tuberculose4, infecções genitais e oculares5, e para potencial utilização de herbicidas na agricultura6. O α-subunidade catalisa o decote aldolítico de indole-3-glicerol-fosfato (IGP) ao glicealdeído-3-fosfato (GAP) e indol, através da formação de um teima de ligação indolenina tautomer e, posteriormente, de ligação carbono-carbono para produzir GAP e indole3,6. O sítio β-catallítico contém uma molécula de cofato piridoxal de 5′-fosfato (PLP) ligada a β-Lys87 através de uma base de Schiff, que funciona como um dissipador de elétrons no curso das reações na enzima β-subunidade3,7. O β-local catalisa a substituição do hidroxyl de cadeia lateral L-Serine por indol para dar L-Triptofano e uma molécula de água em uma reação dependente de PLP. St. A TS serve como um modelo de longa data para a investigação de canalização de substratos e comunicação alotérica dentro de complexos multienzimáticos2,3. A comunicação alotérica bidirecional entre as subunidades α e β de TS é necessária para sincronizar as etapas catalíticas e evitar a liberação de indol durante a síntese L-Triptophan3. Para estender esse esforço, preparamos vários mutantes (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr e β-Ser377Ala) por mutação de ponto único para ser usado em novas explorações da relação entre estrutura enzimática, mecanismo e função no local catalítico da subunidade stTS β.
Uma pesquisa detalhada sobre o mecanismo catalítico de α2β2StTS foi iniciada pelo grupo de pesquisa de Edith W. Miles. Estudos iniciais com o complexo escherichia coli nativo α2β2 TS têm focado na purificação e caracterização da subunidade isolada α8,9, isolada β-subunidade10,11 e a reconstituição do complexo α2β2 TS das subunidades isoladas12. A purificação foi realizada por precipitação de sulfato de amônio, diálise amostral, cromatografia DEAE-Sephadex, diálise e uma segunda rodada cromatográfica na coluna DEAE-Sephadex12. Em outro protocolo, a purificação do mesmo complexo foi melhorada carregando o lysato celular esclarecido em uma coluna DEAE-Sephadex seguida de um passo cromatográfico em uma coluna Sepharose 4B, precipitação de sulfato de amônio e diálise13. Ambos os protocolos de purificação duram de 4 a 5 dias. Escherichia coli α2β complexo2 TS cristalizado, mas os cristais não eram adequados para difração de raios-X na época.
Em um novo estudo, formas recombinantes e selvagens de S. typhimurium αcomplexo de 2β2 TS foram purificadas e cristalizadas14,15. O complexo de α2β2StTS foi superexpresso na cepa E. coli CB149 carregando o vetor de expressão pEBA-10. Foram relatados14a coleta e análise inicial de dados de cristalização e difração de raios-X do complexo de α2β2StTS . No entanto, agulhas longas e finas como α2β2Cristaisde St.TS prejudicaram estudos estruturais. Na tentativa de coletar melhores dados de difração de raios-X, outro protocolo de purificação foi descrito para purificar o tipo selvagem e as formas mutantes do α2β2Complexo StTS15. A purificação foi realizada com uma precipitação inicial usando esperteza e PEG 8.000 no lysato celular esclarecido e um grande precipitado volumoso foi removido por centrifugação. A fração supernante contendo altas quantidades de α2β complexoStTSfoiarmazenada por 16-48 h a 4 °C até que os cristais amarelos precipitados. Cristais foram lavados e extensivamente dialisados contra diferentes tampões. O complexo proteico foi recriminado em tampão contendo sulfato de amônio e dialisado15. Embora, a cristalização proteica dependa de concentrações de proteínas e precipitantes em solução, é difícil monitorar, prever e reproduzir a purificação para outras formas mutantes de α2β complexode StTS2em solução. Este protocolo tem a vantagem de não utilizar nenhum método cromatográfico; no entanto, as desvantagens são o longo tempo de purificação necessário para cristalizar, dialisar e recristallizar, normalmente exigindo de 5 a 7 dias. Para obter cristais adequados para coleta de dados de raios-X, mais de 600 condições de cristalização foram avaliadas utilizando-se uma combinação e variação de concentração proteica, temperatura, precipitantes (PEG 4.000, 6.000 e 8.000), e aditivos (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, cadáver, putrescina, espermióides ou espermióides)15. Os cristais tinham uma melhor forma cristalina e cresceram mais rápido em condições que continham 12% de PEG 8.000 e 2 mM de espermatozoides. A cristalização foi mais favorável a 25 °C em vez de 4, 30 ou 42 °C e cresceu para dimensões máximas em 3 dias15. Vários α2β2estruturas de cristalstSforam relatadas na época (1996-1999)16,17,18,19,20,21 e muitas outras estruturas foram publicadas até o momento.
Aqui, o objetivo principal é apresentar protocolos alternativos para purificar a sinthase triptofano e otimizar a cristalização proteica. O presente trabalho apresenta melhorias significativas para purificar o tipo selvagem isolado α-subunidade (αStTS), unidade isolada β-subunidade (βStTS), reconstituída αcomplexo de 2β2St.TS das subunidades isoladas, e tipo selvagem e formas mutantes do complexo α2β2St.TS. As vantagens em relação aos protocolos passados são consideráveis, uma vez que o tempo de purificação foi reduzido significativamente e a cristalização e a crioproteção foram otimizadas. Formas mutantes de α2β complexostS2projetado neste trabalho cristalizaram perto da mesma condição usada para a forma tipo selvagem. No entanto, a otimização da cristalização fina foi necessária para obter grandes cristais únicos de qualidade suficiente para a determinação da estrutura em resolução quase atômica. Até o momento, existem 134 estruturas de cristal de sinthase triptofano depositadas no Banco de Dados de Proteínas (PDB), contabilizando 101, 31 e 2 estruturas de cristais, respectivamente, para bactérias, arqueias e eucariotes. Bem, 73 estruturas pertencem ao s. enterica serovar typhimurium e 5 estruturas cristalinas do complexo α2β2StTS têm limites de resolução superiores a 1,50 Angstroms. Não surpreende que 4 em 5 foram preparados em nosso grupo de pesquisa (PDB IDs:5CGQ em 1,18 Å, 4HT3 às 1,30 Å, 4HPJ em 1.45 Å, 6DZ4 em resolução 1.45 Å). As estruturas cristalinas refinadas da forma mutante de α2βcomplexode StTS são esperadas para fornecer novas percepções sobre o mecanismo e os papéis desempenhados por resíduos essenciais de aminoácidos envolvidos na síntese L-Triptofano.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL 10 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL 100 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430489</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-141</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cryschem Plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-158</td>
			<td>24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td>centrifuge conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB15 ACCUMET Basic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB15</td>
			<td>pH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td>Agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S35836</td>
			<td>incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2646100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 Digital Sonifier</td>
			<td>Brason</td>
			<td>B450</td>
			<td>Cell disruptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP210-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC213601000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1391</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>HF polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10-297-018</td>
			<td>dNTPs set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42">Excella E25R Orbital Shaker</td>
			<td>Eppendorf New Brunswick</td>
			<td>M1353-0004</td>
			<td>Orbital incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>8149-30-0004</td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210012</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0104S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-5255-01</td>
			<td>5 mL Histrap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelvinator Series-100</td>
			<td>Kelvinator</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Ultra low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Liquid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Solid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0193S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA affinity beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R90115</td>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-865-0</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxal phosphate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC228170010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-200 HR</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-000-196</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-5B centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1004</td>
			<td>Floor cetrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC132750010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-002-491</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>DNA liagse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubl-specific protease 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12588018</td>
			<td>SUMO Protease</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase

