Name: pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase
Uploaded: 2020-09-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü (GM097569) tarafından desteklendi.

1. α ve β alt birliğini ve yeniden birlenenα 2β2StTS kompleksini arındırmak için hızlı protokol
<ol><li>pETSUMO ifade vektörüne DNA alt kavunu<ol><li>pEBA-10 ekspresyon vektörü22'deklonlanmış Salmonella enterica serovar typhimurium bakterisinden triptofan sintazının αkodlayan çevirisel kavrama genini (trpA ve trpB) ve β-alt biralarını elde edin. DNA şablonu olarak pEBA-10 vektörü kullanın. NOT: Alter...

<ol>
	<li>Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+multienzyme+complex+with+an+intramolecular+tunnel.">Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel.</a> Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).</li><li>Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+synthase:+a+mine+for+enzymologists.">Tryptophan synthase: a mine for enzymologists.</a> Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).</li><li>Dunn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+substrate+channeling+and+catalysis+in+the+tryptophan+synthase+bienzyme+complex.">Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).</li><li>Chaudhary, K., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protozoan+genomics+for+drug+discovery.">Protozoan genomics for drug discovery.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).</li><li>Caldwell, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+in+Chlamydia+trachomatis+tryptophan+synthase+genes+differentiate+between+genital+and+ocular+isolates.">Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).</li><li>Kulik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+structural+basis+of+the+catalytic+mechanism+and+the+regulation+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium+and+BX1+from+maize,+two+evolutionarily+related+enzymes.">On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).</li><li>Barends, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanistic+implications+of+a+tryptophan+synthase+quinonoid+intermediate.">Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate.</a> Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).</li><li>Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+catalytic+properties+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase,+a+two-component+enzyme.">A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).</li><li>Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A+protein+of+the+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+Purification,+crystallization,+and+composition+studies.">The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).</li><li>Wilson, D. A., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+B+component+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase.">Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase.</a> Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).</li><li>Adachi, O., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+preparing+crystalline+beta+2+subunit+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli+in+high+yield.">A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).</li><li>Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystalline+alpha2+beta2+complexes+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+A+comparison+between+the+native+complex+and+the+reconstituted+complex.">Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).</li><li>Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+proteolytic+derivative+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase.+Identification+of+the+site+of+cleavage+and+characterization+of+the+fragments.">An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.</a> Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).</li><li>Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+crystallographic+data+of+the+tryptophan+synthase+alpha+2+beta+2+complex+from+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).</li><li>Miles, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+subunit+of+tryptophan+synthase.+Clarification+of+the+roles+of+histidine+86,+lysine+87,+arginine+148,+cysteine+170,+and+cysteine+230.">The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).</li><li>Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+K++or+Cs++for+Na++induces+local+and+long-range+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+the+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex.">Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex.</a> Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+mutant+(betaK87T)+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+with+ligands+bound+to+the+active+sites+of+the+alpha-+and+beta-subunits+reveal+ligand-induced+conformational+changes.">Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes.</a> Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).</li><li>Schneider, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop+closure+and+intersubunit+communication+in+tryptophan+synthase.">Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).</li><li>Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crystallography+of+a+true+substrate,+indole-3-glycerol+phosphate,+bound+to+a+mutant+(alphaD60N)+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+reveals+the+correct+orientation+of+active+site+alphaGlu49.">Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).</li><li>Weyand, M., Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+wild-type+tryptophan+synthase+complexed+with+the+natural+substrate+indole-3-glycerol+phosphate.">Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate.</a> Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).</li><li>Sachpatzidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+studies+of+phosphonate-based+alpha-reaction+transition-state+analogues+complexed+to+tryptophan+synthase.">Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).</li><li>Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+mutagenesis+and+overexpression+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium:+On+the+roles+of+beta+(2)+subunit+Lys-382.">PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382.</a> Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Lowry, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Measurement+with+the+Folin+Phenol+Reagent.">Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent.</a> Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+mutagenesis+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium.+Changing+arginine+179+to+leucine+alters+the+reciprocal+transmission+of+substrate-induced+conformational+changes+between+the+alpha+and+beta+2+subunits.">Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).</li><li>Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iMOSFLM:+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM.">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, 271-281 (2011).</li><li>Evans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+and+Assessment+of+Data+Quality.">Scaling and Assessment of Data Quality.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 72-82 (2006).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).</li><li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+replacement+with+MOLREP.">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 22-25 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 213-221 (2010).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 486-501 (2010).</li><li>Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+macromolecular+structures+by+the+maximum-likelihood+method.">Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, 240-255 (1997).</li><li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine.">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, 352-367 (2012).</li><li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+content+of+protein+crystals.">Solvent content of protein crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</li><li>Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coefficient+probabilities:+Improved+estimates+for+unit+cell+contents+of+proteins,+DNA,+and+protein-nucleic+acid+complex+crystals.">coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals.</a> Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).</li></ol>

