Name: co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs at JoVE.com

نود أن نشكر منحة دويتشه فورشونغسجيمينشافت (DFG) BE1911/8-1 ، ومشروع LOEWE GLUE ، ومركز الأبحاث التعاوني النقل والاتصالات عبر الأغشية (SFB807) على الدعم المالي.

1. إعداد S30 lysate
<ol><li>اليوم 1: اخرج الخلايا من مخزون الجلسرين على صفيحة أجار LB واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
	<li>اليوم 2: قم بتلقيح 200 مل من وسط LB مع الخلايا من صفيحة الأجار واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 12-14 ساعة.</li>
	<li>اليوم 3: قم بتلقيح 10 لتر من وسط YPTG الم...

<ol>
	<li>Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+for+protein+production+and+purification+enabling+membrane+protein+structural+biology.">Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).</li><li>Ritchie, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs.</a> Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).</li><li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lipoprotein+nanoparticle+system+for+membrane+proteins.">A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins.</a> Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+stability+can+be+compromised+by+detergent+interactions+with+the+extramembranous+soluble+domains.">Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains.</a> Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Junge, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-free+protein+synthesis+for+the+functional+and+structural+analysis+of+membrane+proteins.">Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins.</a> New Biotechnology. 28 (3), (2011).</li><li>Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+extract-based+cell-free+expression+system+as+an+alternative+for+difficult-to-obtain+protein+biosynthesis.">Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).</li><li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+discoidal+phospholipid+bilayer+nanoparticles+with+membrane+scaffold+proteins.">Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins.</a> Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).</li><li>Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+expression:+no+cells+required.">Membrane protein expression: no cells required.</a> Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).</li><li>Roos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+co-translationally+formed+nanodisc+complexes+with+small+multidrug+transporters,+proteorhodopsin+and+with+the+E.+coli+MraY+translocase.">Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodelivery+of+a+functional+membrane+receptor+to+manipulate+cellular+phenotype.">Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-translational+approaches+for+producing+mammalian+receptors:+expanding+the+cell-free+expression+toolbox+using+nanolipoproteins.">Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins.</a> Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).</li><li>Rues, R. B., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+formation+and+pharmacological+characterization+of+beta1-adrenergic+receptor/nanodisc+complexes+with+different+lipid+environments.">Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+native+membrane+protein+assembly+in+nanodiscs+by+combined+non-covalent+mass+spectrometry+and+synthetic+biology.">Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology.</a> eLife. 6, 1-19 (2017).</li><li>Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+tools+to+study+co-translational+folding+of+alpha+helical+membrane+transporters.">Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+requirements+for+the+enzymatic+activity+of+MraY+translocases+and+in+vitro+reconstitution+of+the+lipid+II+synthesis+pathway.">Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).</li><li>Peetz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+co-translational+membrane+protein+insertion+by+combined+LILBID-mass+spectrometry+and+NMR+spectroscopy.">Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).</li><li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+scale+expression+of+membrane+proteins+in+Escherichia+coli-based+continuous+exchange+cell-free+systems.">Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).</li><li>Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+a+functional+G+protein-coupled+receptor+complexed+with+nanometer+scale+bilayer+discs.">Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs.</a> BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).</li><li>Rues, R. B., Dong, F., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+optimization+of+cell-free+synthesized+human+endothelin+B+receptor+folding.">Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding.</a> Methods. 147 (1), 73-83 (2018).</li><li>Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., D&#246;tsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+organic+cation+transporter+1+contains+three+binding+sites+for+substrate+1-methyl-4-phenylpyridinium+per+monomer.">Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer.</a> Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).</li><li>Matthies, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+and+assembly+of+ATP+synthase.">Cell-free expression and assembly of ATP synthase.</a> Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).</li><li>Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+profiling+of+E.+coli+inner+membrane+proteins.">Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins.</a> Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).</li><li>Haberstock, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+to+increase+the+efficiency+of+membrane+protein+production+in+cell-free+expression+systems.">A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems.</a> Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).</li><li>Falkinham, J. O., Clark, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+a+double+male+strain+of+Escherichia+coli+K12.">Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12.</a> Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).</li><li>Foshag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E.+coli+S30+lysate+proteome:+A+prototype+for+cell-free+protein+production.">The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production.</a> New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).</li><li>Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+the+gene+for+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).</li><li>Reckel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+cell-free+expression+of+membrane+proteins.">Strategies for the cell-free expression of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperativity+in+cytochrome+P450+3A4:+Linkages+in+substrate+binding,+spin+state,+uncoupling,+and+product+formation.">Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).</li><li>Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+gene+expression+with+an+improved+green+fluorescent+protein.">Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+to+function+cell-free+electrophysiological+and+optical+analysis+of+ion+pumps+in+nanodiscs.">From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).</li><li>Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+model+membranes:+Seeking+better+ways+to+retain+protein+activities.">Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).</li></ol>

