Name: single-cell multiplexed fluorescence imaging to visualize viral nucleic acids and proteins and monitor hiv, htlv, hbv, hcv, zika virus, and influenza infection
Uploaded: 2020-10-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infectio

Dette arbeidet ble støttet helt eller delvis av National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 og U54 AI150472). Vi takker Dr. Raymond F. Schinazi og Sadie Amichai for å gi celler infisert med influensa A-virus.

1. Frøceller (Suspension vs. Adherent Cells) på coverslips eller kammer lysbilder (protokoll presentert bruker coverslips).
<ol><li>Såing av suspensjonsceller<ol><li>Forbered poly-D-lysin (PDL) belagte dekselslips (letter overholdelse av suspensjonsceller til dekkslip) ved først å inkubere deksler i etanol (EtOH) i 5 minutter (steriliserer deksler og fjerner eventuelle rester). Vask deretter 2x i fosfatbufret saltvann (PBS) før du inkuberer deksler i PDL (20 μg/ml) i 30 minutter (min) ved romtemperatur ...

<ol>
	<li>Zheng, Q., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+photostable+fluorophores+for+molecular+imaging.">Development of photostable fluorophores for molecular imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).</li><li>Marini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Puray-Chavez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-cell+visualization+of+nucleic+acids+and+protein+during+HIV+infection.">Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection.</a> Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).</li><li>Ukah, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+HIV-1+RNA+Transcription+from+Integrated+HIV-1+DNA+in+Reactivated+Latently+Infected+Cells.">Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells.</a> Viruses. 10 (10), (2018).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Positive+and+Negative+Sense+Viral+RNA+for+Probing+the+Mechanism+of+Direct-Acting+Antivirals+against+Hepatitis+C+Virus.">Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus.</a> Viruses. 11 (11), (2019).</li><li>Achuthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid-CPSF6+Interaction+Licenses+Nuclear+HIV-1+Trafficking+to+Sites+of+Viral+DNA+Integration.">Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+detection+of+RNA+using+MERFISH+and+branched+DNA+amplification.">Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li><li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution.">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li><li>Bushnell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProbeDesigner:+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+(bDNA)+signal+amplification+assays.">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li><li>Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+HIV-1+Genomic+DNA+from+Entry+through+Productive+Infection.">Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection.</a> Journal of Virology. 91 (9), (2017).</li><li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells.">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26 (1), 10-18 (2002).</li><li>Francis, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+replication+complexes+accumulate+in+nuclear+speckles+and+integrate+into+speckle-associated+genomic+domains.">HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains.</a> Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).</li><li>Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+blockade+reveals+that+HIV-1+completes+reverse+transcription+and+uncoating+in+the+nucleus.">Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus.</a> Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).</li></ol>

Samtidig visualisering av RNA, DNA og protein krever ofte omfattende optimalisering. To vanlige metoder er 5-etynyl-2-deoksyuridin (EdU) merking og DNA FISH. EdU-merking har blitt brukt til å visualisere viralt DNA og protein samtidig, da EdU er innlemmet i begynnende DNA og deretter merket med azidholdige fluorescerende fargestoffer via klikkkjemi. EdU-merking kan dermed brukes til å overvåke innfødt virusreplikasjonskinetikk av DNA-virus eller virus med DNA-maler for replikasjon12. ...

