Name: co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs at JoVE.com

ברצוננו להודות למענק דויטשה פורשונגסגמיינשאפט (DFG) BE1911/8-1, לפרויקט LOEWE GLUE, ולמרכז המחקר המשותף תחבורה ותקשורת על פני ממברנות (SFB807) על התמיכה הכספית.

1. הכנת ליזאט S30
<ol><li>יום 1: הוציאו תאים ממלאי גליצרול על צלחת אגר LB ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>יום 2: לחסן 200 מ"ל של מדיום LB עם התאים מצלחת אגר לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12-14 שעות.</li>
	<li>יום 3: חיסון 10 ליטר של מדיום YPTG סטרילי (10 גרם/ל' תמצית שמרים, ...

<ol>
	<li>Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+for+protein+production+and+purification+enabling+membrane+protein+structural+biology.">Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).</li><li>Ritchie, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs.</a> Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).</li><li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lipoprotein+nanoparticle+system+for+membrane+proteins.">A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins.</a> Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+stability+can+be+compromised+by+detergent+interactions+with+the+extramembranous+soluble+domains.">Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains.</a> Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Junge, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-free+protein+synthesis+for+the+functional+and+structural+analysis+of+membrane+proteins.">Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins.</a> New Biotechnology. 28 (3), (2011).</li><li>Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+extract-based+cell-free+expression+system+as+an+alternative+for+difficult-to-obtain+protein+biosynthesis.">Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).</li><li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+discoidal+phospholipid+bilayer+nanoparticles+with+membrane+scaffold+proteins.">Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins.</a> Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).</li><li>Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+expression:+no+cells+required.">Membrane protein expression: no cells required.</a> Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).</li><li>Roos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+co-translationally+formed+nanodisc+complexes+with+small+multidrug+transporters,+proteorhodopsin+and+with+the+E.+coli+MraY+translocase.">Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodelivery+of+a+functional+membrane+receptor+to+manipulate+cellular+phenotype.">Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-translational+approaches+for+producing+mammalian+receptors:+expanding+the+cell-free+expression+toolbox+using+nanolipoproteins.">Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins.</a> Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).</li><li>Rues, R. B., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+formation+and+pharmacological+characterization+of+beta1-adrenergic+receptor/nanodisc+complexes+with+different+lipid+environments.">Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+native+membrane+protein+assembly+in+nanodiscs+by+combined+non-covalent+mass+spectrometry+and+synthetic+biology.">Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology.</a> eLife. 6, 1-19 (2017).</li><li>Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+tools+to+study+co-translational+folding+of+alpha+helical+membrane+transporters.">Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+requirements+for+the+enzymatic+activity+of+MraY+translocases+and+in+vitro+reconstitution+of+the+lipid+II+synthesis+pathway.">Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).</li><li>Peetz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+co-translational+membrane+protein+insertion+by+combined+LILBID-mass+spectrometry+and+NMR+spectroscopy.">Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).</li><li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+scale+expression+of+membrane+proteins+in+Escherichia+coli-based+continuous+exchange+cell-free+systems.">Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).</li><li>Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+a+functional+G+protein-coupled+receptor+complexed+with+nanometer+scale+bilayer+discs.">Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs.</a> BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).</li><li>Rues, R. B., Dong, F., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+optimization+of+cell-free+synthesized+human+endothelin+B+receptor+folding.">Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding.</a> Methods. 147 (1), 73-83 (2018).</li><li>Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., D&#246;tsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+organic+cation+transporter+1+contains+three+binding+sites+for+substrate+1-methyl-4-phenylpyridinium+per+monomer.">Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer.</a> Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).</li><li>Matthies, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+and+assembly+of+ATP+synthase.">Cell-free expression and assembly of ATP synthase.</a> Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).</li><li>Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+profiling+of+E.+coli+inner+membrane+proteins.">Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins.</a> Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).</li><li>Haberstock, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+to+increase+the+efficiency+of+membrane+protein+production+in+cell-free+expression+systems.">A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems.</a> Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).</li><li>Falkinham, J. O., Clark, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+a+double+male+strain+of+Escherichia+coli+K12.">Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12.</a> Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).</li><li>Foshag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E.+coli+S30+lysate+proteome:+A+prototype+for+cell-free+protein+production.">The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production.</a> New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).</li><li>Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+the+gene+for+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).</li><li>Reckel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+cell-free+expression+of+membrane+proteins.">Strategies for the cell-free expression of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperativity+in+cytochrome+P450+3A4:+Linkages+in+substrate+binding,+spin+state,+uncoupling,+and+product+formation.">Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).</li><li>Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+gene+expression+with+an+improved+green+fluorescent+protein.">Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+to+function+cell-free+electrophysiological+and+optical+analysis+of+ion+pumps+in+nanodiscs.">From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).</li><li>Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+model+membranes:+Seeking+better+ways+to+retain+protein+activities.">Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).</li></ol>