يتم وصف الإعداد والاستراتيجيات لتحسين تعبير CF والإدراج الانتقالي المشترك للنواب الوظيفيين في الأقراص النانوية. وتشمل المعدات المطلوبة مفاعلا حيويا، وجهازا فرنسيا للضغط أو ما شابه ذلك، وقارئا للأشعة فوق البنفسجية/VIS ومضنا، وأوعية تفاعل CF مناسبة لإعداد تكوين مقصورتين، وحاضنة يتم التحكم ?...

تعتبر بروتينات الغشاء (MPs) أهدافا صعبة في دراسات إنتاج البروتين بسبب عدم قابليتها للذوبان في البيئات المائية. تشتمل منصات إنتاج MP التقليدية على أنظمة قائمة على الخلايا مثل E. coli أو الخميرة أو الخلايا حقيقية النواة. يتم استخراج أعضاء البرلمان المؤتلف المركب إما من أغشية الخلايا أو إعادة طيها من أجسام التضمين1. بعد ذوبان المنظفات ، يمكن نقل النواب إلى بيئات غشائية مناسبة من خلال بروتوكولات إعادة التشكيل في المختبر. إلى جانب الحويصلات والجسيمات الشحمية ، أصبحت إعادة تشكيل MP في أغشية مستوية في شكل أقراص نانوية2 أو جسيمات ساليبرو3 تقنيات روتينية في الآونة الأخيرة. ومع ذلك ، فإن كل هذه الاستراتيجيات تنطوي على اتصال المنظفات مع النواب التي يمكن أن تؤدي إلى زعزعة الاستقرار ، وتفكك oligomers ، وحتى فقدان بنية البروتين والنشاط4. وبالتالي ، يمكن أن يكون فحص ظروف الذوبان وإعادة التشكيل المثلى للمنظفات مملا ويستغرق وقتا طويلا5.
تسمح الطبيعة المفتوحة للأنظمة الخالية من الخلايا (CF) بتزويد تفاعل التعبير مباشرة بأغشية مسبقة التشكيل ذات تركيبة دهنية محددة. في وضع التعبير القائم على الدهون هذا (L-CF) ، تتاح للنواب المركبين الفرصة للإدراج بشكل مشترك في الطبقات الثنائية المقدمة 6,7 (الشكل 1). يبدو أن الأقراص النانوية التي تتكون من بروتين سقالة غشائية (MSP) يحيط بقرص ثنائي الطبقة من الدهون المستوية8 مناسبة بشكل خاص لهذه الاستراتيجية 9,10. يمكن تجميع الأقراص النانوية بشكل روتيني في المختبر مع مجموعة متنوعة من الدهون المختلفة ، فهي مستقرة للغاية ، ويمكن تركيز المخزونات حتى 1 ملليمتر. ومع ذلك ، فإن تعبير MSP في E. coli وتنقيته ضروري. كاستراتيجية بديلة ، يمكن التعبير عن MSP بشكل مشترك مع النائب المستهدف في تفاعلات CF المزودة بالجسيمات الشحمية 11،12،13. تتم إضافة قوالب الحمض النووي لكل من MSP و MP إلى التفاعل ويمكن أن تتشكل أقراص MP / nanodiscs عند التعبير. في حين يتم تجنب إنتاج MSP ، تتطلب استراتيجية التعبير المشترك ضبطا دقيقا دقيقا لتركيزات قالب الحمض النووي النهائي ويمكن توقع اختلافات أعلى في كفاءة إنتاج العينات.
إن الإدخال الانتقالي المشترك للنواب في أغشية الأقراص النانوية سابقة التشكيل هو آلية غير فسيولوجية ولا تزال غير معروفة إلى حد كبير مستقلة عن آلات translocon وتسلسلات الإشارات13،14،15،16. المحددات الرئيسية لكفاءة الإدخال هي نوع بروتين الغشاء وكذلك تكوين الدهون في الغشاء المقدم ، مع تفضيل متكرر للدهون سالبة الشحنة15,17. نظرا لأن أغشية الأقراص النانوية محصورة نسبيا في الحجم ، يتم إطلاق كمية كبيرة من الدهون عند إدخال MP18. يتيح اختلاف حجم القرص النانوي إدخال وضبط مجمعات MP قليلة القلة الأعلى15,18. من بين أمور أخرى ، تم عرض التجميع الصحيح للمجمعات المتجانسة للقناة الأيونية KcsA ، وللمضخة الأيونية proteorhodopsin (PR) ولنقل الأدوية المتعددة EmrE15,18. من المرجح أن يدخل النواب غشاء القرص النانوي المتماثل من كلا الجانبين بتردد متساو نسبيا. لذلك ينبغي اعتبار أن المونومرات المختلفة أو الأوليغومرات التي يتم إدخالها في قرص نانوي واحد قد يكون لها اتجاهات متعاكسة. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث التحيز في التوجه بسبب آليات الإدراج التعاونية كما هو مذكور لتشكيل hexamers PR و KcsA tetramers18. قد ينتج تحيز آخر في اتجاه MP عن مفاتيح توجيه النواب المدخلين ربما على حافة أغشية القرص النانوي.
يعد إنتاج محللات التليف الكيسي من سلالات الإشريكية القولونية تقنية روتينية موثوقة ويمكن إجراؤها في أي مختبر كيميائي حيوي تقريبا19,20. يجب مراعاة أنه إلى جانب تكوين جسر ثاني كبريتيد ، فإن معظم التعديلات الأخرى بعد الترجمة غائبة إذا تم تصنيع MP باستخدام E. coli lysates. في حين أن هذا قد يولد عينات أكثر تجانسا للدراسات الهيكلية ، فقد يكون من الضروري استبعاد الآثار المحتملة على وظيفة أهداف MP. ومع ذلك ، فإن الإنتاج الفعال لعينات عالية الجودة من مستقبلات البروتين G المقترنة (GPCR) 14،21،22 ، أو ناقلات حقيقية النواة 23 أو تجمعات كبيرة غير متجانسة 24 في محللات E. coli CF تشير إلى ملاءمتها حتى للأهداف المعقدة. يمكن الحصول على كميات المقياس التحضيري (≈ 1 ملغم/مل) من العينة باستخدام تكوين خلية التبادل المستمر الخالي من الخلايا (CECF) المكون من مقصورتين، والذي يتكون من خليط تفاعل (RM) وحجرة خليط تغذية (FM). يتجاوز حجم FM حجم RM من 15 إلى 20 ضعفا ويوفر خزانا من مركبات الطاقة منخفضة الوزن الجزيئي والسلائف19. وبالتالي يتم تمديد تفاعل التعبير لعدة ساعات ويتم زيادة العائد النهائي لهدف MP. يتم فصل مقصورات RM و FM بواسطة غشاء غسيل الكلى مع قطع 10-14 kDa. تتطلب المقصورتان تصميما خاصا لحاوية تفاعل CECF (الشكل 1). أشرطة غسيل الكلى التجارية كحاويات RM في تركيبة مع حاويات زجاجية شبكية مصممة خصيصا تحمل FM هي أمثلة مناسبة. يمكن التلاعب بعوائد MP بشكل أكبر عن طريق تعديل نسب RM: FM أو عن طريق تبادل FM بعد فترة معينة من الحضانة.
