Name: co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs at JoVE.com

Wir danken der Förderung der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) BE1911/8-1, dem LOEWE-Projekt GLUE und dem Sonderforschungsbereich Transport and Communication across Membranes (SFB807) für die finanzielle Unterstützung.

1. Herstellung von S30-Lysat
<ol><li>Tag 1: Streifen Sie Zellen aus Glycerinvorräten auf einer LB-Agarplatte aus und inkubieren Sie bei 37 ° C über Nacht.</li>
	<li>Tag 2: 200 ml LB-Medium mit den Zellen von der Agarplatte inokulieren und bei 37 °C für 12-14 h inkubieren.</li>
	<li>Tag 3: 10 l steriles YPTG-Medium (10 g/L Hefeextrakt, 16 g/L Trypton, 5 g/L NaCl, 19,8 g/L Glucose, 4,4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K2HPO4) temperiert auf 37 °C...

<ol>
	<li>Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+for+protein+production+and+purification+enabling+membrane+protein+structural+biology.">Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).</li><li>Ritchie, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs.</a> Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).</li><li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lipoprotein+nanoparticle+system+for+membrane+proteins.">A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins.</a> Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+stability+can+be+compromised+by+detergent+interactions+with+the+extramembranous+soluble+domains.">Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains.</a> Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Junge, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-free+protein+synthesis+for+the+functional+and+structural+analysis+of+membrane+proteins.">Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins.</a> New Biotechnology. 28 (3), (2011).</li><li>Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+extract-based+cell-free+expression+system+as+an+alternative+for+difficult-to-obtain+protein+biosynthesis.">Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).</li><li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+discoidal+phospholipid+bilayer+nanoparticles+with+membrane+scaffold+proteins.">Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins.</a> Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).</li><li>Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+expression:+no+cells+required.">Membrane protein expression: no cells required.</a> Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).</li><li>Roos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+co-translationally+formed+nanodisc+complexes+with+small+multidrug+transporters,+proteorhodopsin+and+with+the+E.+coli+MraY+translocase.">Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodelivery+of+a+functional+membrane+receptor+to+manipulate+cellular+phenotype.">Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-translational+approaches+for+producing+mammalian+receptors:+expanding+the+cell-free+expression+toolbox+using+nanolipoproteins.">Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins.</a> Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).</li><li>Rues, R. B., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+formation+and+pharmacological+characterization+of+beta1-adrenergic+receptor/nanodisc+complexes+with+different+lipid+environments.">Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+native+membrane+protein+assembly+in+nanodiscs+by+combined+non-covalent+mass+spectrometry+and+synthetic+biology.">Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology.</a> eLife. 6, 1-19 (2017).</li><li>Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+tools+to+study+co-translational+folding+of+alpha+helical+membrane+transporters.">Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+requirements+for+the+enzymatic+activity+of+MraY+translocases+and+in+vitro+reconstitution+of+the+lipid+II+synthesis+pathway.">Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).</li><li>Peetz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+co-translational+membrane+protein+insertion+by+combined+LILBID-mass+spectrometry+and+NMR+spectroscopy.">Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).</li><li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+scale+expression+of+membrane+proteins+in+Escherichia+coli-based+continuous+exchange+cell-free+systems.">Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).</li><li>Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+a+functional+G+protein-coupled+receptor+complexed+with+nanometer+scale+bilayer+discs.">Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs.</a> BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).</li><li>Rues, R. B., Dong, F., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+optimization+of+cell-free+synthesized+human+endothelin+B+receptor+folding.">Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding.</a> Methods. 147 (1), 73-83 (2018).</li><li>Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., D&#246;tsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+organic+cation+transporter+1+contains+three+binding+sites+for+substrate+1-methyl-4-phenylpyridinium+per+monomer.">Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer.</a> Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).</li><li>Matthies, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+and+assembly+of+ATP+synthase.">Cell-free expression and assembly of ATP synthase.</a> Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).</li><li>Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+profiling+of+E.+coli+inner+membrane+proteins.">Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins.</a> Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).</li><li>Haberstock, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+to+increase+the+efficiency+of+membrane+protein+production+in+cell-free+expression+systems.">A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems.</a> Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).</li><li>Falkinham, J. O., Clark, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+a+double+male+strain+of+Escherichia+coli+K12.">Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12.</a> Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).</li><li>Foshag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E.+coli+S30+lysate+proteome:+A+prototype+for+cell-free+protein+production.">The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production.</a> New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).</li><li>Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+the+gene+for+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).</li><li>Reckel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+cell-free+expression+of+membrane+proteins.">Strategies for the cell-free expression of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperativity+in+cytochrome+P450+3A4:+Linkages+in+substrate+binding,+spin+state,+uncoupling,+and+product+formation.">Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).</li><li>Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+gene+expression+with+an+improved+green+fluorescent+protein.">Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+to+function+cell-free+electrophysiological+and+optical+analysis+of+ion+pumps+in+nanodiscs.">From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).</li><li>Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+model+membranes:+Seeking+better+ways+to+retain+protein+activities.">Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).</li></ol>

