Name: single-cell multiplexed fluorescence imaging to visualize viral nucleic acids and proteins and monitor hiv, htlv, hbv, hcv, zika virus, and influenza infection
Uploaded: 2020-10-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infectio

Dit werk werd geheel of gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 en U54 AI150472). We bedanken Dr. Raymond F. Schinazi en Sadie Amichai voor het leveren van cellen die zijn geïnfecteerd met influenza A-virus.

1. Zaadcellen (suspensie versus aanhangende cellen) op coverslips of kamerdia's (protocol gepresenteerd maakt gebruik van coverslips).
<ol><li>Zaaien van suspensiecellen<ol><li>Bereid poly-D-lysine (PDL) gecoate coverslips (vergemakkelijkt de hechting van suspensiecellen aan coverslip) door eerst coverslips in ethanol (EtOH) gedurende 5 minuten te broeden (steriliseert coverslips en verwijdert eventuele resten). Was vervolgens 2x in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voordat u coverslips in PDL (20 μg / m...

<ol>
	<li>Zheng, Q., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+photostable+fluorophores+for+molecular+imaging.">Development of photostable fluorophores for molecular imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).</li><li>Marini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Puray-Chavez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-cell+visualization+of+nucleic+acids+and+protein+during+HIV+infection.">Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection.</a> Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).</li><li>Ukah, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+HIV-1+RNA+Transcription+from+Integrated+HIV-1+DNA+in+Reactivated+Latently+Infected+Cells.">Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells.</a> Viruses. 10 (10), (2018).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Positive+and+Negative+Sense+Viral+RNA+for+Probing+the+Mechanism+of+Direct-Acting+Antivirals+against+Hepatitis+C+Virus.">Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus.</a> Viruses. 11 (11), (2019).</li><li>Achuthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid-CPSF6+Interaction+Licenses+Nuclear+HIV-1+Trafficking+to+Sites+of+Viral+DNA+Integration.">Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+detection+of+RNA+using+MERFISH+and+branched+DNA+amplification.">Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li><li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution.">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li><li>Bushnell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProbeDesigner:+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+(bDNA)+signal+amplification+assays.">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li><li>Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+HIV-1+Genomic+DNA+from+Entry+through+Productive+Infection.">Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection.</a> Journal of Virology. 91 (9), (2017).</li><li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells.">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26 (1), 10-18 (2002).</li><li>Francis, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+replication+complexes+accumulate+in+nuclear+speckles+and+integrate+into+speckle-associated+genomic+domains.">HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains.</a> Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).</li><li>Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+blockade+reveals+that+HIV-1+completes+reverse+transcription+and+uncoating+in+the+nucleus.">Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus.</a> Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).</li></ol>

Gelijktijdige visualisatie van RNA, DNA en eiwit vereist vaak uitgebreide optimalisatie. Twee veelgebruikte methoden zijn 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) labeling en DNA FISH. EdU-etikettering is toegepast om viraal DNA en eiwit tegelijkertijd te visualiseren, omdat EdU wordt opgenomen in ontluikend DNA en vervolgens wordt gelabeld met azide-bevattende fluorescerende kleurstoffen via klikchemie. EdU-etikettering kan dus worden gebruikt om native virusreplicatiekinetiek van DNA-virussen of virussen te monitoren me...

