Name: co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs at JoVE.com

Vi vil gerne takke Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) bevilling BE1911/8-1, LOEWE-projektet GLUE og det kollaborative forskningscenter Transport and Communication across Membranes (SFB807) for økonomisk støtte.

1. Tilberedning af S30-lysat
<ol><li>Dag 1: Stribe celler ud fra glycerollagre på en LB-agarplade og inkuberes ved 37 °C natten over.</li>
	<li>Dag 2: Der podes 200 ml LB-medium med cellerne fra agarpladen, og der inkuberes ved 37 °C i 12-14 timer.</li>
	<li>Dag 3: Pod 10 L sterilt YPTG-medium (10 g / L gærekstrakt, 16 g / L tryptone, 5 g / L NaCl, 19,8 g / L glucose, 4,4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K2HPO4) hærdet til 37 ° C i en 15 L rør...

<ol>
	<li>Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+for+protein+production+and+purification+enabling+membrane+protein+structural+biology.">Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).</li><li>Ritchie, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs.</a> Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).</li><li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lipoprotein+nanoparticle+system+for+membrane+proteins.">A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins.</a> Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+stability+can+be+compromised+by+detergent+interactions+with+the+extramembranous+soluble+domains.">Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains.</a> Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Junge, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-free+protein+synthesis+for+the+functional+and+structural+analysis+of+membrane+proteins.">Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins.</a> New Biotechnology. 28 (3), (2011).</li><li>Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+extract-based+cell-free+expression+system+as+an+alternative+for+difficult-to-obtain+protein+biosynthesis.">Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).</li><li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+discoidal+phospholipid+bilayer+nanoparticles+with+membrane+scaffold+proteins.">Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins.</a> Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).</li><li>Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+expression:+no+cells+required.">Membrane protein expression: no cells required.</a> Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).</li><li>Roos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+co-translationally+formed+nanodisc+complexes+with+small+multidrug+transporters,+proteorhodopsin+and+with+the+E.+coli+MraY+translocase.">Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodelivery+of+a+functional+membrane+receptor+to+manipulate+cellular+phenotype.">Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-translational+approaches+for+producing+mammalian+receptors:+expanding+the+cell-free+expression+toolbox+using+nanolipoproteins.">Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins.</a> Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).</li><li>Rues, R. B., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+formation+and+pharmacological+characterization+of+beta1-adrenergic+receptor/nanodisc+complexes+with+different+lipid+environments.">Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+native+membrane+protein+assembly+in+nanodiscs+by+combined+non-covalent+mass+spectrometry+and+synthetic+biology.">Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology.</a> eLife. 6, 1-19 (2017).</li><li>Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+tools+to+study+co-translational+folding+of+alpha+helical+membrane+transporters.">Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+requirements+for+the+enzymatic+activity+of+MraY+translocases+and+in+vitro+reconstitution+of+the+lipid+II+synthesis+pathway.">Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).</li><li>Peetz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+co-translational+membrane+protein+insertion+by+combined+LILBID-mass+spectrometry+and+NMR+spectroscopy.">Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).</li><li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+scale+expression+of+membrane+proteins+in+Escherichia+coli-based+continuous+exchange+cell-free+systems.">Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).</li><li>Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+a+functional+G+protein-coupled+receptor+complexed+with+nanometer+scale+bilayer+discs.">Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs.</a> BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).</li><li>Rues, R. B., Dong, F., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+optimization+of+cell-free+synthesized+human+endothelin+B+receptor+folding.">Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding.</a> Methods. 147 (1), 73-83 (2018).</li><li>Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., D&#246;tsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+organic+cation+transporter+1+contains+three+binding+sites+for+substrate+1-methyl-4-phenylpyridinium+per+monomer.">Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer.</a> Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).</li><li>Matthies, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+and+assembly+of+ATP+synthase.">Cell-free expression and assembly of ATP synthase.</a> Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).</li><li>Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+profiling+of+E.+coli+inner+membrane+proteins.">Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins.</a> Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).</li><li>Haberstock, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+to+increase+the+efficiency+of+membrane+protein+production+in+cell-free+expression+systems.">A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems.</a> Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).</li><li>Falkinham, J. O., Clark, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+a+double+male+strain+of+Escherichia+coli+K12.">Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12.</a> Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).</li><li>Foshag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E.+coli+S30+lysate+proteome:+A+prototype+for+cell-free+protein+production.">The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production.</a> New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).</li><li>Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+the+gene+for+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).</li><li>Reckel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+cell-free+expression+of+membrane+proteins.">Strategies for the cell-free expression of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperativity+in+cytochrome+P450+3A4:+Linkages+in+substrate+binding,+spin+state,+uncoupling,+and+product+formation.">Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).</li><li>Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+gene+expression+with+an+improved+green+fluorescent+protein.">Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+to+function+cell-free+electrophysiological+and+optical+analysis+of+ion+pumps+in+nanodiscs.">From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).</li><li>Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+model+membranes:+Seeking+better+ways+to+retain+protein+activities.">Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).</li></ol>