Estudos estruturais com complexo de sindtofano (TS) complexo de bienzyme (α2β2 TS) de Salmonella typhimurium foram realizados para entender melhor seu mecanismo catalítico, comportamento alolítico e detalhes da transformação enzimática do substrato ao produto em enzimas dependentes de PLP. Neste trabalho, um novo sistema de expressão para produzir o isolado α e isolado β-subunidade permitiu a purificação de altas quantidades de subunidades puras e αcomplexo de 2β2St.TS das subunidades isoladas dentro de 2 dias. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade seguida de decote da tag de afinidade, precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Para melhor compreender o papel dos resíduos-chave na enzima β-local, a mutagênese direta do local foi realizada em estudos estruturais anteriores. Outro protocolo foi criado para purificar o tipo selvagem e mutante α2β2complexosde St.TS. Um protocolo simples, rápido e eficiente usando fracionamento de sulfato de amônio e SEC permitiu a purificação de αcomplexo de 2β2StTS em um único dia. Ambos os protocolos de purificação descritos neste trabalho têm vantagens consideráveis quando comparados com protocolos anteriores para purificar o mesmo complexo usando PEG 8000 e espermaina para cristalizar o complexo α2β2StTS ao longo do protocolo de purificação. Cristalização do tipo selvagem e algumas formas mutantes ocorre em condições ligeiramente diferentes, prejudicando a purificação de alguns mutantes usando PEG 8000 e espermaina. Para preparar cristais adequados para estudos cristalográficos de raios-X foram feitos diversos esforços para otimizar a cristalização, a qualidade do cristal e a crioproteção. Os métodos aqui apresentados devem ser geralmente aplicáveis para a purificação de subunidades de synthase triptofano e tipo selvagem e mutante α2β2complexosde St.TS.

Purificação da α-e βsubunidades do sindtofano synthase A α-subunidade(αStTS) e a β-subunidade (βStTS) do triofetase de typhimurium Salmonella foram subcloradas no vetor pET SUMO modificado. A Figura 1A mostra resultados representativos da SDS-PAGE de duas bandas fortes correspondentes à proteína de fusão His6-SUMO-αStTS (pista αON...

Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Este artigo apresenta uma série de métodos consecutivos para a expressão e purificação de Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp este protocolo um sistema rápido para purificar o complexo proteico em um dia. Os métodos cobertos são mutagênese direcionada ao local, expressão proteica em Escherichia coli,cromatografia de afinidade, cromatografia de filtração de gel e cristalização.

PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Bioquímica

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Expressão de Proteína Recombinante, Cristalização e Estudos Biofísicos de<em&gt; Bacillus</em&gt; -conservado Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Automated protocolos para cristalização Macromolecular no laboratório de Biologia Molecular MRC

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Extração de cafeína, atividade enzimática e expressão gênica de cafeína sintase de suspensões celulares de planta

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Expressão, solubilização e purificação de transportadores eucarióticas borato

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Expressão e purificação do protocatechuato de oxigênio sem nuclease 3,4-Dioxigenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressão, purificação, cristalização e ensaios enzimáticos de proteínas contendo domínio de Fumarilacetoacetato de hidrolase

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Triagem de alto rendimento para obter hits de cristal para cristalografia de proteínas

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...