Name: single-cell multiplexed fluorescence imaging to visualize viral nucleic acids and proteins and monitor hiv, htlv, hbv, hcv, zika virus, and influenza infection
Uploaded: 2020-10-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infectio

Dette arbejde blev støttet helt eller delvist af National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 og U54 AI150472). Vi takker Dr. Raymond F. Schinazi og Sadie Amichai for at levere celler inficeret med influenza A-virus.

1. Frøceller (Suspension vs. Adherent Cells) på coverslips eller kammer dias (protokol præsenteret bruger coverslips).
<ol><li>Såning af suspensionsceller<ol><li>Forbered poly-D-lysin (PDL) belagte dækslips (letter vedhæftning af suspensionsceller til dækslip) ved først at inkubere dækslips i ethanol (EtOH) i 5 minutter (steriliserer dækslips og fjerner eventuelle rester). Derefter vaskes 2x i fosfatbufferet saltvand (PBS), inden dækslip inkuberes i PDL (20 μg/ml) i 30 minutter (min) ved stuetemper...

<ol>
	<li>Zheng, Q., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+photostable+fluorophores+for+molecular+imaging.">Development of photostable fluorophores for molecular imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).</li><li>Marini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Puray-Chavez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-cell+visualization+of+nucleic+acids+and+protein+during+HIV+infection.">Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection.</a> Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).</li><li>Ukah, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+HIV-1+RNA+Transcription+from+Integrated+HIV-1+DNA+in+Reactivated+Latently+Infected+Cells.">Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells.</a> Viruses. 10 (10), (2018).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Positive+and+Negative+Sense+Viral+RNA+for+Probing+the+Mechanism+of+Direct-Acting+Antivirals+against+Hepatitis+C+Virus.">Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus.</a> Viruses. 11 (11), (2019).</li><li>Achuthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid-CPSF6+Interaction+Licenses+Nuclear+HIV-1+Trafficking+to+Sites+of+Viral+DNA+Integration.">Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+detection+of+RNA+using+MERFISH+and+branched+DNA+amplification.">Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li><li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution.">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li><li>Bushnell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProbeDesigner:+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+(bDNA)+signal+amplification+assays.">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li><li>Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+HIV-1+Genomic+DNA+from+Entry+through+Productive+Infection.">Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection.</a> Journal of Virology. 91 (9), (2017).</li><li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells.">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26 (1), 10-18 (2002).</li><li>Francis, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+replication+complexes+accumulate+in+nuclear+speckles+and+integrate+into+speckle-associated+genomic+domains.">HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains.</a> Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).</li><li>Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+blockade+reveals+that+HIV-1+completes+reverse+transcription+and+uncoating+in+the+nucleus.">Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus.</a> Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).</li></ol>

Samtidig visualisering af RNA, DNA og protein kræver ofte omfattende optimering. To almindeligt anvendte metoder er 5-ethynyl-2-deoxyuridin (EdU) mærkning og DNA FISH. EdU-mærkning er blevet anvendt til at visualisere viralt DNA og protein samtidigt, da EdU er inkorporeret i spirende DNA og efterfølgende mærket med azidholdige fluorescerende farvestoffer via klikkemi. EdU-mærkning kan således bruges til at overvåge native virusreplikationskinetik af DNA-vira eller vira med DNA-skabeloner til replikation<...

