Name: co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs at JoVE.com

Vi takker Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BE1911/8-1, LOEWE-prosjektet LIM og forskningssenteret Transport and Communication across Membranes (SFB807) for økonomisk støtte.

1. Tilberedning av S30 lysat
<ol><li>Dag 1: Strek ut celler fra glyserollagre på en LB-agarplate og inkuber ved 37 ° C over natten.</li>
	<li>Dag 2: Inokuler 200 ml LB-medium med cellene fra agarplaten og inkuber ved 37 ° C i 12-14 timer.</li>
	<li>Dag 3: Inokulere 10 L sterilt YPTG-medium (10 g / L gjærekstrakt, 16 g / L trypton, 5 g / L NaCl, 19,8 g / L glukose, 4,4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K2HPO4) herdet til 37 ° C i en 15 ...

<ol>
	<li>Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+for+protein+production+and+purification+enabling+membrane+protein+structural+biology.">Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).</li><li>Ritchie, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs.</a> Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).</li><li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lipoprotein+nanoparticle+system+for+membrane+proteins.">A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins.</a> Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+stability+can+be+compromised+by+detergent+interactions+with+the+extramembranous+soluble+domains.">Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains.</a> Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Junge, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-free+protein+synthesis+for+the+functional+and+structural+analysis+of+membrane+proteins.">Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins.</a> New Biotechnology. 28 (3), (2011).</li><li>Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+extract-based+cell-free+expression+system+as+an+alternative+for+difficult-to-obtain+protein+biosynthesis.">Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).</li><li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+discoidal+phospholipid+bilayer+nanoparticles+with+membrane+scaffold+proteins.">Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins.</a> Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).</li><li>Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+expression:+no+cells+required.">Membrane protein expression: no cells required.</a> Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).</li><li>Roos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+co-translationally+formed+nanodisc+complexes+with+small+multidrug+transporters,+proteorhodopsin+and+with+the+E.+coli+MraY+translocase.">Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodelivery+of+a+functional+membrane+receptor+to+manipulate+cellular+phenotype.">Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-translational+approaches+for+producing+mammalian+receptors:+expanding+the+cell-free+expression+toolbox+using+nanolipoproteins.">Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins.</a> Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).</li><li>Rues, R. B., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+formation+and+pharmacological+characterization+of+beta1-adrenergic+receptor/nanodisc+complexes+with+different+lipid+environments.">Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+native+membrane+protein+assembly+in+nanodiscs+by+combined+non-covalent+mass+spectrometry+and+synthetic+biology.">Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology.</a> eLife. 6, 1-19 (2017).</li><li>Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+tools+to+study+co-translational+folding+of+alpha+helical+membrane+transporters.">Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+requirements+for+the+enzymatic+activity+of+MraY+translocases+and+in+vitro+reconstitution+of+the+lipid+II+synthesis+pathway.">Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).</li><li>Peetz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+co-translational+membrane+protein+insertion+by+combined+LILBID-mass+spectrometry+and+NMR+spectroscopy.">Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).</li><li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+scale+expression+of+membrane+proteins+in+Escherichia+coli-based+continuous+exchange+cell-free+systems.">Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).</li><li>Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+a+functional+G+protein-coupled+receptor+complexed+with+nanometer+scale+bilayer+discs.">Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs.</a> BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).</li><li>Rues, R. B., Dong, F., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+optimization+of+cell-free+synthesized+human+endothelin+B+receptor+folding.">Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding.</a> Methods. 147 (1), 73-83 (2018).</li><li>Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., D&#246;tsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+organic+cation+transporter+1+contains+three+binding+sites+for+substrate+1-methyl-4-phenylpyridinium+per+monomer.">Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer.</a> Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).</li><li>Matthies, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+and+assembly+of+ATP+synthase.">Cell-free expression and assembly of ATP synthase.</a> Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).</li><li>Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+profiling+of+E.+coli+inner+membrane+proteins.">Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins.</a> Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).</li><li>Haberstock, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+to+increase+the+efficiency+of+membrane+protein+production+in+cell-free+expression+systems.">A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems.</a> Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).</li><li>Falkinham, J. O., Clark, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+a+double+male+strain+of+Escherichia+coli+K12.">Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12.</a> Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).</li><li>Foshag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E.+coli+S30+lysate+proteome:+A+prototype+for+cell-free+protein+production.">The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production.</a> New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).</li><li>Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+the+gene+for+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).</li><li>Reckel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+cell-free+expression+of+membrane+proteins.">Strategies for the cell-free expression of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperativity+in+cytochrome+P450+3A4:+Linkages+in+substrate+binding,+spin+state,+uncoupling,+and+product+formation.">Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).</li><li>Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+gene+expression+with+an+improved+green+fluorescent+protein.">Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+to+function+cell-free+electrophysiological+and+optical+analysis+of+ion+pumps+in+nanodiscs.">From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).</li><li>Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+model+membranes:+Seeking+better+ways+to+retain+protein+activities.">Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).</li></ol>