Der Aufbau und die Strategien zur Optimierung der CF-Expression und der co-translationalen Insertion von funktionellen MPs in Nanoscheiben werden beschrieben. Die erforderliche Ausrüstung umfasst einen Bioreaktor, eine französische Pressvorrichtung oder ähnliches, einen UV/VIS- und Fluoreszenzreader, CF-Reaktionsgefäße, die für einen Zwei-Kompartiment-Konfigurationsaufbau geeignet sind, und einen temperaturgesteuerten Inkubator. Weitere Standardgeräte sind Zentrifugen zur Gewinnung von E. coli-Zellen sowi...

Membranproteine (MPs) sind aufgrund ihrer Unlöslichkeit in wässrigen Umgebungen anspruchsvolle Ziele in Proteinproduktionsstudien. Herkömmliche MP-Produktionsplattformen umfassen zellbasierte Systeme wie E. coli, Hefe oder eukaryotische Zellen. Die synthetisierten rekombinanten MPs werden entweder aus Zellmembranen extrahiert oder aus Einschlusskörpern refoldet1. Nach der Detergensolubilisierung können MPs durch etablierte In-vitro-Rekonstitutionsprotokolle in geeignete Membranumgebungen überführt werden. Neben Vesikeln und Liposomen ist die MP-Rekonstitution in planare Membranen in Form von Nanodiscs2 - oderSalipro-3-Partikeln in jüngster Zeit zur Routine geworden. Alle diese Strategien implizieren jedoch einen Waschmittelkontakt mit MPs, der zu Destabilisierung, Dissoziation von Oligomeren und sogar zum Verlust der Proteinstruktur und -aktivität führen kann4. Das Screening auf optimale Reinigungsmittel-Solubilisierungs- und Rekonstitutionsbedingungen kann daher mühsam und zeitaufwendig sein5.
Die Offenheit zellfreier (CF) Systeme ermöglicht es, die Expressionsreaktion direkt mit vorgeformten Membranen mit definierter Lipidzusammensetzung zu versorgen. In diesem lipidbasierten Expressionsmodus (L-CF) haben die synthetisierten MPs die Möglichkeit, co-translational in die bereitgestellten Doppelschichten 6,7 einzufügen (Abbildung 1). Nanoscheiben, die aus einem Membrangerüstprotein (MSP) bestehen, das eine planare Lipiddoppelschichtscheibe8 umgibt, scheinen für diese Strategie 9,10 besonders geeignet zu sein. Nanoscheiben können routinemäßig in vitro mit einer Vielzahl verschiedener Lipide zusammengesetzt werden, sie sind sehr stabil und die Bestände können bis zu 1 mM konzentriert werden. Die MSP-Expression in E. coli und ihre Reinigung ist jedoch notwendig. Als alternative Strategie kann MSP zusammen mit dem Ziel-MP in CF-Reaktionen exprimiert werden, die mit Liposomen11,12,13 versorgt werden. DNA-Templates für MSP und MP werden der Reaktion hinzugefügt und MP / Nanodiscs können sich bei der Expression bilden. Während die MSP-Produktion vermieden wird, erfordert die Co-Expressionsstrategie eine sorgfältige Feinabstimmung der endgültigen DNA-Template-Konzentrationen, und höhere Schwankungen in der Effizienz der Probenproduktion sind zu erwarten.
Das co-translationale Einfügen von MPs in Membranen vorgeformter Nanoscheiben ist ein unphysiologischer und noch weitgehend unbekannter Mechanismus, der unabhängig von Translokationsmaschinen und Signalsequenzen13,14,15,16 ist. Hauptdeterminanten der Insertionseffizienz sind die Art des Membranproteins sowie die Lipidzusammensetzung der bereitgestellten Membran, wobei häufig negativ geladene Lipidebevorzugt werden 15,17. Da die Nanoscheibenmembranen relativ begrenzt sind, wird bei MP-Insertion18 eine beträchtliche Menge an Lipiden freigesetzt. Die Variation der Nanoscheibengröße ermöglicht das Einfügen und Einstellen von höheren oligomeren MP-Komplexen15,18. Unter anderem wurde der korrekte Aufbau homooligomerer Komplexe für den Ionenkanal KcsA, für die Ionenpumpe Proteorhodopsin (PR) und für den Multidrug-Transporter EmrE15,18 gezeigt. MPs werden wahrscheinlich von beiden Seiten mit relativ gleicher Frequenz in die symmetrische Nanoscheibenmembran eindringen. Es sollte daher berücksichtigt werden, dass verschiedene Monomere oder Oligomere, die in eine Nanoscheibe eingefügt werden, entgegengesetzte Orientierungen aufweisen können. Eine Verzerrung der Orientierung könnte jedoch durch kooperative Insertionsmechanismen verursacht werden, wie sie für die Bildung von PR-Hexamern und KcsA-Tetrameren berichtetwurden 18. Eine weitere Verzerrung in der MP-Orientierung könnte sich aus Orientierungsschaltern von eingefügten MPs ergeben, wahrscheinlich am Rand der Nanoscheibenmembranen.
Die Herstellung von CF-Lysaten aus E. coli-Stämmen ist eine zuverlässige Routinetechnik und kann in fast jedem biochemischen Labor durchgeführt werden19,20. Es sollte berücksichtigt werden, dass neben der Disulfidbrückenbildung die meisten anderen posttranslationalen Modifikationen fehlen, wenn ein MP mit E. coli-Lysaten synthetisiert wird. Während dies homogenere Stichproben für Strukturstudien erzeugen könnte, kann es notwendig sein, mögliche Auswirkungen auf die Funktion einzelner MP-Ziele auszuschließen. Die effiziente Herstellung von qualitativ hochwertigen Proben von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR)14,21,22, eukaryotischen Transportern23 oder großen heteromeren Anordnungen 24 in E. coli-CF-Lysaten zeigt jedoch deren Eignung auch für komplexe Targets. Präparative Skalenmengen (≈ 1 mg/ml) einer Probe können mit der CECF-Konfiguration (Continuous Exchange Cell-Free) mit zwei Kompartimenten