Mens tusindvis af kommercielle antistoffer er tilgængelige til specifikt at mærke proteiner via konventionelle immunostaining-tilgange, og mens fusionsproteiner kan konstrueres med fotooptimerede fluorescerende tags til sporing af flere proteiner i en prøve1, er mikroskopisk visualisering af protein ofte ikke kompatibel med konventionel DNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH)2 . Tekniske begrænsninger i samtidig visualisering af DNA, RNA og protein ved hjælp af fluorescensbaserede tilgange har hindret en dybdegående forståelse af virusreplikation. Sporing af både viral nukleinsyre og protein i løbet af infektionen gør det muligt for virologer at visualisere grundlæggende processer, der ligger under virusreplikation og samling 3,4,5,6.
Vi har udviklet en billeddannelsesmetode, multiplex immunofluorescerende cell-baseret detektion af DNA, RNA og Protein (MICDDRP)3, som anvender forgrenet DNA (bDNA) in situ-teknologi til at forbedre følsomheden af nukleinsyredetektion 7,8,9 . Derudover bruger denne metode parrede sonder til forbedret specificitet. bDNA-sekvensspecifikke sonder bruger forgrenede forforstærker- og forstærker-DNA'er til at producere et intenst og lokaliseret signal, hvilket forbedrer tidligere hybridiseringsmetoder, der var afhængige af at målrette gentagne regioner i DNA9. Inficerede celler i en klinisk sammenhæng indeholder ofte ikke rigeligt viralt genetisk materiale, hvilket giver en vare til en følsom metode til påvisning af fluorescerende nukleinsyre i diagnostiske omgivelser. Kommercialiseringen af bDNA-teknologi gennem tilgange som RNAscope7 og ViewRNA10 har fyldt denne niche. Følsomheden af bDNA-fluorescensbilleddannelse har også vigtig nytteværdi i cellebiologi, hvilket muliggør påvisning af knappe nukleinsyrearter i cellekulturmodeller. Den store forbedring af følsomheden gør bDNA-baserede billeddannelsesmetoder egnede til at studere vira. En potentiel mangel er imidlertid, at disse metoder fokuserer på visualisering af RNA eller RNA og protein. Alle replikerende celler og mange vira har DNA-genomer eller danner DNA under deres replikationscyklus, hvilket gør metoder, der er i stand til at billeddanne både RNA og DNA samt protein, meget ønskelige.
I MICDDRP-protokollen udfører vi bDNA FISH til påvisning af viral nukleinsyre ved hjælp af RNAscope-metoden med modifikationer7. En af de største ændringer i denne protokol er optimering af proteasebehandling efter kemisk fiksering. Proteasebehandling letter fjernelse af proteiner bundet til nukleinsyre for at forbedre sondehybridiseringseffektiviteten. Proteasebehandling efterfølges af inkubation med forgrenet oligonukleotidprobe(r). Efter påføring af bDNA-sonde(r) vaskes prøver og inkuberes efterfølgende med signalforforstærker- og forstærker-DNA'er. Multiplexed in situ hybridisering (ISH), mærkning af flere genmål, kræver målprober med forskellige farvekanaler til spektral differentiering7. Inkubation med DNA-forstærkere efterfølges af immunfluorescens (IF).
bDNA ISH giver forbedringer i signal-til-støj ved forstærkning af målspecifikke signaler med en reduktion til baggrundsstøj fra ikke-specifikke hybridiseringshændelser 7,11. Målprober er designet ved hjælp af softwareprogrammer, der er offentligt tilgængelige, der forudsiger sandsynligheden for ikke-specifikke hybridiseringshændelser samt beregner smeltetemperaturen (Tm) for sondemålhybriden 7,11. Målprober indeholder en 18- til 25-baseregion, der supplerer mål-DNA/RNA-sekvensen, en afstandssekvens og en 14-base halesekvens. Et par målprober, hver med en særskilt halesekvens, hybridiseres til en målregion (spænder over ~ 50 baser). De to halesekvenser danner et hybridiseringssted for forforstærkersonderne, som indeholder 20 bindingssteder for forstærkersonderne, som desuden indeholder 20 bindingssteder til etiketproben. Som et eksempel er en kilobase (kb) region på nukleinsyremolekylet målrettet af 20 sondepar, hvilket skaber et molekylært stillads til sekventiel hybridisering med forforstærkeren, forstærkeren og etiketproben. Dette kan således føre til et teoretisk udbytte på 8000 fluorescerende etiketter pr. nukleinsyremolekyle, hvilket muliggør påvisning af enkeltmolekyler og store forbedringer i forhold til konventionelle FISH-tilgange7 (Se figur 1A for skematisk bDNA-signalforstærkning). For at oprette sonder til multiplekset ISH skal hver målsonde være i en anden farvekanal (C1, C2 eller C3). Disse målprober med forskellige farvekanaler har forskellige 14-base halesekvenser. Disse halesekvenser vil binde forskellige signalforstærkere med forskellige fluorescerende sonder, hvilket muliggør letkøbt spektral differentiering på tværs af flere mål. I den præsenterede protokol, tabel 4 i trin 9, gives yderligere oplysninger om fluorescerende mærkning af målsonder. Derudover giver figur 2 og figur 3 eksempler på, hvordan vi valgte den passende forstærker 4-FL (A, B eller C) (fluorescerende sonde og det endelige hybridiseringstrin) for at opnå specifik fluorescerende mærkning af multipel viral nukleinsyremål efter HIV-1- og HTLV-1-infektioner.
Vi har demonstreret flere anvendelser af samtidig fluorescensvisualisering af RNA, DNA og proteiner og observeret kritiske stadier af virusreplikation med høj spatiotemporal opløsning 3,4,5. For eksempel har samtidig enkeltcellevisualisering af viralt RNA, cytoplasmatisk og nukleært DNA og protein gjort det muligt for os at visualisere nøglehændelser under HIV-1-infektion, herunder efter RNA-holdige kerner i cytoplasmaet inden nuklear indgang og integration af proviralt DNA3. Derudover har vi anvendt MICDDRP til at karakterisere virkningerne af værtsfaktorer og lægemiddelbehandling på virusinfektion og replikation 4,5. I Ukah et al. sporede vi reaktivering af HIV-1-transkription i latenscellemodeller behandlet med forskellige latens-reverseringsmidler for at visualisere HIV-transkription og latenstidsvending4. Derudover kan MICDDRP give os mulighed for at visualisere fænotypiske ændringer forbundet med antiviral hæmning, der tilskrives behandling af små molekyler eller værtsfaktorbegrænsning. Som et bevis på robustheden og den brede anvendelighed af vores tilgang har vi demonstreret, at vi kan bruge ændringer af vores protokol til effektivt at mærke viral nukleinsyre til at følge infektion ikke kun i human immundefektvirus (HIV)-1, men også human T-lymfotropisk virus (HTLV)-1, hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV), Zikavirus (ZIKV) og influenza A-virus (IAV). Da HIV-1-livscyklussen består af både viralt DNA og RNA-arter, har vi udført størstedelen af vores optimering af MICDDRP efter HIV-1-replikationskinetik. Derudover har vi imidlertid vist, at vi kan spore syntese af forskellige virale RNA-transkripter af enten eller både sans (+) og antisense (-) strandethed i vira som ZIKV, IAV, HBV og HCV for at overvåge viral transkription og replikation 3,4,5,6. Undersøgelserne sigter mod at forbedre den mekanistiske forståelse af flere virale processer og tjene som en retningslinje for at implementere denne fluorescensbilleddannelsesteknologi til en bred vifte af cellulære modeller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% dextran sulfate</td>
			<td>Amreso</td>
			<td>198</td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X wash buffer</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>320058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 1-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 2-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 3-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 4-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Consult Amp-4 table in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HCV NS5a antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13833</td>
			<td>Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mov10 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80613</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PB1 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX125923</td>
			<td>Antibody against flu protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking reagent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell media with supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Media appropriate for cell model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td>No calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand colorfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-17/18/19</td>
			<td>Precleaned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCV-GT2a-sense-C2 probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441371</td>
			<td>HCV(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-gagpol-C1</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317701</td>
			<td>HIV-1 cDNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-nongagpol-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317711-C</td>
			<td>HIV-1 RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ hybridization oven</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>321710/321720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-d-lysine (PDL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Coat coverslips in 20 &#181;g/mL of PDL for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe diluent</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>300041</td>
			<td>For diluting RNA C2 or C3 probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease III</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>322337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope&#174;&#160;Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate, pH 6.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer and PBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441351</td>
			<td>Total HBV RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD-01-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>465531-C2</td>
			<td>HBV pgRNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HCV-GT2a probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441361</td>
			<td>HCV(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV-HBZ-sense-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495071-C3</td>
			<td>HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495051-C2</td>
			<td>HTLV-1 DNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-POL-sense</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495061</td>
			<td>HTLV-1 (+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td>IAV RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>464531</td>
			<td>Zika(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2-sense-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>478731-C2</td>
			<td>Zika(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell multiplexed fluorescence imaging to visualize viral nucleic acids and proteins and monitor hiv, htlv, hbv, hcv, zika virus, and influenza infection