Mens tusenvis av kommersielle antistoffer er tilgjengelige for å spesifikt merke proteiner via konvensjonelle immunostaining-tilnærminger, og mens fusjonsproteiner kan konstrueres med fotooptimaliserte fluorescerende koder for sporing av flere proteiner i en prøve1, er mikroskopisk visualisering av protein ofte ikke kompatibel med konvensjonell DNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH)2 . Tekniske begrensninger i samtidig visualisering av DNA, RNA og protein ved hjelp av fluorescensbaserte tilnærminger har hindret grundig forståelse av virusreplikasjon. Sporing av både viral nukleinsyre og protein i løpet av infeksjonen gjør det mulig for virologer å visualisere grunnleggende prosesser som ligger under virusreplikasjon og montering 3,4,5,6.
Vi har utviklet en avbildningstilnærming, multiplex immunofluorescerende cell-basert d-eteksjon av DNA, RNA og Protein (MICDDRP)3, som benytter forgrenet DNA (bDNA) in situ-teknologi for å forbedre følsomheten til nukleinsyredeteksjon 7,8,9 . I tillegg bruker denne metoden parrede sonder for forbedret spesifisitet. bDNA-sekvensspesifikke sonder bruker forgreningsforforsterker og forsterker-DNA for å produsere et intenst og lokalisert signal, og forbedrer tidligere hybridiseringsmetoder som var avhengige av å målrette gjentatte regioner i DNA9. Infiserte celler i en klinisk sammenheng inneholder ofte ikke rikelig viralt genetisk materiale, noe som gir en vare for en sensitiv metode for fluorescerende nukleinsyredeteksjon i diagnostiske innstillinger. Kommersialiseringen av bDNA-teknologi gjennom tilnærminger som RNAscope7 og ViewRNA10 har fylt denne nisjen. Følsomheten til bDNA-fluorescensavbildning har også viktig nytte i cellebiologi, noe som gjør det mulig å oppdage knappe nukleinsyrearter i cellekulturmodeller. Den store forbedringen av følsomhet gjør bDNA-baserte bildebehandlingsmetoder egnet for å studere virus. En potensiell mangel er imidlertid at disse metodene fokuserer på å visualisere RNA eller RNA og protein. Alle replikerende celler og mange virus har DNA-genomer eller danner DNA under replikasjonssyklusen, noe som gjør metoder som er i stand til å avbilde både RNA og DNA, samt protein, svært ønskelige.
I MICDDRP-protokollen utfører vi bDNA FISH for påvisning av viral nukleinsyre ved hjelp av RNAscope-metoden, med modifikasjoner7. En av de viktigste modifikasjonene i denne protokollen er optimalisering av proteasebehandling etter kjemisk fiksering. Proteasebehandling letter fjerning av proteiner bundet til nukleinsyre for å forbedre sondehybridiseringseffektiviteten. Proteasebehandling etterfølges av inkubasjon med forgrenet oligonukleotidsonde(r). Etter påføring av bDNA-sonde(r) vaskes prøvene og inkuberes deretter med signalforforsterker og forsterker-DNA-er. Multiplekset in situ hybridisering (ISH), merking av flere genmål, krever målprober med forskjellige fargekanaler for spektral differensiering7. Inkubasjon med DNA-forsterkere etterfølges av immunfluorescens (IF).
bDNA ISH gir forbedringer i signal-til-støy ved forsterkning av målspesifikke signaler, med en reduksjon til bakgrunnsstøy fra ikke-spesifikke hybridiseringshendelser 7,11. Målprober er designet ved hjelp av programvare som er offentlig tilgjengelig som forutsier sannsynligheten for ikke-spesifikke hybridiseringshendelser, samt beregner smeltetemperatur (Tm) for sondemålshybriden 7,11. Målprober inneholder en 18- til 25-baseregion som er komplementær til mål-DNA / RNA-sekvensen, en avstandssekvens og en 14-basehalesekvens. Et par målprober, hver med en distinkt halesekvens, hybridiserer til et målområde (spenner over ~ 50 baser). De to halesekvensene danner et hybridiseringssted for forforsterkerprobene, som inneholder 20 bindingssteder for forsterkerprobene, som i tillegg inneholder 20 bindingssteder for etikettsonden. Som et eksempel er en kilobase (kb) region på nukleinsyremolekylet målrettet av 20 sondepar, og skaper et molekylært stillas for sekvensiell hybridisering med forforsterkeren, forsterkeren og etikettsonden. Dette kan dermed føre til et teoretisk utbytte på 8000 fluorescerende etiketter per nukleinsyremolekyl, noe som muliggjør påvisning av enkeltmolekyler og store forbedringer i forhold til konvensjonelle FISH-tilnærminger7 (Se figur 1A for skjematisk av bDNA-signalforsterkning). Hvis du vil definere sonder for multiplekset ISH, må hver målsonde være i en annen fargekanal (C1, C2 eller C3). Disse målprobene med forskjellige fargekanaler har forskjellige 14-baserte halesekvenser. Disse halesekvensene vil binde distinkte signalforsterkere med forskjellige fluorescerende sonder, og dermed muliggjøre lettvint spektral differensiering på tvers av flere mål. I den presenterte protokollen, tabell 4 i trinn 9, finner du ytterligere informasjon om fluorescerende merking av målprober. I tillegg gir figur 2 og figur 3 eksempler på hvordan vi valgte riktig forsterker 4-FL (A, B eller C) (fluorescerende sonde & det endelige hybridiseringstrinnet) for å oppnå spesifikk fluorescerende merking av flere virale nukleinsyremål etter HIV-1- og HTLV-1-infeksjoner.
Vi har demonstrert flere anvendelser av samtidig fluorescensvisualisering av RNA, DNA og proteiner, og observert kritiske stadier av virusreplikasjon med høy spatiotemporal oppløsning 3,4,5. For eksempel har samtidig encellet visualisering av viralt RNA, cytoplasmatisk og nukleært DNA og protein gjort det mulig for oss å visualisere viktige hendelser under HIV-1-infeksjon, inkludert følgende RNA-inneholdende kjerner i cytoplasma før nukleær inngang og integrering av proviralt DNA3. I tillegg har vi brukt MICDDRP til å karakterisere effekten av vertsfaktorer og medikamentell behandling på virusinfeksjon og replikasjon 4,5. I Ukah et al. sporet vi reaktivering av HIV-1-transkripsjon i latenscellemodeller behandlet med forskjellige latens-reverseringsmidler for å visualisere HIV-transkripsjon og latensreversering4. I tillegg kan MICDDRP tillate oss å visualisere fenotypiske endringer assosiert med antiviral inhibering som tilskrives småmolekylær behandling eller vertsfaktorbegrensning. Som et bevis på robustheten og den brede anvendeligheten av vår tilnærming, har vi vist at vi kan bruke modifikasjoner av protokollen vår til effektivt å merke viral nukleinsyre for å følge infeksjon, ikke bare i humant immunsviktvirus (HIV) -1, men også humant T-lymfotropisk virus (HTLV) -1, hepatitt B-virus (HBV), hepatitt C-virus (HCV), Zikavirus (ZIKV), og influensa A-virus (IAV). Siden HIV-1-livssyklusen består av både virale DNA- og RNA-arter, har vi utført størstedelen av vår optimalisering av MICDDRP etter HIV-1-replikasjonskinetikk. I tillegg har vi imidlertid vist at vi kan spore syntese av forskjellige virale RNA-transkripsjoner av enten eller begge sense (+) og antisense (-) strandedness i virus som ZIKV, IAV, HBV og HCV for å overvåke viral transkripsjon og replikasjon 3,4,5,6. Studiene tar sikte på å forbedre den mekanistiske forståelsen av flere virale prosesser og tjene som en retningslinje for å implementere denne fluorescensbildeteknologien til et bredt spekter av cellulære modeller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% dextran sulfate</td>
			<td>Amreso</td>
			<td>198</td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X wash buffer</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>320058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 1-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 2-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 3-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 4-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Consult Amp-4 table in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HCV NS5a antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13833</td>
			<td>Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mov10 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80613</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PB1 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX125923</td>
			<td>Antibody against flu protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking reagent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell media with supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Media appropriate for cell model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td>No calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand colorfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-17/18/19</td>
			<td>Precleaned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCV-GT2a-sense-C2 probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441371</td>
			<td>HCV(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-gagpol-C1</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317701</td>
			<td>HIV-1 cDNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-nongagpol-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317711-C</td>
			<td>HIV-1 RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ hybridization oven</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>321710/321720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-d-lysine (PDL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Coat coverslips in 20 &#181;g/mL of PDL for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe diluent</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>300041</td>
			<td>For diluting RNA C2 or C3 probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease III</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>322337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope&#174;&#160;Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate, pH 6.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer and PBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441351</td>
			<td>Total HBV RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD-01-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>465531-C2</td>
			<td>HBV pgRNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HCV-GT2a probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441361</td>
			<td>HCV(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV-HBZ-sense-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495071-C3</td>
			<td>HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495051-C2</td>
			<td>HTLV-1 DNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-POL-sense</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495061</td>
			<td>HTLV-1 (+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td>IAV RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>464531</td>
			<td>Zika(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2-sense-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>478731-C2</td>
			<td>Zika(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell multiplexed fluorescence imaging to visualize viral nucleic acids and proteins and monitor hiv, htlv, hbv, hcv, zika virus, and influenza infection