Yapı fonksiyonu korelasyon çalışmaları için2β 2 βQ114A,2 β2 βK167Tα ve2 α β2βS377A StTS kompleksleri α mutant formunu başarıyla tasarladık. Başlangıçta, mutantları daha önceki bir saflaştırma protokolü22kullanarak arındırmaya çalıştık , bu da α2β2StTS karmaşık kristalizasyonu PEG 8000 ve spermin ile saflaştırma sırasında gerektirir. Kristalleşme hızı ...

Triptofan sintaz (TS) bienza kompleksi (α2β2),bakteri, bitki ve mantarlarda L-Triptofan amino asidinin biyosentezinde son iki adımı katalizleyen allosterik birenzimdir. Salmonella enterica serovar typhimurium (St) bakterisi insanlarda ve diğer hayvanlarda ciddi bir gastrointestinal enfeksiyona neden olur. İnsanlarda ve daha yüksek hayvanlarda TS (EC 4.2.1.20) olmadığından, S'nin inhibisyonu. tifüs α2β2 TS kompleksi (α2β2StTS) kriptosporidiosis ve tüberküloz tedavisi için potansiyel bir ilaç hedefi olarak araştırılmıştır4, genital ve oküler enfeksiyonlar5ve tarımda potansiyel herbisit kullanımı için6. α-alt birimi, GAP ve indole3,6'yıüretmek için bir indolenine tautomer ara ve daha sonra karbon-karbon bağı bölünmesinin oluşumu yoluyla, gliseraldehit-3-fosfat (GAP) ve indole'ye kadar olan aldolitik bölünmeyi kataliz eder. β katalitik alan, β-Lys87'ye bir Schiff tabanı aracılığıyla bağlı bir piridoksial 5′-fosfat (PLP) kofaktör molekülü içerir, bu da enzim β-alt biradaki reaksiyonlar sırasında bir elektron lavabosu olarak işlev β3,7. β alanı, L-Serine yan zincir hidroksilinin L-Triptofan ve PLP'ye bağımlı reaksiyonda bir su molekülü vermek için hintkenede değiştirilmesini katalİze eder. St TS, çok enzimli kompleksler içinde substrat kanal ve allosterik iletişimin araştırılması için uzun süredir devam eden bir model olarak hizmet vermektedir2,3. L-Triptofan sentezi sırasında katalitik adımları senkronize etmek ve indole salınımını önlemek için TS'nin α ve β alt biraları arasındaki çift yönlü allosterik iletişim3. Bu çabayı genişletmek için, StTS β-subunit'in katalitik bölgesinde enzim yapısı, mekanizması ve fonksiyonu arasındaki ilişkinin daha fazla araştırılmasında kullanılmak üzere tek nokta mutasyonu ile birkaç mutant (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr ve β-Ser377Ala) hazırladık.
Edith W. Miles araştırma grubu tarafındanα 2β2StTS'nin katalitik mekanizması hakkında detaylı araştırma başlatılmıştır. Yerli Escherichia coli α2β2 TS kompleksi ile yapılan ilkçalışmalar,yalıtılmış α-alt bira 8 ,9, izole β-alt bira 10,11ve α 2 β 2TS kompleksinin yalıtılmış alt birelerden arındırılmasına ve karakterizasyonuna odaklanmıştır12. Saflaştırma, amonyum sülfat çökeltme, örnek diyaliz, DEAE-Sephadex kromatografisi, diyaliz ve DEAE-Sephadex sütun12üzerinde ikinci bir kromatografik yuvarlak ile gerçekleştirildi. Başka bir protokolde, aynı kompleksin saflaştırılması, netleştirilmiş hücre lisatının bir DEAE-Sephadex sütununa yüklenmesi ve ardından Sepharose 4B sütununa kromatografik bir adım, amonyum sülfat çökeltme ve diyaliz13. Her iki saflaştırma protokolü de 4-5 gün sürer. Escherichia coli α2β2 TS kompleksi kristalize edildi, ancak kristaller o zaman X-ışını kırınımı için uygun değildi.
Yeni bir çalışmada, S. typhimurium α 2 β2TS kompleksinin rekombinant ve vahşi tip formları saflaştırıldı ve kristalize edildi14,15. Rekombinant α2β2StTS kompleksi, pEBA-10 ifade vektörü taşıyan E. coli strain CB149'da aşırı ifade edildi. α2β 2StTS kompleksinin ilk kristalizasyonu veX-ışınıkırınım verisi toplanması ve analizi14bildirilmiştir. Bununla birlikte, α2β2StTS kristalleri gibi uzun ve ince iğne yapısal çalışmaları bozmuşlardır. Daha iyi X-ışını kırınım verileri toplamak amacıyla, α 2 β 2StTS kompleksi15'invahşi tipini ve mutant formlarını arındırmak için başka bir saflaştırma protokolü tanımlanmıştır. Temizleme, netleştirilmiş hücre lisatına spermin ve PEG 8.000 kullanılarak ilk çökeltme ile gerçekleştirildi ve santrifüjleme ile büyük bir hacimli çökelti çıkarıldı. Yüksek miktarda α içeren süpernatant fraksiyon2β2StTS kompleksi, sarı kristaller çökene kadar 4 °C'de 16-48 saat boyunca depolandı. Kristaller yıkandı ve farklı tamponlara karşı yoğun bir şekilde çaprazlandı. Protein kompleksi amonyum sülfat içeren tamponda rekristalite edildi ve15. Protein kristalizasyonu çözeltideki protein ve çökelti konsantrasyonlarına bağlı olsa da, çözeltideki diğer mutant formları için saflaştırmayı izlemek, tahmin etmek ve çoğaltmak α2β2StTS kompleksinin çözeltisinde. Bu protokol, herhangi bir kromatografik yöntem kullanmaması avantajına sahiptir; bununla birlikte, dezavantajları, tipik olarak 5-7 gün gerektiren kristalize etmek, dialyze etmek ve recrystallize etmek için gerekli olan uzun saflaştırma süresidir. X-ışını veri toplama için uygun kristaller elde etmek, 600'den fazla kristalizasyon koşulu protein konsantrasyonu, sıcaklık, çökeltiler (PEG 4.000, 6.000 ve 8.000) ve katkı maddeleri (CaCl 2 , MnCl2, ZnCl2, kadavra, putrescine, spermin veya spermidin) kombinasyonu ve varyasyonu kullanılarak değerlendirildi15. Kristaller daha iyi bir kristal formuna sahipti ve% 12 PEG 8.000 ve 2 mM spermin içeren koşullarda daha hızlı büyüdü. Kristalizasyon 4, 30 veya 42 ° C yerine 25 ° C'de daha elverişliydi ve 3 gün içinde maksimum boyutlara büyüdü15. O dönemde(1996-β1999) 16 , 17 , 18 , 19,20,21ve daha birçok yapının yayınlandıkları α bildirilmiştir.