Fangst af de dynamiske replikations- og samlingsprocesser af vira er blevet forhindret af manglen på robuste in situ-hybridiseringsteknologier (ISH), der muliggør følsom og samtidig mærkning af viral nukleinsyre og protein. Konventionelle DNA-fluorescens in situ-hybridiseringsmetoder (FISH) er ofte ikke kompatible med immunfarvning. Vi har derfor udviklet en billeddannelsesmetode, MICDDRP (multiplex immunofluorescerende cell-baseret detektion af DNA, RNA og protein), som muliggør samtidig enkeltcellevisualisering af DNA, RNA og protein. Sammenlignet med konventionel DNA-FISK bruger micddrp forgrenet DNA (bDNA) ISH-teknologi, hvilket dramatisk forbedrer oligonukleotidsondefølsomhed og detektion. Små modifikationer af MICDDRP muliggør billeddannelse af virale proteiner samtidig med nukleinsyrer (RNA eller DNA) af forskellig strenghed. Vi har anvendt disse protokoller til at studere livscyklusserne for flere virale patogener, herunder human immundefektvirus (HIV)-1, human T-lymfotropisk virus (HTLV)-1, hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV), Zika-virus (ZKV) og influenza A-virus (IAV). Vi demonstrerede, at vi effektivt kan mærke virale nukleinsyrer og proteiner på tværs af en bred vifte af vira. Disse undersøgelser kan give os en forbedret mekanistisk forståelse af flere virale systemer og derudover tjene som en skabelon til anvendelse af multiplekset fluorescensbilleddannelse af DNA, RNA og protein på tværs af et bredt spektrum af cellulære systemer.