מתוארות ההגדרות והאסטרטגיות למיטוב ביטוי ה- CF והכנסת התרגום המשותף של חברי פרלמנט פונקציונליים לננו-דיסקים. הציוד הנדרש כולל ביוריאקטור, מכשיר עיתונות צרפתי או דומה, קורא UV/VIS ופלואורסצנציה, כלי תגובה CF המתאימים למערך תצורה דו-תאי, ואינקובטור מבוקר טמפרטורה. ציוד סטנדרטי נוסף הוא צנטריפוג...

חלבוני ממברנה (MPs) הם מטרות מאתגרות במחקרי ייצור חלבונים בשל חוסר המסיסות שלהם בסביבות מימיות. פלטפורמות ייצור MP קונבנציונליות מורכבות ממערכות מבוססות תאים כגון E. coli, שמרים או תאים אאוקריוטים. חברי הפרלמנט הרקומביננטיים המסונתזים מופקים מקרום התא או מקופלים מחדש מגופי הכללה1. לאחר סילוק חומרי ניקוי, חברי פרלמנט יכולים להיות מועברים לסביבות ממברנה מתאימות על ידי פרוטוקולים שנקבעו במבחנה מחדש. מלבד שלפוחיות וליפוזומים, שחזור MP לממברנות מישוריות בצורה של חלקיקי ננו-דיסקים2 או סליפרו3 הפכו לטכניקות שגרתיות בתקופה האחרונה. עם זאת, כל האסטרטגיות הללו מרמזות על מגע דטרגנט עם חברי פרלמנט שיכול לגרום לערעור יציבות, דיסוציאציה של אוליגומרים, ואפילו אובדן מבנה החלבוןופעילותו 4. לפיכך, בדיקה לאיתור תנאי סילוק ושיקום אופטימליים של חומרי ניקוי יכולה להיות מייגעת ולגזול זמןרב 5.
האופי הפתוח של מערכות נטולות תאים (CF) מאפשר לתגובת הביטוי להיות מסופקת ישירות עם ממברנות מוכנות מראש עם הרכב שומנים מוגדר. במצב ביטוי מבוסס שומנים זה (L-CF), לחברי הפרלמנט המסונתזים יש הזדמנות להכניס במשותף לתוךה-bilayers 6,7 שסופקו (איור 1). ננו-דיסקים המורכבים מחלבון פיגום ממברנה (MSP) סביב דיסק דו-שכבתי של שומנים מישוריים8 נראים מתאימים במיוחד לאסטרטגיה זו 9,10. ננו-דיסקים יכולים להיות מורכבים באופן שגרתי במבחנה עם מגוון של שומנים שונים, הם יציבים מאוד, ומלאי יכול להיות מרוכז עד 1 mM. עם זאת, ביטוי MSP ב E. coli וטיהור שלה הוא הכרחי. כאסטרטגיה חלופית, MSP יכול לבוא לידי ביטוי יחד עם MP היעד בתגובות CF המסופקות עם ליפוזומים11,12,13. תבניות דנ"א הן עבור MSP והן עבור MP מתווספות לתגובה, ו-MP/nanodiscs יכולים להיווצר עם הביטוי. בעוד שייצור MSP נמנע, אסטרטגיית הביטוי המשותף דורשת כוונון קפדני של ריכוזי תבנית הדנ"א הסופיים וניתן לצפות לשינויים גבוהים יותר ביעילות ייצור הדגימה.
ההחדרה המשותפת של חברי פרלמנט לממברנות של ננו-דיסקים מוכנים מראש היא מנגנון לא פיזיולוגי ועדיין לא ידוע במידה רבה, שאינו תלוי במכונות טרנסלוקון וברצפי אותות13,14,15,16. הגורמים העיקריים המשפיעים על יעילות ההחדרה הם סוג חלבון הממברנה וכן הרכב השומנים של הממברנה המסופקת, עם העדפה תכופה לשומנים טעונים שלילית15,17. מכיוון שהממברנות הננו-דיסקיות מוגבלות יחסית בגודלן, כמות משמעותית של שומנים משתחררת עם הכנסת MP18. וריאציה של גודל ננו-דיסקים מאפשרת החדרה וכוונון של קומפלקסי MP אוליגומריים גבוהיםיותר 15,18. בין היתר, הוצגה הרכבה נכונה של קומפלקסים הומוליגומריים עבור תעלת היונים KcsA, עבור משאבת היונים פרוטאורהודופסין (PR) ועבור הטרנספורטר הרב-דרגי EmrE15,18. חברי פרלמנט צפויים להיכנס לממברנה הננו-דיסקית הסימטרית משני הצדדים בתדר שווה יחסית. לפיכך יש לקחת בחשבון כי מונומרים או אוליגומרים שונים המוחדרים לננו-דיסקית אחת עשויים להיות בעלי כיוונים מנוגדים. עם זאת, הטיה בכיוון יכולה להיגרם על ידי מנגנוני החדרה שיתופיים כפי שדווחו להיווצרות של הקסמרים יחסי ציבור וטטרמרים KcsA18. הטיה נוספת בכיוון MP עשויה לנבוע ממתגי התמצאות של חברי פרלמנט שהוכנסו, ככל הנראה בשפת הממברנות הננו-דיסקיות.
ייצור ליזטים של CF מזני E. coli הוא טכניקה שגרתית אמינה וניתן לבצע אותה כמעט בכל מעבדה ביוכימית19,20. יש לקחת בחשבון כי מלבד היווצרות גשר דיסולפידים, רוב השינויים האחרים שלאחר התרגום נעדרים אם MP מסונתז באמצעות E. coli lysates. בעוד שזה עשוי ליצור דגימות הומוגניות יותר למחקרים מבניים, ייתכן שיהיה צורך לשלול השפעות פוטנציאליות על תפקודן של מטרות MP בודדות. עם זאת, הייצור היעיל של דגימות באיכות גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCR)14,21,22, טרנספורטרים אאוקריוטים 23 או מכלולים הטרומריים גדולים 24 בליזאטים של E. coli CF מצביע על התאמתם אפילו למטרות מורכבות. ניתן לקבל כמויות בקנה מידה מכין (≈ 1 מ"ג/מ"ל) של דגימה עם תצורת שני תאים ללא תאים רציפים (CECF), המורכבת מתערובת תגובה (RM) ותא תערובת הזנה (FM). נפח ה-FM עולה על נפח RM פי 15 עד פי 20 ומספק מאגר של תרכובות אנרגיה בעלות משקל מולקולרי נמוך ומבשרי19. תגובת הביטוי מוארכת אפוא למספר שעות והתפוקה הסופית של יעד ה- MP גדלה. תאי ה-RM וה-FM מופרדים על ידי קרום דיאליזה עם ניתוק של 10-14 kDa. שני התאים דורשים עיצוב מיוחד של מיכל התגובה CECF (איור 1). קלטות דיאליזה מסחריות כמיכלי RM בשילוב עם מיכלי פרספקס מותאמים המחזיקים את ה- FM הם דוגמאות מתאימות. ניתן לתמרן עוד יותר את תשואות MP על ידי שינוי יחסי RM:FM או על ידי החלפת ה- FM לאחר תקופה מסוימת של דגירה.