Opsætningen og strategierne til optimering af CF-ekspressionen og co-translationel indsættelse af funktionelle parlamentsmedlemmer i nanodiscs er beskrevet. Det nødvendige udstyr omfatter en bioreaktor, en stempelkande eller lignende, en UV/VIS og fluorescenslæser, CF-reaktionsbeholdere, der er egnede til en konfigurationsopsætning med to rum, og en temperaturstyret inkubator. Yderligere standardudstyr er centrifuger til høst af E. coli-celler samt bordpladecentrifuger, der når mindst 30.000 x g ...

Membranproteiner (MP'er) er udfordrende mål i proteinproduktionsundersøgelser på grund af deres uopløselighed i vandige miljøer. Konventionelle MP-produktionsplatforme omfatter cellebaserede systemer såsom E. coli, gær eller eukaryote celler. De syntetiserede rekombinante parlamentsmedlemmer ekstraheres enten fra cellemembraner eller genfoldes fra inklusionslegemer1. Efter opløselse af vaskemidler kan parlamentsmedlemmer overføres til egnede membranmiljøer ved hjælp af etablerede in vitro-rekonstitutionsprotokoller. Udover vesikler og liposomer er MP-rekonstitution til plane membraner i form af nanodiscs2 - eller salipro3-partikler blevet rutineteknikker i nyere tid. Imidlertid indebærer alle disse strategier vaskemiddelkontakt med parlamentsmedlemmer, der kan resultere i destabilisering, dissociation af oligomerer og endda tab af proteinstruktur og aktivitet4. Screening for optimale opløselige vaskemiddel- og rekonstitutionsforhold kan derfor være kedelig og tidskrævende5.
Den åbne natur af cellefrie (CF) systemer gør det muligt at forsyne ekspressionsreaktionen direkte med præformede membraner med en defineret lipidsammensætning. I denne lipidbaserede ekspressionstilstand (L-CF) har de syntetiserede parlamentsmedlemmer mulighed for co-translationelt at indsætte i de medfølgende dobbeltlag 6,7 (figur 1). Nanodiscs bestående af et membranstilladsprotein (MSP) omkring en plan lipid dobbeltlagsskive8 synes at være særligt velegnet til denne strategi 9,10. Nanodiscs kan rutinemæssigt samles in vitro med en række forskellige lipider, de er meget stabile, og lagre kan koncentreres op til 1 mM. Imidlertid er MSP-ekspression i E. coli og dens oprensning nødvendig. Som en alternativ strategi kan MFP udtrykkes sammen med mål-MP i CF-reaktioner forsynet med liposomer11,12,13. DNA-skabeloner til både MSP og MP tilføjes i reaktionen, og MP/nanodiscs kan dannes ved ekspression. Mens MSP-produktion undgås, kræver co-ekspressionsstrategien omhyggelig finjustering af de endelige DNA-skabelonkoncentrationer, og der kan forventes højere variationer i effektiviteten af prøveproduktion.
Den co-translationelle indsættelse af parlamentsmedlemmer i membraner af præformerede nanodiscs er en ikke-fysiologisk og stadig stort set ukendt mekanisme uafhængig af translocon maskiner og signalsekvenser13,14,15,16. Hoveddeterminanter for indsættelseseffektiviteten er typen af membranprotein såvel som lipidsammensætningen af den tilvejebragte membran, med en hyppig præference for negativt ladede lipider15,17. Da nanodiscmembranerne er relativt begrænsede i størrelse, frigives en betydelig mængde lipider ved MP-indsættelse18. Variation af nanodisc-størrelse muliggør indsættelse og tuning af højere oligomere MP-komplekser15,18. Blandt andet blev den korrekte samling af homooligomere komplekser vist for ionkanalen KcsA, for ionpumpen proteorhodopsin (PR) og for multidrugtransportøren EmrE15,18. Parlamentsmedlemmer vil sandsynligvis komme ind i den symmetriske nanodiscmembran fra begge sider med relativt lige frekvens. Det bør derfor tages i betragtning, at forskellige monomerer eller oligomerer, der indsættes i en nanodisk, kan have modsatte retninger. En skævhed i orienteringen kan imidlertid være forårsaget af kooperative indsættelsesmekanismer som rapporteret for dannelsen af PR-hexamerer og KcsA-tetramerer18. En yderligere bias i MP-orientering kan skyldes orienteringsafbrydere af indsatte parlamentsmedlemmer, sandsynligvis ved kanten af nanodiscmembranerne.
Produktionen af CF-lysater fra E. coli-stammer er en pålidelig rutineteknik og kan udføres i næsten ethvert biokemisk laboratorium19,20. Det skal overvejes, at udover disulfidbrodannelse er de fleste andre posttranslationelle modifikationer fraværende, hvis et MP syntetiseres ved hjælp af E. coli-lysater. Selv om dette kan generere mere homogene prøver til strukturelle undersøgelser, kan det være nødvendigt at udelukke potentielle virkninger på funktionen af individuelle MP-mål. Den effektive produktion af prøver af høj kvalitet af G-proteinkoblede receptorer (GPCR)14,21,22, eukaryote transportører 23 eller store heteromere samlinger 24 i E. coli CF-lysater indikerer imidlertid deres egnethed til selv komplekse mål. Præparative skalamængder (≈ 1 mg/ml) af en prøve kan opnås med konfigurationen af den to-rums kontinuerlige udvekslingscellefri (CECF), der består af en reaktionsblanding (RM) og et fødeblandingsrum (FM). FM-volumenet overstiger RM-volumenet 15 til 20 gange og giver et reservoir af lavmolekylære energiforbindelser og prækursorer19. Udtryksreaktionen forlænges således i flere timer, og det endelige udbytte af MP-målet øges. RM- og FM-rummene er adskilt af en dialysemembran med en 10-14 kDa afskæring. De to rum kræver en særlig konstruktion af CECF-reaktionsbeholderen (figur 1). Kommercielle dialysekassetter som RM-beholdere i kombination med skræddersyede plexiglasbeholdere, der holder FM, er egnede eksempler. MP-udbytter kan yderligere manipuleres ved at ændre RM: FM-forholdet eller ved at udveksle FM efter en vis inkubationsperiode.
Udbytte og kvalitet af en MP kræver ofte intens optimering af reaktionsparametre. En vigtig fordel ved CF-ekspression er muligheden for at ændre og finjustere næsten enhver forbindelse i henhold til de individuelle krav til et MP. En ligetil strategi er først at fokusere på at forbedre udbyttet af en MP ved at etablere en grundlæggende produktionsprotokol og derefter optimere MP-kvaliteten ved at finjustere reaktions- og foldeforhold. Fraværet af fysiologiske processer i CF-lysater og deres reducerede kompleksitet resulterer i høje succesrater for effektiv produktion af parlamentsmedlemmer25. Rutinemæssige overvejelser om DNA-skabelondesign og optimering af Mg 2+ ionkoncentration er i de fleste tilfælde tilstrækkelige til at opnå tilfredsstillende udbytter26. Afhængigt af udtrykstilstand kan optimering af MP-kvalitet blive tidskrævende, da en større række parametre skal screenes14,17,22.