Hoewel er duizenden commerciële antilichamen beschikbaar zijn om eiwitten specifiek te labelen via conventionele immunostaining-benaderingen, en terwijl fusie-eiwitten kunnen worden ontworpen met foto-geoptimaliseerde fluorescerende tags voor het volgen van meerdere eiwitten in een monster1, is microscopische visualisatie van eiwit vaak niet compatibel met conventionele DNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)2 . Technische beperkingen in gelijktijdige visualisatie van DNA, RNA en eiwit met behulp van op fluorescentie gebaseerde benaderingen hebben een diepgaand begrip van virusreplicatie belemmerd. Door zowel viraal nucleïnezuur als eiwit in de loop van de infectie te volgen, kunnen virologen fundamentele processen visualiseren die ten grondslag liggen aan virusreplicatie en assemblage 3,4,5,6.
We hebben een beeldvormingsbenadering ontwikkeld, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en Protein (MICDDRP)3, die gebruik maakt van vertakte DNA (bDNA) in situ technologie om de gevoeligheid van nucleïnezuurdetectie te verbeteren 7,8,9 . Bovendien maakt deze methode gebruik van gepaarde sondes voor verbeterde specificiteit. bDNA-sequentiespecifieke sondes gebruiken vertakkende voorversterker en versterker-DNA's om een intens en gelokaliseerd signaal te produceren, ter verbetering van eerdere hybridisatiemethoden die afhankelijk waren van het richten op herhaalde gebieden in het DNA9. Geïnfecteerde cellen in een klinische context bevatten vaak geen overvloedig viraal genetisch materiaal, wat een grondstof vormt voor een gevoelige methode voor fluorescente nucleïnezuurdetectie in diagnostische omgevingen. De commercialisering van bDNA-technologie door middel van benaderingen zoals RNAscope7 en ViewRNA10 hebben deze niche opgevuld. De gevoeligheid van bDNA-fluorescentiebeeldvorming heeft ook een belangrijk nut in de celbiologie, waardoor schaarse nucleïnezuursoorten in celkweekmodellen kunnen worden gedetecteerd. De enorme verbetering van de gevoeligheid maakt op bDNA gebaseerde beeldvormingsmethoden geschikt voor het bestuderen van virussen. Een mogelijke tekortkoming is echter dat deze methoden zich richten op het visualiseren van RNA of RNA en eiwit. Alle replicerende cellen en veel virussen hebben DNA-genomen of vormen DNA tijdens hun replicatiecyclus, waardoor methoden die in staat zijn om zowel RNA als DNA, evenals eiwitten, in beeld te brengen, zeer wenselijk zijn.
In het MICDDRP-protocol voeren we bDNA FISH uit voor detectie van viraal nucleïnezuur met behulp van de RNAscope-methode, met wijzigingen7. Een van de belangrijkste wijzigingen in dit protocol is optimalisatie van proteasebehandeling na chemische fixatie. Proteasebehandeling vergemakkelijkt de verwijdering van eiwitten gebonden aan nucleïnezuur om de hybridisatie-efficiëntie van de sonde te verbeteren. Proteasebehandeling wordt gevolgd door incubatie met vertakte oligonucleotide-sonde(s). Na het aanbrengen van bDNA-sonde(s) worden monsters gewassen en vervolgens geïncubeerd met signaalvoorversterker en versterker-DNA's. Multiplexed in situ hybridization (ISH), labeling van meerdere gendoelen, vereist doelsondes met verschillende kleurkanalen voor spectrale differentiatie7. Incubatie met DNA-versterkers wordt gevolgd door immunofluorescentie (IF).
bDNA ISH verleent verbeteringen in signaal-naar-ruis door versterking van doelspecifieke signalen, met een vermindering van achtergrondruis van niet-specifieke hybridisatiegebeurtenissen 7,11. Doelsondes zijn ontworpen met behulp van softwareprogramma's die openbaar beschikbaar zijn en die de waarschijnlijkheid van niet-specifieke hybridisatiegebeurtenissen voorspellen en de smelttemperatuur (Tm) van de probe-target hybride 7,11 berekenen. Doelsondes bevatten een 18- tot 25-basengebied dat complementair is aan de doel-DNA / RNA-sequentie, een spacer-sequentie en een 14-base staartsequentie. Een paar doelsondes, elk met een verschillende staartsequentie, hybridiseren naar een doelgebied (verspreid over ~ 50 bases). De twee staartsequenties vormen een hybridisatieplaats voor de voorversterkersondes, die 20 bindingsplaatsen voor de versterkersondes bevatten, die bovendien 20 bindingsplaatsen voor de labelsonde bevatten. Als voorbeeld, een gebied van één kilobase (kb) op het nucleïnezuurmolecuul wordt gericht door 20 sondeparen, waardoor een moleculaire steiger ontstaat voor sequentiële hybridisatie met de voorversterker, versterker en labelsonde. Dit kan dus leiden tot een theoretische opbrengst van 8000 fluorescerende labels per nucleïnezuurmolecuul, waardoor detectie van afzonderlijke moleculen en enorme verbeteringen ten opzichte van conventionele FISH-benaderingen7 mogelijk worden (zie figuur 1A voor schematische bDNA-signaalversterking). Als u sondes wilt instellen voor gemultiplexte ISH, moet elke doelsonde zich in een ander kleurkanaal bevinden (C1, C2 of C3). Deze doelsondes met verschillende kleurkanalen bezitten verschillende 14-base staartsequenties. Deze staartsequenties binden verschillende signaalversterkers met verschillende fluorescerende sondes, waardoor gemakkelijke spectrale differentiatie over meerdere doelen mogelijk wordt. In het gepresenteerde protocol, tabel 4 in stap 9, vindt u meer informatie over fluorescerend labelende doelsondes. Daarnaast geven figuur 2 en figuur 3 voorbeelden van hoe we de juiste versterker 4-FL (A, B of C) (fluorescerende sonde en de laatste hybridisatiestap) hebben gekozen om specifieke fluorescerende etikettering van meerdere virale nucleïnezuurdoelen na HIV-1- en HTLV-1-infecties te bereiken.
We hebben verschillende toepassingen van gelijktijdige fluorescentievisualisatie van RNA, DNA en eiwitten gedemonstreerd, waarbij kritieke stadia van virusreplicatie met een hoge spatiotemporale resolutie 3,4,5 werden waargenomen. Bijvoorbeeld, gelijktijdige eencellige visualisatie van viraal RNA, cytoplasmatisch en nucleair DNA en eiwit hebben ons in staat gesteld om belangrijke gebeurtenissen tijdens HIV-1-infectie te visualiseren, waaronder het volgen van RNA-bevattende kernen in het cytoplasma voorafgaand aan nucleaire binnenkomst en integratie van proviraal DNA3. Daarnaast hebben we MICDDRP toegepast om de effecten van gastheerfactoren en medicamenteuze behandeling op virale infectie en replicatiete karakteriseren 4,5. In Ukah et al. volgden we reactivering van HIV-1-transcriptie in latentiecelmodellen die werden behandeld met verschillende latentie-omkeermiddelen om HIV-transcriptie en latentieomkering te visualiseren4. Bovendien kan MICDDRP ons in staat stellen om fenotypische veranderingen geassocieerd met antivirale remming toegeschreven aan behandeling van kleine moleculen of gastheerfactorbeperking te visualiseren. Als een proof of concept voor de robuustheid en brede toepasbaarheid van onze aanpak, hebben we aangetoond dat we wijzigingen van ons protocol kunnen gebruiken om viraal nucleïnezuur efficiënt te labelen om infectie te volgen, niet alleen in humaan immunodeficiëntievirus (HIV) -1, maar ook humaan T-lymfotroop virus (HTLV) -1, hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV), Zikavirus (ZIKV) en influenza A-virus (IAV). Omdat de HIV-1-levenscyclus bestaat uit zowel viraal DNA- als RNA-soorten, hebben we het grootste deel van onze optimalisatie van MICDDRP uitgevoerd na hiv-1-replicatiekinetiek. Daarnaast hebben we echter aangetoond dat we de synthese van verschillende virale RNA-transcripten van een of beide zintuig (+) en antisense (-) strandedness in virussen zoals ZIKV, IAV, HBV en HCV kunnen volgen om virale transcriptie en replicatie te controleren 3,4,5,6. De studies zijn gericht op het verbeteren van het mechanistische begrip van verschillende virale processen en dienen als richtlijn om deze fluorescentiebeeldvormingstechnologie te implementeren in een breed scala aan cellulaire modellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% dextran sulfate</td>
			<td>Amreso</td>
			<td>198</td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X wash buffer</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>320058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 1-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 2-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 3-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 4-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Consult Amp-4 table in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HCV NS5a antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13833</td>
			<td>Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mov10 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80613</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PB1 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX125923</td>
			<td>Antibody against flu protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking reagent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell media with supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Media appropriate for cell model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td>No calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand colorfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-17/18/19</td>
			<td>Precleaned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCV-GT2a-sense-C2 probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441371</td>
			<td>HCV(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-gagpol-C1</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317701</td>
			<td>HIV-1 cDNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-nongagpol-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317711-C</td>
			<td>HIV-1 RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ hybridization oven</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>321710/321720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-d-lysine (PDL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Coat coverslips in 20 &#181;g/mL of PDL for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe diluent</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>300041</td>
			<td>For diluting RNA C2 or C3 probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease III</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>322337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope&#174;&#160;Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate, pH 6.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer and PBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441351</td>
			<td>Total HBV RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD-01-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>465531-C2</td>
			<td>HBV pgRNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HCV-GT2a probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441361</td>
			<td>HCV(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV-HBZ-sense-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495071-C3</td>
			<td>HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495051-C2</td>
			<td>HTLV-1 DNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-POL-sense</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495061</td>
			<td>HTLV-1 (+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td>IAV RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>464531</td>
			<td>Zika(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2-sense-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>478731-C2</td>
			<td>Zika(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell multiplexed fluorescence imaging to visualize viral nucleic acids and proteins and monitor hiv, htlv, hbv, hcv, zika virus, and influenza infection