Å fange de dynamiske replikasjons- og monteringsprosessene til virus har blitt hindret av mangelen på robuste in situ hybridiseringsteknologier (ISH) som muliggjør sensitiv og samtidig merking av viral nukleinsyre og protein. Konvensjonelle DNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH) metoder er ofte ikke kompatible med immunostaining. Vi har derfor utviklet en avbildningstilnærming, MICDDRP (multiplex immunofluorescerende cell-basert d-eteksjon av DNA, RNA og protein), som muliggjør samtidig encellet visualisering av DNA, RNA og protein. Sammenlignet med konvensjonell DNA-FISK BRUKER MICDDRP forgrenet DNA (bDNA) ISH-teknologi, noe som dramatisk forbedrer oligonukleotidsondens følsomhet og deteksjon. Små modifikasjoner av MICDDRP muliggjør avbildning av virale proteiner samtidig med nukleinsyrer (RNA eller DNA) med forskjellig strenghet. Vi har brukt disse protokollene til å studere livssyklusene til flere virale patogener, inkludert humant immunsviktvirus (HIV) -1, humant T-lymfotropisk virus (HTLV) -1, hepatitt B-virus (HBV), hepatitt C-virus (HCV), Zika-virus (ZKV) og influensa A-virus (IAV). Vi viste at vi effektivt kan merke virale nukleinsyrer og proteiner på tvers av et mangfoldig utvalg av virus. Disse studiene kan gi oss forbedret mekanistisk forståelse av flere virussystemer, og i tillegg tjene som en mal for anvendelse av multiplekset fluorescensavbildning av DNA, RNA og protein over et bredt spekter av cellulære systemer.