غالبا ما يتطلب العائد وجودة MP تحسينا مكثفا لمعلمات التفاعل. ميزة مهمة لتعبير CF هي إمكانية تعديل وضبط أي مركب تقريبا وفقا للمتطلبات الفردية ل MP. تتمثل الاستراتيجية المباشرة في التركيز أولا على تحسين إنتاجية MP من خلال إنشاء بروتوكول إنتاج أساسي ثم تحسين جودة MP من خلال ضبط التفاعل وظروف الطي. يؤدي غياب العمليات الفسيولوجية في محللات CF وانخفاض تعقيدها إلى ارتفاع معدلات النجاح للإنتاج الفعال ل MPs25. الاعتبارات الروتينية لتصميم قالب الحمض النووي وتحسين تركيز أيون Mg 2+ كافية في معظم الحالات للحصول على عوائد مرضية26. اعتمادا على وضع التعبير ، يمكن أن يصبح تحسين جودة MP مستهلكا للوقت ، حيث يجب فحص مجموعة أكبر من المعلمات14،17،22.
لإنشاء منصة التعبير CF الموصوفة ، تعد البروتوكولات ضرورية لإنتاج محللات E. coli CF (i) ، وبوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (ii) ، والأقراص النانوية (iii) ، ومركبات تفاعل CECF الأساسية (iv) (الشكل 1). وكثيرا ما تستخدم مشتقات سلالة E. coli K12 A1927 أو BL21 لإعداد S30 الفعال (الطرد المركزي عند 30000 × g) lysates. إلى جانب الليزات S30 ، يمكن استخدام الليزات المقابلة التي يتم طردها مركزيا في قوى g أخرى (مثل S12). تختلف الليزات في كفاءة التعبير وفي تعقيد البروتين. تمت دراسة بروتيوم S30 lysate الذي أعده البروتوكول الموصوف بالتفصيل28. لا يزال بروتين S30 يحتوي على بعض بروتينات الغشاء الخارجي المتبقية التي يمكن أن تسبب مشاكل خلفية عند التعبير عن القنوات الأيونية وتحليلها. بالنسبة لهذه الأهداف ، يوصى باستخدام محللات S80-S100. تعديل قيم أثناء إعداد lysate هو تحريض استجابة SOS عن طريق الجمع بين الصدمة الحرارية وإمدادات الإيثانول في مرحلة نمو منتصف السجل للخلايا. يتم إثراء محللات HS30 الناتجة في المرافقين ويمكن استخدامها في المزج مع S30 lysates لتحسين MP قابل للطي22. يتم تشغيل تعبير CF في محللات E. coli كعملية نسخ / ترجمة مقترنة مع قوالب الحمض النووي التي تحتوي على المروجين الذين يتم التحكم فيهم بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (T7RNAP). يمكن إنتاج الإنزيم بكفاءة في خلايا النجوم BL21 (DE3) التي تحمل البلازميد pAR121929.
يتم تجميع نسختين من MSP1E3D1 في قرص نانوي واحد يبلغ قطره 10-12 نانومتر، ولكن البروتوكول الموضح أدناه قد يعمل أيضا مع مشتقات MSP الأخرى. ومع ذلك ، فإن الأقراص النانوية الأكبر من تلك التي تم تشكيلها باستخدام MSP1E3D1 تميل إلى أن تكون أقل استقرارا في حين أن الأقراص النانوية الأصغر التي تم تشكيلها باستخدام مشتقات MSP مثل MSP1 قد لا تستوعب MPs أو مجمعات MP. يمكن تجميع الأقراص النانوية MSP1E3D1 في المختبر مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من الدهون المختلفة أو مخاليط الدهون. عادة ما تكون الأقراص النانوية سابقة التشكيل مستقرة لمدة > 1 سنة عند -80 درجة مئوية ، في حين أن الاستقرار قد يختلف لمكونات الدهون المختلفة. لفحص تأثيرات الدهون على طي واستقرار MP، فمن الضروري إعداد مجموعة شاملة من الأقراص النانوية التي تم تجميعها مع مجموعة متنوعة تمثيلية من الدهون / مخاليط الدهون. الدهون التالية قد تعطي اختيار بداية جيدة: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG) ، 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) ، 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG) ، 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) ، 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) و 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC).
يتم وصف بروتوكول لإعداد تفاعل CECF 3 مل. من الممكن إجراء المزيد من التحجيم لأعلى أو لأسفل بنسبة 1: 1. بالنسبة لتكوين CECF المكون من جزأين ، يجب إعداد RM يحتوي على جميع المركبات و FM يحتوي فقط على المركبات منخفضة الوزن الجزيئي. يمكن استخدام أجهزة غسيل الكلى التجارية سعة 3 مل مع 10-14 كيلو دالتون MWCO كحاويات RM ، والتي يتم وضعها بعد ذلك في حاويات زجاجية شبكية مخصصة تحمل FM (الشكل 1D)30. نسبة RM:FM هي 1:20 ، لذلك يجب إعداد 60 مل من FM ل 3 مل RM. يمكن أن تكون جودة أو تركيز أو نوع العديد من المكونات حاسمة بالنسبة للعائد النهائي و / أو جودة MP المركب (الجدول 1). يجب إعداد قوالب الحمض النووي وفقا للمبادئ التوجيهية المنشورة ويمكن أن يؤدي تحسين الكودون لإطار القراءة للهدف إلى زيادة تحسين إنتاجية المنتج بشكل كبير26. بالنسبة لتفاعل CECF على نطاق تحضيري ، يتم وصف بروتوكول ثابت لإنتاج العلاقات العامة. لإنشاء بروتوكولات تعبير للنواب الجدد ، من الضروري عادة إجراء شاشات تحسين لبعض المركبات (الجدول 1) لتحسين الإنتاجية