Oppsettet og strategiene for å optimalisere CF-uttrykket og co-translasjonell innsetting av funksjonelle parlamentsmedlemmer i nanodiscs er beskrevet. Det nødvendige utstyret består av en bioreaktor, en trykkanordning eller lignende, en UV/VIS- og fluorescensleser, CF-reaksjonsbeholdere egnet for et to-roms konfigurasjonsoppsett og en temperaturkontrollert inkubator. Ytterligere standardutstyr er sentrifuger for høsting av E. coli-celler samt sentrifuger på bordplaten som når minst 30 000 x g for ...

Membranproteiner (MP) er utfordrende mål i proteinproduksjonsstudier på grunn av deres uoppløselighet i vandige miljøer. Konvensjonelle MP-produksjonsplattformer består av cellebaserte systemer som E. coli, gjær eller eukaryote celler. De syntetiserte rekombinante parlamentsmedlemmene blir enten ekstrahert fra cellemembraner eller foldet på nytt fra inkluderingsorganer1. Etter oppløselig oppløsning av vaskemiddel kan MP-er overføres til egnede membranmiljøer ved hjelp av etablerte in vitro-rekonstitueringsprotokoller. Foruten vesikler og liposomer har MP-rekonstituering i plane membraner i form av nanoskiver2 eller salipro3-partikler blitt rutinemessige teknikker i nyere tid. Imidlertid innebærer alle disse strategiene vaskemiddelkontakt med parlamentsmedlemmer som kan resultere i destabilisering, dissosiasjon av oligomerer og til og med tap av proteinstruktur og aktivitet4. Screening for optimale løsemiddel- og rekonstitueringsforhold kan derfor være kjedelig og tidkrevende5.
Den åpne naturen til cellefrie (CF) systemer gjør at ekspresjonsreaksjonen kan tilføres direkte med preformerte membraner med en definert lipidsammensetning. I denne lipidbaserte ekspresjonsmodusen (L-CF) har de syntetiserte parlamentsmedlemmene muligheten til å sette inn 6,7 (figur 1) i de medfølgendedobbeltlagene (figur 1). Nanodiscs bestående av et membranstillasprotein (MSP) som omgir en plan lipid dobbeltlagsskive8 ser ut til å være spesielt egnet for denne strategien 9,10. Nanodiscs kan rutinemessig settes sammen in vitro med en rekke forskjellige lipider, de er svært stabile, og lagrene kan konsentreres opp til 1 mM. Imidlertid er MSP-uttrykk i E. coli og dets rensing nødvendig. Som en alternativ strategi kan MSP uttrykkes sammen med mål-MP i CF-reaksjoner levert med liposomer11,12,13. DNA-maler for både MSP og MP legges inn i reaksjonen og MP/nanodiscs kan dannes ved uttrykk. Mens MSP-produksjon unngås, krever samuttrykksstrategien nøye finjustering av de endelige DNA-malkonsentrasjonene, og høyere variasjoner i effektiviteten av prøveproduksjonen kan forventes.
Den ko-translasjonelle innsettingen av MP-er i membraner av preformerte nanoskiver er en ikke-fysiologisk og fortsatt stort sett ukjent mekanisme uavhengig av translokonmaskiner og signalsekvenser13,14,15,16. Hoveddeterminanter for innsettingseffektiviteten er typen membranprotein samt lipidsammensetningen av den medfølgende membranen, med hyppig preferanse for negativt ladede lipider15,17. Siden nanodiscmembranene er relativt begrenset i størrelse, frigjøres en betydelig mengde lipider ved MP-innsetting18. Variasjon av nanodiscstørrelse muliggjør innsetting og justering av høyere oligomere MP-komplekser15,18. Blant annet ble riktig montering av homooligomere komplekser vist for ionkanalen KcsA, for ionpumpeproteorhodopsin (PR) og for multidrugtransportøren EmrE15,18. Parlamentsmedlemmer vil sannsynligvis komme inn i den symmetriske nanodiscmembranen fra begge sider med relativt lik frekvens. Det bør derfor tas i betraktning at forskjellige monomerer eller oligomerer satt inn i en nanoskive kan ha motsatte retninger. Imidlertid kan en skjevhet i orientering være forårsaket av kooperative innsettingsmekanismer som rapportert for dannelsen av PR-heksamerer og KcsA-tetramerer18. En ytterligere skjevhet i MP-orientering kan skyldes orienteringsbrytere av innsatte parlamentsmedlemmer sannsynligvis ved kanten av nanodiscmembranene.
Produksjonen av CF-lysater fra E. coli-stammer er en pålitelig rutineteknikk og kan utføres i nesten alle biokjemiske laboratorier19,20. Det bør vurderes at i tillegg til disulfidbroformasjon, er de fleste andre posttranslasjonelle modifikasjoner fraværende hvis en MP syntetiseres ved bruk av E. coli-lysater. Selv om dette kan generere mer homogene utvalg for strukturelle studier, kan det være nødvendig å utelukke potensielle effekter på funksjonen til individuelle MP-mål. Imidlertid indikerer effektiv produksjon av høykvalitetsprøver av G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) 14,21,22, eukaryote transportører 23 eller store heteromere samlinger 24 i E. coli CF-lysater deres egnethet for selv komplekse mål. Forberedende skalamengder (≈ 1 mg / ml) av en prøve kan oppnås med den to-roms kontinuerlige utvekslingscellefrie (CECF) konfigurasjonen, sammensatt av en reaksjonsblanding (RM) og en matblanding (FM) rom. FM-volumet overstiger RM-volumet 15 til 20 ganger og gir et reservoar av lavmolekylære energiforbindelser og forløpere19. Uttrykksreaksjonen forlenges dermed i flere timer, og det endelige utbyttet av MP-målet økes. RM- og FM-rommene er adskilt av en dialysemembran med en 10-14 kDa cutoff. De to rommene krever en spesiell utforming av CECF-reaksjonsbeholderen (figur 1). Kommersielle dialysekassetter som RM-beholdere i kombinasjon med skreddersydde plexiglassbeholdere som holder FM er egnede eksempler. MP-utbytter kan videre manipuleres ved å endre RM: FM-forholdene eller ved å bytte FM etter en viss inkubasjonsperiode.
Utbytte og kvalitet på en MP krever ofte intens optimalisering av reaksjonsparametere. En viktig fordel med CF-uttrykk er muligheten til å modifisere og finjustere nesten hvilken som helst forbindelse i henhold til de individuelle kravene til en MP. En enkel strategi er å fokusere først på å forbedre utbyttet av en MP ved å etablere en grunnleggende produksjonsprotokoll og deretter å optimalisere MP-kvaliteten ved å finjustere reaksjons- og foldeforhold. Fraværet av fysiologiske prosesser i CF-lysater og deres reduserte kompleksitet resulterer i høye suksessrater for effektiv produksjon av parlamentsmedlemmer25. Rutinemessige hensyn for DNA-maldesign og optimalisering av Mg 2+ ionkonsentrasjon er i de fleste tilfeller tilstrekkelig for å oppnå tilfredsstillende utbytte26. Avhengig av uttrykksmodus kan optimalisering av MP-kvalitet bli tidkrevende, ettersom et større utvalg av parametere må screenes14,17,22.
For å etablere den beskrevne CF-ekspresjonsplattformen er protokoller nødvendige for produksjon av E. coli CF-lysat (i), T7 RNA-polymerase (ii), nanodiscs (iii) og de grunnleggende CECF-reaksjonsforbindelsene (iv) (figur 1). E. coli K12-stammen A1927 eller BL21-derivater brukes ofte til fremstilling av effektive S30 (sentrifugering ved 30 000 x g) lysater. Foruten S30-lysater kan tilsvarende lysater sentrifugert ved andre g-krefter (f.eks. S12) benyttes. Lysatene varierer i ekspresjonseffektivitet og i proteomkompleksitet. Proteomet til S30-lysatet utarbeidet ved den beskrevne protokollen er studert i detalj28. Proteomet S30 inneholder fortsatt noen gjenværende ytre membranproteiner som kan gi bakgrunnsproblemer ved ekspresjon og analyse av ionekanaler. For slike mål anbefales bruk av S80-S100 lysater. En verdifull modifikasjon under lysatpreparasjon er induksjonen av SOS-responsen ved kombinert varmesjokk og etanolforsyning ved midten av cellens vekstfase. De resulterende HS30-lysatene er beriket i chaperones og kan brukes i blandinger med S30-lysater for forbedret MP-folding22. CF-ekspresjon i E. coli-lysater drives som en koblet transkripsjons-/oversettelsesprosess med DNA-maler som inneholder promotorer kontrollert av T7 RNA-polymerase (T7RNAP). Enzymet kan produseres effektivt i BL21 (DE3) Stjerneceller som bærer pAR1219 plasmid29.