Burada temel amaç triptofan sintazını arındırmak ve protein kristalizasyonunu optimize etmek için alternatif protokoller sunmaktır. Mevcut çalışma, yalıtılmış β-alt birliğini (β St TS), 2 β 2StTS kompleksini yalıtılmış alt birelerden yeniden oluşturan αalt birliğini (α αStTS), α2β2StTS kompleksinin vahşi tip ve mutant formlarını arındırmak için önemli iyileştirmelergöstermektedir. Arınma süresi önemli ölçüde azaltıldığı ve kristalizasyon ve kriyoproteksiyon optimize edildiğinden, geçmiş protokollere göre avantajlar önemli ölçüdedir. Bu çalışmada tasarlanan α2β2StTS kompleksinin mutant formları, vahşi tip formu için kullanılan durumun yakınında kristalleşmiştir. Bununla birlikte, atomik çözünürlüğe yakın yapı belirleme için yeterli kalitede büyük tek kristaller elde etmek için ince kristalizasyon optimizasyonu gerekliydi. Bugüne kadar Protein Veri Bankası'nda (PDB) bakteri, arkea ve ökaryot için sırasıyla 101, 31 ve 2 kristal yapıyı oluşturan 134 triptofan sintaz kristal yapısı bulunmaktadır. Güzel bir şekilde, 73 yapı S. enterica serovar typhimurium'a aittir ve α 2 β2StTS kompleksinin5kristal yapısı 1.50 Angstrom'dan daha yüksek çözünürlük sınırlarına sahiptir. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, araştırma grubumuzda 5'te 4'ü hazırlandı (PDB IDs:5CGQ 1.18 Å'da, 4HT3 1.30 Å'da, 4HPJ 1.45 Å'da, 6DZ4 1.45 şçözünürlükte). α2β2StTS kompleksinin mutant formunun rafine kristal yapılarının, L-Triptofan sentezinde yer alan esansiyel amino asit kalıntılarının oynadığı mekanizma ve roller hakkında yeni içgörüler sağlaması beklenmektedir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL 10 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL 100 kDa filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>centrifugal filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430489</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-141</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Cryschem Plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-158</td>
			<td>24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td>centrifuge conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB15 ACCUMET Basic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB15</td>
			<td>pH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td>Agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A702-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S35836</td>
			<td>incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2646100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 Digital Sonifier</td>
			<td>Brason</td>
			<td>B450</td>
			<td>Cell disruptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP210-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC213601000</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1391</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>HF polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10-297-018</td>
			<td>dNTPs set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42">Excella E25R Orbital Shaker</td>
			<td>Eppendorf New Brunswick</td>
			<td>M1353-0004</td>
			<td>Orbital incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>8149-30-0004</td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210012</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0104S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-5255-01</td>
			<td>5 mL Histrap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0392</td>
			<td>Inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelvinator Series-100</td>
			<td>Kelvinator</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Ultra low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Liquid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Solid broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0193S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA affinity beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R90115</td>
			<td>Ni-NTA agarose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-865-0</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxal phosphate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC228170010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-200 HR</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-000-196</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-5B centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1004</td>
			<td>Floor cetrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC132750010</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>45-002-491</td>
			<td>Size exclusion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>DNA liagse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubl-specific protease 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12588018</td>
			<td>SUMO Protease</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pcr mutagenesis, cloning, expression, fast protein purification protocols and crystallization of the wild type and mutant forms of tryptophan synthase