والجودة. بالنسبة لأيونات Mg2+ ، يوجد تركيز مثالي جيد التركيز يظهر في كثير من الأحيان تباينا كبيرا لقوالب الحمض النووي المختلفة. مركبات تفاعل CF الأخرى مثل دفعات جديدة من T7RNAP أو S30 lysates قد تزيد من تحويل تركيز Mg2+ الأمثل. على سبيل المثال ، يتم وصف شاشة Mg 2+ نموذجية ضمن نطاق تركيز14-24 mM وفي خطوات من 2 mM. يتم فحص كل تركيز في تكرارات وفي تفاعلات CECF على نطاق تحليلي. كحاوية تفاعل CECF ، يتم استخدام حاويات زجاجية Mini-CECF Plexiglas30 المصممة خصيصا والتي تحمل RM مع لوحات صغيرة قياسية ذات 24 بئرا تحمل FM (الشكل 1B). وبدلا من ذلك، يمكن استخدام خراطيش غسيل الكلى التجارية مع الصفائح الدقيقة للآبار ذات العمق 96 أو غيرها من أجهزة الدياليزر التجارية في الإعدادات المناسبة (الشكل 1C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840445P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850345C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840475C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals (USA)</td>
			<td>ART0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)</td>
			<td>Merck (Germany)</td>
			<td>1409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Germany)</td>
			<td>A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alprenolol hydrochloride</td>
			<td>Merck (Germany)</td>
			<td>A0360000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose&#174;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>Q1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave Type GE 446EC-1</td>
			<td>Gettinge (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor Type 884 124/1</td>
			<td>B.Braun (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks</td>
			<td>Schott Duran (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing</td>
			<td>Fisher Scientific (Germany)</td>
			<td>8700152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreit</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell disruptor</td>
			<td>SLM; Amico Instruments (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate di-sodium salt (GTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>K025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL</td>
			<td>GE Life Sciences (Germany)</td>
			<td>GE17-5248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3076.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>HN23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>9359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophane</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>7700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MD100 dialysis units</td>
			<td>Scienova (Germany)</td>
			<td>40077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethansulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecylphosphocholine</td>
			<td>Antrace (USA)</td>
			<td>F308S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel power supply: Power Pac 3000</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone/peptone from caseine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump: ip-12</td>
			<td>Ismatec (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenol pyruvate monopotassium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich (Germany)</td>
			<td>860077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Roche (Germany)</td>
			<td>10109045001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter: Hidex 300 SL</td>
			<td>Hidex (Finland)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS pellets</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>8029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>K305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Nanodrop</td>
			<td>Peqlab (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer/fluorescence reader Spark&#174;</td>
			<td>Tecan (Switzerland)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (E. coli)</td>
			<td>Roche (Germany)</td>
			<td>10109550001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra sonificator</td>
			<td>Labsonic U, B. Braun (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#8217;-triphosphate tri-sodium salt (UTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-30 antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>A6457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>2904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs

تسمح أنظمة التعبير الخالية من الخلايا بالتصميم المصمم خصيصا لبيئات التفاعل لدعم الطي الوظيفي حتى للبروتينات المعقدة مثل بروتينات الغشاء. يتم توضيح الإجراءات التجريبية للإدخال والطي الانتقالي المشترك لبروتينات الغشاء في أغشية سابقة التشكيل ومحددة يتم توفيرها كأقراص نانوية. البروتوكول خال تماما من المنظفات ويمكنه توليد ملليغرام من العينات النقية في غضون يوم واحد. يمكن استخدام عينات بروتين الغشاء / القرص النانوي الناتجة لمجموعة متنوعة من الدراسات الوظيفية والتطبيقات الهيكلية مثل التبلور أو الرنين المغناطيسي النووي أو المجهر الإلكتروني. يتم وصف إعداد المكونات الرئيسية الأساسية مثل lysates الخالية من الخلايا ، والأقراص النانوية ذات الأغشية المصممة ، وحلول المخزون الحرجة ، بالإضافة إلى تجميع تفاعلات التعبير الخالية من الخلايا المكونة من جزأتين. نظرا لأن متطلبات الطي لبروتينات الغشاء يمكن أن تكون متنوعة للغاية ، فإن التركيز الرئيسي لهذا البروتوكول هو تعديل المعلمات وخطوات التفاعل المهمة لجودة العينة مثل مركبات التفاعل الأساسية الحرجة ، أو تكوين غشاء الأقراص النانوية ، أو بيئة الأكسدة والاختزال والمرافقة ، أو تصميم قالب الحمض النووي. يتم إثبات العملية برمتها من خلال تخليق البروتيورهودوبسين ومستقبلات G-protein المقترنة.