Et skjema over MICDDRP er avbildet i figur 1. Merking av DNA og RNA etterfølges av immunostaining. Bruken av forgreningsforsterkere øker signalet, noe som gjør det mulig å oppdage enkeltnukleinsyremolekyler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61843/61843fig1v5.jpg"> Figur 1: Skjematisk for MICDDRP og trinnvis arbeidsflyt. (A) bDNA-signalet forsterkes via forgrening...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infectio

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Presentert her er en protokoll for en fluorescensavbildningsmetode, multiplex i mmunofluorescerende cell-basert d-eteksjon av DNA, RNA og protein (MICDDRP), en metode som er istand til samtidig fluorescens enkeltcellevisualisering av viralt protein og nukleinsyrer av forskjellig type og strenghet. Denne tilnærmingen kan brukes på et mangfoldig utvalg av systemer.

Enkeltcellet multiplekset fluorescensavbildning for å visualisere virale nukleinsyrer og proteiner og overvåke HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus og influensainfeksjon

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Kjemisk-blokkert Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput profilering av bestemt protein Glykosylering i komplekse prøver

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sekvens-spesifikk merking av nukleinsyrer og proteiner med metyltransferaser og kofaktor analoger

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering av nukleinsyrer: En enkel og Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Funksjonell Imaging av Viral transkripsjon fabrikker bruker 3D fluorescens mikroskopi

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Single Cell Micro-aspirasjon som en alternativ strategi for å fluorescens-aktivert Cell sortering for Giant virus blanding separasjon

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Utforske m6A og m5C Epitranscriptomes ved virusinfeksjon: et eksempel med HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...