erhalten werden, die aus einem Reaktionsgemisch (RM) und einem Fütterungsgemisch (FM) besteht. Das FM-Volumen übersteigt das RM-Volumen um das 15- bis 20-fache und bietet ein Reservoir an niedermolekularen Energieverbindungen und Vorläufern19. Die Expressionsreaktion wird somit um mehrere Stunden verlängert und die Endausbeute des MP-Targets erhöht. Die RM- und FM-Fächer sind durch eine Dialysemembran mit einem Cutoff von 10-14 kDa getrennt. Die beiden Kompartimente erfordern ein spezielles Design des CECF-Reaktionsbehälters (Abbildung 1). Kommerzielle Dialysekassetten als RM-Container in Kombination mit maßgeschneiderten Plexiglasbehältern mit dem FM sind geeignete Beispiele. MP-Ausbeuten können weiter manipuliert werden, indem das RM:FM-Verhältnis geändert oder das FM nach einer bestimmten Inkubationszeit ausgetauscht wird.
Ausbeute und Qualität eines MP erfordern häufig eine intensive Optimierung der Reaktionsparameter. Ein wichtiger Vorteil der CF-Expression ist die Möglichkeit, nahezu jede Verbindung nach den individuellen Anforderungen eines MP zu modifizieren und zu feinabstimmen. Eine einfache Strategie besteht darin, sich zunächst auf die Verbesserung der Ausbeute eines MP zu konzentrieren, indem ein grundlegendes Produktionsprotokoll erstellt wird, und dann die MP-Qualität durch Feinabstimmung der Reaktions- und Faltbedingungen zu optimieren. Das Fehlen physiologischer Prozesse in CF-Lysaten und deren reduzierte Komplexität führen zu hohen Erfolgsraten für die effiziente Herstellung von MPs25. Routineüberlegungen für das Design von DNA-Templates und die Optimierung derMg2+-Ionenkonzentration reichen in den meisten Fällen aus, um zufriedenstellende Ausbeuten zu erzielen26. Je nach Ausdrucksmodus kann die Optimierung der MP-Qualität zeitaufwändig werden, da eine größere Vielfalt von Parametern gescreent werden muss14,17,22.
Um die beschriebene CF-Expressionsplattform zu etablieren, sind Protokolle für die Herstellung von E. coli-CF-Lysat (i), T7-RNA-Polymerase (ii), Nanodiscs (iii) und den grundlegenden CECF-Reaktionsverbindungen (iv) erforderlich (Abbildung 1). Die E. coli K12 Stamm A1927 oder BL21 Derivate werden häufig zur Herstellung von effizienten S30 (Zentrifugation bei 30.000 x g) Lysaten verwendet. Neben S30-Lysaten können entsprechende Lysate verwendet werden, die bei anderen g-Kräften (z.B. S12) zentrifugiert wurden. Die Lysate unterscheiden sich in der Expressionseffizienz und in der Proteomkomplexität. Das Proteom des nach dem beschriebenen Protokoll hergestellten S30-Lysats wurde eingehenduntersucht 28. Das S30-Proteom enthält noch einige restliche äußere Membranproteine, die Hintergrundprobleme bei der Expression und Analyse von Ionenkanälen verursachen könnten. Für solche Ziele wird die Verwendung von S80-S100-Lysaten empfohlen. Eine wertvolle Modifikation während der Lysataufbereitung ist die Induktion der SOS-Antwort durch kombinierte Hitzeschock- und Ethanolzufuhr in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase der Zellen. Die resultierenden HS30-Lysate sind mit Chaperonen angereichert und können in Mischungen mit S30-Lysaten für eine verbesserte MP-Faltungverwendet werden 22. Die CF-Expression in E. coli-Lysaten wird als gekoppelter Transkriptions-/Translationsprozess mit DNA-Templates betrieben, die Promotoren enthalten, die von der T7-RNA-Polymerase (T7RNAP) kontrolliert werden . Das Enzym kann effizient in BL21(DE3)-Sternzellen hergestellt werden, die das pAR1219-Plasmid29 tragen.
Zwei Kopien von MSP1E3D1 fügen sich zu einer Nanoscheibe mit einem Durchmesser von 10-12 nm zusammen, aber das unten beschriebene Protokoll kann auch für andere MSP-Derivate funktionieren. Nanoscheiben, die größer sind als die mit MSP1E3D1 gebildeten, sind jedoch tendenziell weniger stabil, während kleinere Nanoscheiben, die mit MSP-Derivaten wie MSP1 gebildet werden, möglicherweise keine größeren MPs oder MP-Komplexe aufnehmen. MSP1E3D1-Nanoscheiben können in vitro mit einer Vielzahl unterschiedlicher Lipide oder Lipidgemische zusammengesetzt werden. Vorgeformte Nanoscheiben sind in der Regel für > 1 Jahr bei -80 °C stabil, während die Stabilität für verschiedene Lipidkomponenten variieren kann. Für das Screening von Lipideffekten auf die Faltung und Stabilität eines MP ist es notwendig, einen umfassenden Satz von Nanoscheiben herzustellen, die mit einer repräsentativen Vielfalt von Lipiden / Lipidmischungen zusammengesetzt sind. Die folgenden Lipide können eine gute Ausgangsauswahl ergeben: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC), 1,2 Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerin) (DOPG), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) und 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC).