Et skema over MICDDRP er afbildet i figur 1. Mærkning af DNA og RNA efterfølges af immunostaining. Brugen af forgreningsforstærkere øger signalet, hvilket muliggør påvisning af enkeltnukleinsyremolekyler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61843/61843fig1v5.jpg"> Figur 1: Skematisk over MICDDRP og trin-for-trin arbejdsgang. (A) bDNA-signal forstærkes via forgren...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infectio

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Præsenteret her er en protokol for en fluorescensbilleddannelsesmetode, multiplex i mmunofluorescerende cell-baseret detektion af DNA, RNA og protein (MICDDRP), en metode, der er istand til samtidig fluorescens enkeltcellevisualisering af viralt protein og nukleinsyrer af forskellig type og strandethed. Denne tilgang kan anvendes på en bred vifte af systemer.

Enkeltcellet multiplexed fluorescensbilleddannelse for at visualisere virale nukleinsyrer og proteiner og overvåge HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus og influenzainfektion

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Kemisk blokeret antistof Microarray for Multiplexed Højkapacitetsforskning Profilering af specifikke protein Glycosylering i komplekse prøver

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sekvens-specifik mærkning af nukleinsyrer og proteiner med methyltransferaser og cofaktor Analoger

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering af nukleinsyrer: en enkel og hurtig DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Funktionel billeddannelse af Viral transskription fabrikker ved hjælp af 3D Fluorescens mikroskopi

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Enkelt celle mikro-aspiration som en alternativ strategi for fluorescens-aktiverede celle sortering for Giant virus blanding adskillelse

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Udforskning af m6A og m5C Epitranscriptomes om virusinfektion: et eksempel med HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...