To kopier av MSP1E3D1 monteres i en nanodisc med en diameter på 10-12 nm, men protokollen beskrevet nedenfor kan også fungere for andre MSP-derivater. Imidlertid har nanodiscs større enn de som er dannet med MSP1E3D1 en tendens til å være mindre stabile, mens mindre nanodiscs dannet med MSP-derivater som MSP1 kanskje ikke rommer større parlamentsmedlemmer eller MP-komplekser. MSP1E3D1 nanodiscs kan monteres in vitro med et stort utvalg av forskjellige lipider eller lipidblandinger. Preformerte nanoplater er vanligvis stabile i > 1 år ved -80 °C, mens stabiliteten kan variere for ulike lipidkomponenter. For screening av lipideffekter på folding og stabilitet av en MP, er det nødvendig å utarbeide et omfattende sett med nanodiscs satt sammen med et representativt utvalg av lipider / lipidblandinger. Følgende lipider kan gi et godt startvalg: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glyserol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-rac-(1-glyserol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glyserol) (POPG) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin (POPC).
En protokoll for fremstilling av en 3 ml CECF-reaksjon er beskrevet. Videre opp- eller nedskalering i forholdet 1:1 er mulig. For den to-roms CECF-konfigurasjonen må en RM som inneholder alle forbindelser og en FM som bare inneholder forbindelsene med lav molekylvekt fremstilles. Kommersielle 3 ml dialyseenheter med 10-14 kDa MWCO kan brukes som RM-beholdere, som deretter plasseres i skreddersydde pleksiglassbeholdere som holder FM (figur 1D) 30. Forholdet mellom RM: FM er 1:20, så 60 ml FM må være forberedt på 3 ml RM. Kvalitet, konsentrasjon eller type av flere komponenter kan være kritisk for det endelige utbyttet og / eller kvaliteten på den syntetiserte MP (tabell 1). DNA-maler bør utarbeides i henhold til publiserte retningslinjer, og kodonoptimalisering av leserammen til målet kan ytterligere forbedre produktutbyttet26. For forberedende skala CECF-reaksjon beskrives en etablert protokoll for produksjon av PR. For å etablere uttrykksprotokoller for nye parlamentsmedlemmer, er det vanligvis nødvendig å utføre optimaliseringsskjermbilder av visse forbindelser (tabell 1) for å forbedre utbyttet og kvaliteten. For Mg2+ -ioner finnes det et godt fokusert konsentrasjonsoptimum som ofte viser betydelig variasjon for ulike DNA-maler. Andre CF-reaksjonsforbindelser som nye batcher av T7RNAP eller S30 lysater kan ytterligere forskyve den optimale Mg2+ konsentrasjonen. Som et eksempel beskrives en typisk Mg 2+ skjerm innenfor området 14-24 mM konsentrasjon og i trinn på 2 mM. Hver konsentrasjon screenes i duplikater og i analytisk skala CECF-reaksjoner. Som CECF-reaksjonsbeholder brukes skreddersydde Mini-CECF pleksiglassbeholdere30 som holder RM i kombinasjon med standard 24-brønns mikroplater som holder FM (figur 1B). Alternativt kan kommersielle dialysepatroner i kombinasjon med 96-dype brønnmikroplater eller andre kommersielle dialysatorenheter i passende oppsett brukes (figur 1C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840445P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850345C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840475C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals (USA)</td>
			<td>ART0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)</td>
			<td>Merck (Germany)</td>
			<td>1409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Germany)</td>
			<td>A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alprenolol hydrochloride</td>
			<td>Merck (Germany)</td>
			<td>A0360000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose&#174;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>Q1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave Type GE 446EC-1</td>
			<td>Gettinge (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor Type 884 124/1</td>
			<td>B.Braun (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks</td>
			<td>Schott Duran (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing</td>
			<td>Fisher Scientific (Germany)</td>
			<td>8700152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreit</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell disruptor</td>
			<td>SLM; Amico Instruments (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate di-sodium salt (GTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>K025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL</td>
			<td>GE Life Sciences (Germany)</td>
			<td>GE17-5248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3076.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>HN23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>9359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophane</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>7700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MD100 dialysis units</td>
			<td>Scienova (Germany)</td>
			<td>40077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethansulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecylphosphocholine</td>
			<td>Antrace (USA)</td>
			<td>F308S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel power supply: Power Pac 3000</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone/peptone from caseine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump: ip-12</td>
			<td>Ismatec (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenol pyruvate monopotassium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich (Germany)</td>
			<td>860077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Roche (Germany)</td>
			<td>10109045001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter: Hidex 300 SL</td>
			<td>Hidex (Finland)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS pellets</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>8029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>K305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Nanodrop</td>
			<td>Peqlab (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer/fluorescence reader Spark&#174;</td>
			<td>Tecan (Switzerland)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (E. coli)</td>
			<td>Roche (Germany)</td>
			<td>10109550001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra sonificator</td>
			<td>Labsonic U, B. Braun (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#8217;-triphosphate tri-sodium salt (UTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-30 antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>A6457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>2904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs

Cellefrie ekspresjonssystemer tillater skreddersydd design av reaksjonsmiljøer for å støtte funksjonell folding av selv komplekse proteiner som membranproteiner. De eksperimentelle prosedyrene for co-translasjonell innsetting og folding av membranproteiner i preformerte og definerte membraner levert som nanodiscs er demonstrert. Protokollen er helt vaskemiddelfri og kan generere milligram rensede prøver i løpet av en dag. De resulterende membranprotein- / nanodiscprøvene kan brukes til en rekke funksjonelle studier og strukturelle anvendelser som krystallisering, kjernemagnetisk resonans eller elektronmikroskopi. Fremstilling av grunnleggende nøkkelkomponenter som cellefrie lysater, nanoplater med designede membraner, kritiske lagerløsninger samt montering av to-roms cellefrie uttrykksreaksjoner er beskrevet. Siden foldekrav til membranproteiner kan være svært varierte, er et hovedfokus i denne protokollen modulering av parametere og reaksjonstrinn som er viktige for prøvekvalitet, for eksempel kritiske grunnleggende reaksjonsforbindelser, membransammensetning av nanoplater, redoks- og chaperonmiljø eller DNA-maldesign. Hele prosessen er demonstrert med syntese av proteorhodopsin og en G-proteinkoblet reseptor.