For at etablere den beskrevne CF-ekspressionsplatform er protokoller nødvendige til fremstilling af E. coli CF-lysat (i), T7 RNA-polymerase (ii), nanodiscs (iii) og de basiske CECF-reaktionsforbindelser (iv) (figur 1). E. coli K12 stamme A1927 eller BL21 derivater anvendes ofte til fremstilling af effektive S30 (centrifugering ved 30.000 x g) lysater. Ud over S30-lysater kan tilsvarende lysater, der centrifugeres ved andre g-kræfter (f.eks. S12), anvendes. Lysaterne adskiller sig i ekspressionseffektivitet og i proteomkompleksitet. Proteomet af S30-lysatet fremstillet af den beskrevne protokol er blevet undersøgt i detaljer28. S30-proteomet indeholder stadig nogle resterende ydre membranproteiner, som kan give baggrundsproblemer ved ekspression og analyse af ionkanaler. Til sådanne mål anbefales brugen af S80-S100 lysater. En værdifuld modifikation under lysatforberedelse er induktionen af SOS-responsen ved kombineret varmechok og ethanolforsyning i cellernes midt-logvækstfase. De resulterende HS30-lysater er beriget med chaperoner og kan bruges i blandinger med S30-lysater for forbedret MP-foldning22. CF-ekspression i E. coli-lysater drives som en koblet transkriptions-/translationsproces med DNA-skabeloner indeholdende promotorer kontrolleret af T7 RNA-polymerase (T7RNAP). Enzymet kan produceres effektivt i BL21 (DE3) stjerneceller, der bærer pAR1219 plasmidet29.
To kopier af MSP1E3D1 samles i en nanodisc med en diameter på 10-12 nm, men protokollen beskrevet nedenfor kan også fungere for andre MSP-derivater. Imidlertid har nanodiscs, der er større end dem, der er dannet med MSP1E3D1, en tendens til at være mindre stabile, mens mindre nanodiscs dannet med MSP-derivater såsom MSP1 muligvis ikke rummer større parlamentsmedlemmer eller MP-komplekser. MSP1E3D1 nanodiscs kan samles in vitro med en lang række forskellige lipider eller lipidblandinger. Præformede nanodiscs er normalt stabile i > 1 år ved -80 °C, mens stabiliteten kan variere for forskellige lipidkomponenter. Til screening af lipideffekter på foldning og stabilitet af en MP er det nødvendigt at forberede et omfattende sæt nanodiscs samlet med et repræsentativt udvalg af lipider / lipidblandinger. Følgende lipider kan give et godt startvalg: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC).
En protokol til fremstilling af en 3 ml CECF-reaktion er beskrevet. Yderligere op- eller nedskalering i forholdet 1:1 er mulig. Til CECF-konfigurationen med to rum skal der fremstilles en RM, der indeholder alle forbindelser, og en FM, der kun indeholder lavmolekylære forbindelser. Kommercielle 3 ml dialyseanordninger med 10-14 kDa MWCO kan bruges som RM-containere, som derefter placeres i specialfremstillede plexiglasbeholdere, der holder FM (figur 1D)30. Forholdet mellem RM: FM er 1:20, så 60 ml FM skal forberedes til 3 ml RM. Kvalitet, koncentration eller type af flere komponenter kan være kritisk for det endelige udbytte og / eller kvaliteten af den syntetiserede MP (tabel 1). DNA-skabeloner skal udarbejdes i henhold til offentliggjorte retningslinjer, og kodonoptimering af målets læseramme kan yderligere forbedre produktudbyttet26. For præparativ skala CECF-reaktion beskrives en etableret protokol til produktion af PR. For at etablere udtryksprotokoller for nye parlamentsmedlemmer er det normalt nødvendigt at udføre optimeringsskærme af visse forbindelser (tabel 1) for at forbedre udbytte og kvalitet. For Mg2+ ioner findes der en velfokuseret koncentrationsoptimal, der ofte viser betydelig variation for forskellige DNA-skabeloner. Andre CF-reaktionsforbindelser, såsom nye batcher af T7RNAP- eller S30-lysater, kan yderligere ændre den optimale Mg2+ koncentration. Som et eksempel beskrives en typisk Mg 2+ skærm inden for området 14-24 mM koncentration og i trin på 2 mM. Hver koncentration screenes i dubletter og i analyseskala CECF-reaktioner. Som CECF-reaktionsbeholder anvendes specialfremstillede Mini-CECF plexiglasbeholdere30 , der holder RM, i kombination med standard 24-brønds mikroplader, der holder FM (figur 1B). Alternativt kan der anvendes kommercielle dialysepatroner i kombination med 96-dybe brøndmikroplader eller andre kommercielle dialysatoranordninger i passende opsætninger (figur 1C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840445P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850345C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840475C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals (USA)</td>
			<td>ART0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)</td>
			<td>Merck (Germany)</td>
			<td>1409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Germany)</td>
			<td>A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alprenolol hydrochloride</td>
			<td>Merck (Germany)</td>
			<td>A0360000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose&#174;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>Q1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave Type GE 446EC-1</td>
			<td>Gettinge (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor Type 884 124/1</td>
			<td>B.Braun (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks</td>
			<td>Schott Duran (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing</td>
			<td>Fisher Scientific (Germany)</td>
			<td>8700152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreit</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell disruptor</td>
			<td>SLM; Amico Instruments (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate di-sodium salt (GTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>K025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL</td>
			<td>GE Life Sciences (Germany)</td>
			<td>GE17-5248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3076.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>HN23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>9359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophane</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>7700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MD100 dialysis units</td>
			<td>Scienova (Germany)</td>
			<td>40077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethansulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecylphosphocholine</td>
			<td>Antrace (USA)</td>
			<td>F308S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel power supply: Power Pac 3000</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone/peptone from caseine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump: ip-12</td>
			<td>Ismatec (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenol pyruvate monopotassium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich (Germany)</td>
			<td>860077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Roche (Germany)</td>
			<td>10109045001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter: Hidex 300 SL</td>
			<td>Hidex (Finland)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS pellets</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>8029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>K305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Nanodrop</td>
			<td>Peqlab (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer/fluorescence reader Spark&#174;</td>
			<td>Tecan (Switzerland)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (E. coli)</td>
			<td>Roche (Germany)</td>
			<td>10109550001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra sonificator</td>
			<td>Labsonic U, B. Braun (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#8217;-triphosphate tri-sodium salt (UTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-30 antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>A6457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>2904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs

Cellefrie ekspressionssystemer muliggør skræddersyet design af reaktionsmiljøer til at understøtte funktionel foldning af selv komplekse proteiner såsom membranproteiner. De eksperimentelle procedurer for co-translationel indsættelse og foldning af membranproteiner i præformerede og definerede membraner, der leveres som nanodiscs, demonstreres. Protokollen er helt vaskemiddelfri og kan generere milligram rensede prøver inden for en dag. De resulterende membranprotein / nanodiscprøver kan bruges til en række funktionelle undersøgelser og strukturelle anvendelser såsom krystallisation, nuklear magnetisk resonans eller elektronmikroskopi. Fremstillingen af grundlæggende nøglekomponenter såsom cellefrie lysater, nanodiscs med designede membraner, kritiske lageropløsninger samt samling af to-rums cellefrie ekspressionsreaktioner er beskrevet. Da foldekrav til membranproteiner kan være meget forskellige, er et vigtigt fokus i denne protokol modulering af parametre og reaktionstrin, der er vigtige for prøvekvalitet, såsom kritiske basiske reaktionsforbindelser, membransammensætning af nanodiscs, redox- og chaperonmiljø eller DNA-skabelondesign. Hele processen demonstreres med syntesen af proteorhodopsin og en G-proteinkoblet receptor.