תפוקה ואיכות של MP דורשות לעתים קרובות אופטימיזציה אינטנסיבית של פרמטרי התגובה. יתרון חשוב של ביטוי CF הוא האפשרות לשנות ולדייק כמעט כל תרכובת בהתאם לדרישות האישיות של חבר פרלמנט. אסטרטגיה פשוטה היא להתמקד תחילה בשיפור התפוקה של MP על ידי יצירת פרוטוקול ייצור בסיסי ולאחר מכן לייעל את איכות MP על ידי כוונון עדין של התגובה ותנאי הקיפול. היעדר תהליכים פיזיולוגיים בליזאטים של CF ומורכבותם המופחתת גורמים לשיעורי הצלחה גבוהים לייצור יעיל של חברי פרלמנט25. שיקולים שגרתיים לתכנון תבנית דנ"א ואופטימיזציה של ריכוז היונים Mg 2+ מספיקים ברוב המקרים כדי להשיג תשואות משביעות רצון26. בהתאם למצב הביטוי, אופטימיזציה של איכות MP יכולה לגזול זמן רב, מכיוון שיש לסנן מגוון גדול יותר של פרמטרים14,17,22.
כדי לבסס את פלטפורמת ביטוי ה-CF המתוארת, פרוטוקולים נחוצים לייצור E . coli CF lysate (i), T7 RNA פולימראז (ii), ננודיסקים (iii) ותרכובות התגובה הבסיסיות של CECF (iv) (איור 1). נגזרות זן E . coli K12 A1927 או BL21 משמשות לעתים קרובות להכנת ליזטים יעילים מסוג S30 (צנטריפוגה ב-30,000 x גרם). מלבד ליזטים מסוג S30, ניתן להשתמש בליזאטים מקבילים הצנטריפוגים בכוחות g אחרים (למשל S12). הליזאטים נבדלים זה מזה ביעילות הביטוי ובמורכבות הפרוטאום. הפרוטאום של ליזאט S30 שהוכן על ידי הפרוטוקול המתואר נחקר בפירוט28. הפרוטאום S30 עדיין מכיל כמה חלבוני ממברנה חיצונית שיורית שיכולים לתת בעיות רקע בעת ביטוי וניתוח של תעלות יונים. עבור מטרות כאלה, מומלץ להשתמש ב- S80-S100 lysates. שינוי רב ערך במהלך הכנת ליזאט הוא אינדוקציה של תגובת SOS על ידי הלם חום משולב ואספקת אתנול בשלב הגדילה באמצע לוג של התאים. הליזטים HS30 המתקבלים מועשרים במלווים וניתן להשתמש בהם בתערובות עם ליזטים S30 לקיפול MPמשופר 22. ביטוי CF בליזאטים של E. coli מופעל כתהליך שעתוק/תרגום מצומד עם תבניות דנ"א המכילות מקדמים הנשלטים על ידי T7 RNA פולימראז (T7RNAP). האנזים יכול להיות מיוצר ביעילות בתאי כוכב BL21(DE3) הנושאים את פלסמיד pAR121929.
שני עותקים של MSP1E3D1 מורכבים לננו-דיסק אחד בקוטר של 10-12 ננומטר, אך הפרוטוקול המתואר להלן עשוי לעבוד גם עבור נגזרות MSP אחרות. עם זאת, ננו-דיסקים גדולים יותר מאלה שנוצרו עם MSP1E3D1 נוטים להיות פחות יציבים, בעוד שננו-דיסקים קטנים יותר שנוצרו עם נגזרות MSP כגון MSP1 עשויים שלא להכיל קומפלקסים גדולים יותר של חברי פרלמנט או MP. ניתן להרכיב ננו-דיסקים של MSP1E3D1 במבחנה עם מגוון גדול של שומנים שונים או תערובות שומנים. ננודיסקים מוכנים מראש הם בדרך כלל יציבים במשך > שנה אחת ב -80 מעלות צלזיוס, בעוד היציבות עשויה להשתנות עבור רכיבי שומנים שונים. לצורך סינון השפעות השומנים על קיפול ויציבות של MP, יש צורך להכין מערך מקיף של ננודיסקים המורכבים ממגוון מייצג של תערובות ליפידים/שומנים. השומנים הבאים עשויים לתת בחירה התחלתית טובה: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-פלמיטויל-2-אולאויל-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) ו-1-פלמיטואיל-2-אולאויל-גליצרו-3-פוספוקולין (POPC).
מתואר פרוטוקול להכנת תגובת CECF של 3 מ"ל. שינוי קנה מידה נוסף למעלה או למטה ביחס של 1:1 אפשרי. עבור תצורת CECF הדו-תארית, יש להכין RM המכיל את כל התרכובות ו- FM המכיל רק את התרכובות בעלות המשקל המולקולרי הנמוך. מכשירי דיאליזה מסחריים של 3 מ"ל עם 10-14 kDa MWCO יכולים לשמש כמכולות RM, אשר ממוקמות לאחר מכן במיכלי פרספקס בהתאמה אישית המחזיקים את ה- FM (איור 1D)30. היחס של RM:FM הוא 1:20, ולכן 60 מ"ל של FM צריכים להיות מוכנים ל-3 מ"ל RM. איכות, ריכוז או סוג של מספר רכיבים יכולים להיות קריטיים לתפוקה הסופית ו/או לאיכות של ה-MP המסונתז (טבלה 1). תבניות DNA צריכות להיות מוכנות על פי ההנחיות שפורסמו ואופטימיזציה קודונית של מסגרת הקריאה של היעד יכולה לשפר עוד יותר באופן משמעותי את תפוקת המוצר26. עבור תגובת CECF בקנה מידה הכנה, מתואר פרוטוקול מבוסס לייצור יחסי ציבור. כדי לקבוע פרוטוקולי ביטוי עבור חברי פרלמנט חדשים, בדרך כלל יש צורך לבצע מסכי אופטימיזציה של תרכובות מסוימות (טבלה 1) כדי לשפר את התפוקה והאיכות. עבור יוני Mg2+ , קיים ריכוז אופטימלי ממוקד היטב שלעתים קרובות מראה שונות משמעותית עבור תבניות דנ"א שונות. תרכובות אחרות של תגובת CF, כגון אצוות חדשות של T7RNAP או ליזטים מסוג S30, עשויות לשנות