Het vastleggen van de dynamische replicatie- en assemblageprocessen van virussen is belemmerd door het ontbreken van robuuste in situ hybridisatie (ISH) -technologieën die gevoelige en gelijktijdige etikettering van viraal nucleïnezuur en eiwit mogelijk maken. Conventionele DNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) methoden zijn vaak niet compatibel met immunostaining. We hebben daarom een beeldvormingsbenadering ontwikkeld, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA en protein), die gelijktijdige eencellige visualisatie van DNA, RNA en eiwit mogelijk maakt. In vergelijking met conventionele DNA FISH maakt MICDDRP gebruik van vertakte DNA (bDNA) ISH-technologie, die de gevoeligheid en detectie van oligonucleotide-sondes drastisch verbetert. Kleine modificaties van MICDDRP maken beeldvorming van virale eiwitten mogelijk gelijktijdig met nucleïnezuren (RNA of DNA) van verschillende strengen. We hebben deze protocollen toegepast om de levenscyclus van meerdere virale pathogenen te bestuderen, waaronder humaan immunodeficiëntievirus (HIV)-1, humaan T-lymfotroop virus (HTLV)-1, hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV), Zika-virus (ZKV) en influenza A-virus (IAV). We hebben aangetoond dat we virale nucleïnezuren en eiwitten efficiënt kunnen labelen voor een breed scala aan virussen. Deze studies kunnen ons een verbeterd mechanistisch begrip geven van meerdere virale systemen en bovendien dienen als een sjabloon voor de toepassing van multiplexed fluorescentie beeldvorming van DNA, RNA en eiwit over een breed spectrum van cellulaire systemen.