Ein Protokoll zur Herstellung einer 3-ml-CECF-Reaktion wird beschrieben. Eine weitere Skalierung nach oben oder unten im Verhältnis 1:1 ist möglich. Für die CECF-Konfiguration mit zwei Kompartimenten muss ein RM hergestellt werden, der alle Verbindungen enthält, und ein FM, der nur die niedermolekularen Verbindungen enthält. Handelsübliche 3-ml-Dialysegeräte mit 10-14 kDa MWCO können als RM-Behälter verwendet werden, die dann in speziell angefertigte Plexiglasbehälter mit dem FM (Abbildung 1D)30 gelegt werden. Das Verhältnis von RM:FM beträgt 1:20, so dass 60 mL FM für 3 mL RM vorbereitet werden müssen. Qualität, Konzentration oder Art mehrerer Komponenten können für die Endausbeute und/oder Qualität des synthetisierten MP entscheidend sein (Tabelle 1). DNA-Templates sollten nach veröffentlichten Richtlinien erstellt werden und die Codon-Optimierung des Leserahmens des Ziels kann die Produktausbeute weiter signifikant verbessern26. Für die CECF-Reaktion im präparativen Maßstab wird ein etabliertes Protokoll für die Herstellung von PR beschrieben. Um Expressionsprotokolle für neue MPs zu erstellen, ist es in der Regel notwendig, Optimierungsscreens bestimmter Verbindungen (Tabelle 1) durchzuführen, um Ausbeute und Qualität zu verbessern. Für Mg2+ Ionen existiert ein gut fokussiertes Konzentrationsoptimal, das häufig signifikante Variationen für verschiedene DNA-Templates zeigt. Andere CF-Reaktionsverbindungen wie neue Chargen von T7RNAP oder S30-Lysaten können die optimaleMg2+ -Konzentration weiter verschieben. Als Beispiel wird ein typischer Mg 2+ Bildschirm im Bereich von 14-24 mM Konzentration und in Schritten von 2 mM beschrieben. Jede Konzentration wird in Duplikaten und in analytischen Reaktionen des CECF untersucht. Als CECF-Reaktionsbehälter werden kundenspezifische Mini-CECF-Plexiglasbehälter30 mit dem RM in Kombination mit Standard-24-Well-Mikroplatten verwendet, die das FM enthalten (Abbildung 1B). Alternativ können handelsübliche Dialysekartuschen in Kombination mit 96-tiefen Mikrotiterplatten oder anderen handelsüblichen Dialysatorgeräten in geeigneten Aufbauten verwendet werden (Abbildung 1C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840445P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850345C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840475C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals (USA)</td>
			<td>ART0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)</td>
			<td>Merck (Germany)</td>
			<td>1409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Germany)</td>
			<td>A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alprenolol hydrochloride</td>
			<td>Merck (Germany)</td>
			<td>A0360000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose&#174;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>Q1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave Type GE 446EC-1</td>
			<td>Gettinge (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor Type 884 124/1</td>
			<td>B.Braun (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks</td>
			<td>Schott Duran (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing</td>
			<td>Fisher Scientific (Germany)</td>
			<td>8700152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreit</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell disruptor</td>
			<td>SLM; Amico Instruments (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate di-sodium salt (GTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>K025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL</td>
			<td>GE Life Sciences (Germany)</td>
			<td>GE17-5248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3076.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>HN23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>9359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophane</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>7700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MD100 dialysis units</td>
			<td>Scienova (Germany)</td>
			<td>40077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethansulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecylphosphocholine</td>
			<td>Antrace (USA)</td>
			<td>F308S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel power supply: Power Pac 3000</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone/peptone from caseine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump: ip-12</td>
			<td>Ismatec (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenol pyruvate monopotassium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich (Germany)</td>
			<td>860077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Roche (Germany)</td>
			<td>10109045001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter: Hidex 300 SL</td>
			<td>Hidex (Finland)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS pellets</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>8029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>K305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Nanodrop</td>
			<td>Peqlab (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer/fluorescence reader Spark&#174;</td>
			<td>Tecan (Switzerland)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (E. coli)</td>
			<td>Roche (Germany)</td>
			<td>10109550001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra sonificator</td>
			<td>Labsonic U, B. Braun (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#8217;-triphosphate tri-sodium salt (UTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-30 antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>A6457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>2904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs

Zellfreie Expressionssysteme ermöglichen das maßgeschneiderte Design von Reaktionsumgebungen, um die funktionelle Faltung selbst komplexer Proteine wie Membranproteine zu unterstützen. Die experimentellen Verfahren zur co-translationalen Insertion und Faltung von Membranproteinen in vorgeformte und definierte Membranen, die als Nanoscheiben geliefert werden, werden demonstriert. Das Protokoll ist völlig reinigungsmittelfrei und kann innerhalb eines Tages Milligramm gereinigter Proben erzeugen. Die resultierenden Membranprotein-/Nanoscheibenproben können für eine Vielzahl von funktionellen Studien und strukturellen Anwendungen wie Kristallisation, Kernspinresonanz oder Elektronenmikroskopie verwendet werden. Die Herstellung grundlegender Schlüsselkomponenten wie zellfreie Lysate, Nanoscheiben mit entworfenen Membranen, kritische Stammlösungen sowie der Aufbau von zellfreien Zweikompartiment-Expressionsreaktionen wird beschrieben. Da die Faltungsanforderungen von Membranproteinen sehr unterschiedlich sein können, liegt ein Schwerpunkt dieses Protokolls auf der Modulation von Parametern und Reaktionsschritten, die für die Probenqualität wichtig sind, wie kritische basische Reaktionsverbindungen, Membranzusammensetzung von Nanoscheiben, Redox- und Chaperonumgebung oder DNA-Template-Design. Der gesamte Prozess wird mit der Synthese von Proteorhodopsin und einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor demonstriert.