ويتجلى تأثير ضبط مركبات التفاعل على العائد النهائي أو جودة النواب المركبين. يتمثل النهج الروتيني المتكرر في ضبط تركيز Mg2+ الأمثل في تفاعلات CF عن طريق التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) كشاشة مريحة لكفاءة النظام. على سبيل المثال ، تم تصنيع GFP من متجه pET-21a (+) بتركيزات Mg 2+ بين 14 و24</su...

Watch this Scientific Journal Video about Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs at JoVE.com

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

يتيح الإدخال الانتقالي المشترك في الأقراص النانوية المشكلة مسبقا دراسة بروتينات الغشاء المركبة الخالية من الخلايا في بيئات دهنية محددة دون ملامسة المنظفات. يصف هذا البروتوكول إعداد مكونات النظام الأساسية والمعلمات الحرجة لتحسين كفاءة التعبير وجودة العينة.

الإدخال الانتقالي المشترك لبروتينات الغشاء في الأقراص النانوية سابقة التشكيل

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

التجويف النيتروجين والطرد المركزي التفاضلي يسمح بمراقبة توزيع البروتينات الغشاء المحيطي في الخلايا المستزرعة

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

خالية من المنظفات فائق السرعة إعادة تشكيل بروتينات الغشاء إلى بليرس الدهن باستخدام فوسوجينيك بروتيوليبوسوميس تكميلية مشحونة.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

عزل جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج لدراسة دمج الأحماض الدهنية المسببة للأمراض البكتيرية في الدهون الفوسفاتية الغشاء

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

توطين البروتينات المعدلة السومو باستخدام السومو الفلورسنت-البروتينات الملائمة

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick ، خطوه واحده لدمج البروتينات الغشائية في أقراص البيتيلات الحيوية لاختبارات ربط البروتين الانسيابية

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl تبادل جل تحويلة القول لتحديد كمي من البالميتويشن من بروتينات غشاء الدماغ

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...