Een schema van MICDDRP is weergegeven in figuur 1. Labeling van DNA en RNA wordt gevolgd door immunostaining. Het gebruik van vertakkende versterkers verhoogt het signaal, waardoor detectie van enkele nucleïnezuurmoleculen mogelijk is.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61843/61843fig1v5.jpg"> Figuur 1: Schema van MICDDRP en stapsgewijze workflow. (A) het bDNA-signaal wordt ve...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infectio

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een fluorescentiebeeldvormingsbenadering, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en protein (MICDDRP), een methode die in staat is tot gelijktijdige fluorescentie eencellige visualisatie van virale eiwitten en nucleïnezuren van verschillende type en gestrandheid. Deze aanpak kan worden toegepast op een breed scala aan systemen.

Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

Zuivering en Visualisatie van Influenza A Viral ribonucleoproteïne Complexen

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

NanoDrop microvolume Kwantificering van nucleïnezuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Concentratie Bepaling van nucleïnezuren en eiwitten Met behulp van de Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sequentie-specifieke Labeling van nucleïnezuren en eiwitten met methyltransferases en Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Functionele beeldvorming van virale transcriptie fabrieken met behulp van 3D fluorescentie microscopie

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Single cell micro-aspiratie als alternatieve strategie voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering voor scheiding van gigantische virus mengsels

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Onderzoek naar m6A en m5C epitranscriptomen bij virale infectie: een voorbeeld met HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...