עוד יותר את הריכוז האופטימלי של Mg2+ . לדוגמה, מסך Mg 2+ טיפוסי בטווח של ריכוז14-24 mM ובשלבים של 2 mM מתואר. כל ריכוז מוקרן בכפילויות ובתגובות CECF בקנה מידה אנליטי. כמיכל תגובה של CECF, מיכלי פרספקס Mini-CECF בהתאמה אישית30 המחזיקים את ה-RM משמשים בשילוב עם מיקרו-לוחות סטנדרטיים של 24 בארות המחזיקים את ה-FM (איור 1B). לחלופין, ניתן להשתמש במחסניות דיאליזה מסחריות בשילוב עם מיקרו-לוחות באר בעומק 96 או התקני דיאליזר מסחריים אחרים בתצורות מתאימות (איור 1C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840445P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850345C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840475C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals (USA)</td>
			<td>ART0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)</td>
			<td>Merck (Germany)</td>
			<td>1409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Germany)</td>
			<td>A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alprenolol hydrochloride</td>
			<td>Merck (Germany)</td>
			<td>A0360000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose&#174;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>Q1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave Type GE 446EC-1</td>
			<td>Gettinge (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor Type 884 124/1</td>
			<td>B.Braun (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks</td>
			<td>Schott Duran (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing</td>
			<td>Fisher Scientific (Germany)</td>
			<td>8700152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreit</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell disruptor</td>
			<td>SLM; Amico Instruments (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate di-sodium salt (GTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>K025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL</td>
			<td>GE Life Sciences (Germany)</td>
			<td>GE17-5248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3076.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>HN23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>9359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophane</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>7700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MD100 dialysis units</td>
			<td>Scienova (Germany)</td>
			<td>40077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethansulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecylphosphocholine</td>
			<td>Antrace (USA)</td>
			<td>F308S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel power supply: Power Pac 3000</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone/peptone from caseine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump: ip-12</td>
			<td>Ismatec (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenol pyruvate monopotassium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich (Germany)</td>
			<td>860077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Roche (Germany)</td>
			<td>10109045001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter: Hidex 300 SL</td>
			<td>Hidex (Finland)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS pellets</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>8029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>K305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Nanodrop</td>
			<td>Peqlab (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer/fluorescence reader Spark&#174;</td>
			<td>Tecan (Switzerland)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (E. coli)</td>
			<td>Roche (Germany)</td>
			<td>10109550001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra sonificator</td>
			<td>Labsonic U, B. Braun (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#8217;-triphosphate tri-sodium salt (UTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-30 antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>A6457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>2904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs

מערכות ביטוי ללא תאים מאפשרות תכנון מותאם אישית של סביבות תגובה כדי לתמוך בקיפול פונקציונלי של אפילו חלבונים מורכבים כגון חלבוני ממברנה. ההליכים הניסיוניים להחדרה וקיפול של חלבוני ממברנה לתוך ממברנות מוכנות ומוגדרות המסופקות כננו-דיסקים מודגמים. הפרוטוקול נטול דטרגנטים לחלוטין ויכול לייצר מיליגרם של דגימות מטוהרות תוך יום אחד. דגימות חלבון/ננו-דיסקים של הממברנה המתקבלות יכולות לשמש למגוון מחקרים פונקציונליים ויישומים מבניים כגון התגבשות, תהודה מגנטית גרעינית או מיקרוסקופיית אלקטרונים. מתוארת הכנה של רכיבי מפתח בסיסיים כגון ליזטים ללא תאים, ננודיסקים עם ממברנות מעוצבות, פתרונות מלאי קריטיים וכן הרכבה של תגובות ביטוי דו-תאיות ללא תאים. מאחר שדרישות הקיפול של חלבוני ממברנה יכולות להיות מגוונות ביותר, המוקד העיקרי של פרוטוקול זה הוא אפנון של פרמטרים ושלבי תגובה החשובים לאיכות הדגימה כגון תרכובות תגובה בסיסיות קריטיות, הרכב ממברנה של ננו-דיסקים, חמצון-חיזור וסביבת מלווה, או עיצוב תבניות DNA. התהליך כולו מודגם עם סינתזה של פרוטאורהודופסין וקולטן מצומד לחלבון G.