Salmonella tiphimurium'dan triptofan sintaz (TS) bienzim kompleksi (α2β2 TS) ile yapılan yapısal çalışmalar, katalitik mekanizmasını, allosterik davranışını ve PLP'ye bağımlı enzimlerde substratın ürüne enzimatik dönüşümünün ayrıntılarını daha iyi anlamak için gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, yalıtılmış α ve yalıtılmış β alt birliğini üretmek için yeni bir ifade sistemi, yüksek miktarda saf alt birim ve α2β2StTS kompleksinin izole alt birli dış birimlerden 2 gün içinde arındırılmasına izin etti. Saflaştırma, benzeşim kromatografisi ve ardından benzeşim etiketinin bölünmesi, amonyum sülfat çökeltme ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile gerçekleştirildi. Enzim β-sitedeki anahtar kalıntılarının rolünü daha iyi anlamak için, önceki yapısal çalışmalarda bölgeye doğrudan mutajensis yapıldı. Vahşi tip ve mutant α2β2StTS kompleksini arındırmak için başka bir protokol oluşturuldu. Amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve SEC kullanılarak basit, hızlı ve verimli bir protokol, α2β2StTS kompleksinin tek bir günde arındırılmasına izin sağladı. Bu çalışmada açıklanan her iki saflaştırma protokolü, saflaştırma protokolü boyunca α2β2StTS kompleksini kristalize etmek için PEG 8000 ve spermin kullanarak aynı kompleksi arındırmak için önceki protokollerle karşılaştırıldığında önemli avantajlara sahiptir. Vahşi tip ve bazı mutant formlarının kristalleşmesi, peg 8000 ve spermin kullanarak bazı mutantların saflaşmasını bozan biraz farklı koşullar altında gerçekleşir. X-ışını kristalografik çalışmalarına uygun kristalleri hazırlamak için kristalizasyon, kristal kalitesi ve kriyoproteksiyonu optimize etmek için çeşitli çabalar sarfedildi. Burada sunulan yöntemler genellikle triptofan sintaz alt biraları ve vahşi tip ve mutant α2β2StTS komplekslerinin saflaştırılması için uygulanmalıdır.

Triptofan sintazının αve β-alt birliğinin arındırılması Modifiye pET SUMO vektörüne Salmonella tiphimurium triptofan sintazının α -altbölümü(αStTS) ve β-alt bölümü(β StTS) alt kavunludur. Şekil 1A, His6-SUMO-αStTS (lane αON) ve His6-SUMO-βStTS (lane βON) füzyon proteinine karşılık gelen iki güçlü ban...

Watch this Scientific Journal Video about PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase at JoVE

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Bu makale, Salmonella tiphimurium triptofan sintazının ekspresyonu ve saflaştırılması için bir dizi ardışık yöntem sunar, bu protokol protein kompleksini bir günde arındırmak için hızlı bir sistemdir. Kapsanan yöntemler escherichia coliprotein ekspresyözü, benzeşim kromatografisi, jel filtrasyon kromatografisi ve kristalizasyondur.

PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları<em&gt; Bacillus</em&gt; - Konserve Nükleotid Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Kafein ayıklama, enzimatik aktivite ve kafein Synthase bitki hücre kullanılamaz hale gelen gen ifadesi

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...