Der Einfluss der Feinabstimmung von Reaktionsverbindungen auf die Endausbeute oder Qualität synthetisierter MPs wird veranschaulicht. Ein häufiger Routineansatz besteht darin, die optimaleMg2+-Konzentration in CF-Reaktionen durch Expression von grün fluoreszierendem Protein (GFP) als bequemen Monitor der Systemeffizienz einzustellen. Als Beispiel wurde GFP aus einem pET-21a(+)-Vektor beiMg2+-Konzentrationen zwischen 14 und 24 mM synthetisiert (Abbildung 2). Die SDS-P...

Watch this Scientific Journal Video about Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs at JoVE.com

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Die kotranslationale Insertion in vorgeformte Nanoscheiben ermöglicht es, zellfrei synthetisierte Membranproteine in definierten Lipidumgebungen ohne Kontakt mit Detergenzien zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung wesentlicher Systemkomponenten und die kritischen Parameter zur Verbesserung der Expressionseffizienz und Probenqualität.

Co-translationale Insertion von Membranproteinen in vorgeformte Nanoscheiben

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Stickstoff-Kavitation und differentielle Zentrifugation ermöglicht eine Überwachung der Verteilung von peripheren Membranproteinen in kultivierten Zellen

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolierung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb zur Untersuchung des bakteriellen Pathogens Fettsäure-Inkorporation in Membranphospholipide

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisierung von SUMO-modifizierten Proteinen mit fluoreszierenden Sumo-Fallen Proteinen

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, ein Ein-Schritt-Einbindung von Membranproteinen in biotinylierte Peptidiscs für optimierte Proteinbindungstests

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay zur quantitativen Bestimmung der Palmitoylierung von Gehirnmembranproteinen

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...