ההשפעה של תרכובות תגובה של כוונון עדין על התפוקה הסופית או האיכות של חברי פרלמנט מסונתזים מודגמת. גישה שגרתית נפוצה היא להתאים את הריכוז האופטימלי של Mg2+ בתגובות CF על ידי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כניטור נוח של יעילות המערכת. לדוגמה, GFP סונתז מווקטור pET-21a(+) בריכוזי Mg 2+ בין 14...

Watch this Scientific Journal Video about Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs at JoVE.com

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

החדרה משותפת לננו-דיסקים שנוצרו מראש מאפשרת לחקור חלבוני ממברנה מסונתזים ללא תאים בסביבות שומנים מוגדרות ללא מגע עם חומרי ניקוי. פרוטוקול זה מתאר את הכנת רכיבי המערכת החיוניים ואת הפרמטרים הקריטיים לשיפור יעילות הביטוי ואיכות הדגימה.

החדרה משותפת של חלבוני ממברנה לננו-דיסקים מוכנים מראש

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

בידוד של חלקיקי ליפופרוטאין מעוף חלמון ביצה לחקר הפתוגן חומצות שומן בקטריאלי התאגדות לתוך ממברנה פוספוליפידים

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, שילוב של צעד אחד של חלבונים ממברנות לתוך ביוטילדיסקי Peptiquick עבור כריכת חלבון מפושטת

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl החליפין ג'ל שינוי שיטת להגדרה כמותית של פלמילציה של חלבונים קרום המוח

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...