Virkningen av finjustering av reaksjonsforbindelser på det endelige utbyttet eller kvaliteten på syntetiserte parlamentsmedlemmer er eksemplifisert. En hyppig rutinemessig tilnærming er å justere den optimale Mg2+-konsentrasjonen i CF-reaksjoner ved å uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP) som en praktisk overvåking av systemets effektivitet. Som et eksempel ble GFP syntetisert fra en pET-21a (+) vektor ved Mg 2+ konsentrasjoner mellom 14 og 24 mM (figur 2)....

Watch this Scientific Journal Video about Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs at JoVE.com

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Co-translasjonell innsetting i pre-formede nanodiscs gjør det mulig å studere cellefrie syntetiserte membranproteiner i definerte lipidmiljøer uten kontakt med vaskemidler. Denne protokollen beskriver utarbeidelsen av viktige systemkomponenter og de kritiske parametrene for å forbedre uttrykkseffektiviteten og prøvekvaliteten.

Co-translasjonell innsetting av membranproteiner i preformerte nanodiscs

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode for å visualisere og analysere Membran samspill proteiner av transmisjonselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Nitrogen kavitasjon og differensial sentrifugering tillater overvåking fordelingen av ytre membran proteiner i kulturperler celler

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel uten lynraske rekonstituering membran proteiner i Lipid Bilayers bruker Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning av vaskemiddel-sensitive interaksjoner mellom membran proteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering av lipoprotein partikler fra Chicken egg eggeplomme for studier av bakteriell patogen fatty acid innlemmelse i membran fosfolipider

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifisert proteiner bruke fluorescerende Sumo-fangst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, en ett-trinns innlemmelse av membran proteiner i Biotinylated Peptidiscs for strømlinjeformet protein bindende analyser

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analyse for kvantitativ bestemmelse av palmitoylering av hjernemembranproteiner

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...