Virkningen af finjustering af reaktionsforbindelser på det endelige udbytte eller kvalitet af syntetiserede parlamentsmedlemmer er eksemplificeret. En hyppig rutinemæssig tilgang er at justere den optimale Mg2+ koncentration i CF-reaktioner ved ekspression af grønt fluorescerende protein (GFP) som en bekvem overvågning af systemeffektiviteten. Som et eksempel blev GFP syntetiseret fra en pET-21a (+) vektor ved Mg 2+ koncentrationer mellem 14 og24 mM (figur 2). SDS-P...

Watch this Scientific Journal Video about Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs at JoVE.com

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Co-translationel indsættelse i præformede nanodiscs gør det muligt at studere cellefrie syntetiserede membranproteiner i definerede lipidmiljøer uden kontakt med vaskemidler. Denne protokol beskriver forberedelsen af væsentlige systemkomponenter og de kritiske parametre til forbedring af ekspressionseffektivitet og prøvekvalitet.

Co-translationel indsættelse af membranproteiner i præformerede nanodiscs

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode til at visualisere og analysere membran interagerende proteiner af Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Kvælstof kavitation og differentieret centrifugering giver mulighed for overvågning fordelingen af perifere Membranproteiner i kulturperler celler

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel-fri ultrahurtig rekonstituering af membranproteiner i Lipid dobbeltlag ved hjælp af Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning af vaskemiddel-følsomme interaktioner mellem Membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering af lipoprotein partikler fra hønseæg æggeblomme til undersøgelse af bakteriel Patogenchlorid fedtsyre inkorporering i membran Fosfolipids

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering af SUMO-modificerede proteiner ved hjælp af fluorescerende Sumo-diffuse Rings proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, et et-trins inkorporering af membran proteiner i Biotinylerede Peptiskiver for strømlinede protein bindende assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for kvantitativ bestemmelse af palmitoyllation af hjernemembranproteiner

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...