Name: array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 47 s
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我们要感谢洛桑大学EM设施的成员在AT程序不同步骤的开发过程中的支持。我们要感谢Gareth Griffiths，Marta Rodrigues，Urska Repnik，Christel Genoud，Helmut Gnaegi，Einat Zelinger，Paola Moreno-Roman，Lucy O'Brien和Lindsay Lewellyn在手稿准备和批判性阅读期间进行的讨论。我们要感谢贡献用于演示不同场景的样本的团体：Matthias Lutolf，Michail Nikolaev，Devanjali Dutta，Till Matzat和Fanny Langlet。

注：样品制备方法在14、30、31的其他地方有描述，本出版物中没有涉及。简而言之，所示实例用戊二醛化学固定，用1%OsO4后固定，然后用1%乙酸铀酰水溶液处理，然后包埋在包埋树脂中。或者，可以使用高压冷冻制备样品，用丙酮中的0.1%乙酸铀酰取代冷冻，并嵌入丙烯酸树脂中。使用平面包埋方法制备样品块，该方法允许清晰地查看样品，便于切片的方向（图1B）。
1. 阵列生成过程
<ol><li>嵌入式样品方向和修剪<ol>
<li>使用双目/显微镜，用剃须刀片轻轻划伤块表面，识别并标记嵌入块表面的投资回报率。这将有助于将样品定向到超薄切片机内，并减少切片表面。</li>
		<li>将样品夹在超微量组支架上（图2A）。</li>
		<li>修剪样品周围的树脂，首先使用剃须刀片（粗修剪），然后继续使用金刚石修剪工具（精细修剪; 图 2A）。使用边缘倾斜度为 20° 或 90° 的刀具，以确保块的顶部和底部平行于刀刃。 注：此步骤对于连续切片和获取直带至关重要。</li>
		<li>以3：1的比例混合二甲苯和胶水。将睫毛连接到牙签上，将这种混合物涂抹在修剪过的块的顶部和底部边缘。让它彻底干燥。</li>
	</ol>
</li>
	<li>准备阵列安装支架A（即硅晶圆）。<ol>
<li>使用晶圆切割工具（EMS）切割晶圆片，根据项目目标调整其尺寸。2 cm x 4 cm 便于进行光学和电子显微镜观察。</li>
		<li>在蒸馏水中清洁晶圆以清除碎屑。</li>
		<li>辉光放电/等离子体使用标准设备清洁表面。精确的参数将取决于所使用的机器。从电网放电的参数开始，并按经验调整时间。此步骤对于在部分干燥时支撑上的部分的良好铺展至关重要，不应省略。</li>
	</ol>
</li>
	<li>准备阵列安装支架B（即玻璃盖玻片）<ol>
<li>如果计划进行多重免疫标记实验，请将样品转移到盖玻片上，以更好地检测荧光信号。为了提高盖玻片的粘合性，请使用前面9中描述的详细的明胶包衣程序。</li>
		<li>通过蒸发将载玻片涂上铟锡氧化物（ITO）或金来增加导电性。将准备好的盖玻片保存在干净的环境中。辉光放电样品如1.2.3中所述。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 样品切片
<ol><li>阿特刀准备 注：要生成阵列，请使用改进的刀（ATS），该刀旨在便于获取长带。为在大型支架上生成截面而设计的Histo-Jumbo刀或类似的刀具也可以用于AT切片。<ol>
<li>使用泡沫胶带将针连接到刀的底部并刺穿它（图2B）。将ATS刀以0°的速度放入超薄片支架中。使用标准程序平行于块表面调整刀的边缘。</li>
		<li>将修剪过的块放在刀的边缘，使其处于准备切片的位置。</li>
		<li>将晶圆/盖玻片放入刀盆内，并用水填充到与刀刃相同的水平。让刀的金刚石边缘适当加湿，如有必要，使用连接的注射器抽水（图2C）。</li>
	</ol></li>
	<li>阵列切片和传输<ol>
<li>将切片机设置为所需的切割参数。使用ATS刀，建议使用50-100 nm的范围和0.6-1 mm / s的切割速度。开始切片（图2Di）。</li>
		<li>获取长度将覆盖目标 z 卷的功能区并停止收集。根据块的大小，组织的均匀性和树脂的类型，色带将相对笔直（图2D-ii）。许多样品不会产生直的丝带，尽管投入了精力并且使用了刀的类型。</li>
		<li>根据最终目标，使一条或几条长条或几条短丝带并排对齐。2 cm x 4 cm 的支架可以方便地容纳 100 到 1，000 个截面。支撑台阶上缎带的排列是需要灵巧和稳定的手的步骤。然而，这项技能的学习曲线是迅速获得的。</li>
		<li>使用粘在牙签上的干净，不粘的睫毛尖端将色带从刀刃上拆下（图2Diii）。</li>
		<li>使用睫毛，轻轻地将丝带移到支撑介质的中心上方。此时，如果需要，请使用氯仿或加热笔拉伸切片。但是，请记住，这种操作可能会导致色带断裂和变形。</li>
		<li>通过拉动注射器开始排干水。对于更精致的丝带或较慢的水回缩，通过将注射器从软管上拆下，让水滴落。当水位降低到晶圆液位时，控制碳带并在必要时通过轻轻地将碳带推向中心来重新定位。将带状物沉降在晶圆表面上后，继续排水，直到剩余的水完全从盆中收回。 注意：如果不使用底部水缩回ATS刀，请小心减少ATS刀侧面的水，以免引起湍流。</li>
		<li>将浴缸内支架上的部分部分完全晾干。根据支撑的疏水性和环境湿度水平，水将以不同的速率蒸发（图2Div）。重要的是让样品慢慢干燥以减少或完全避免样品上的所有褶皱。</li>
		<li>将干样品转移到密闭的盒子中以防止污垢污染，并将其置于60°C的烘箱中至少30分钟。如果需要，使用重金属复色切片以增强整体对比度。</li>
		<li>在程序结束时，按照制造商的说明谨慎清洁刀具 注：晶圆上多个或串行部分的传输（图2E）与槽栅格上的传输（图2F）相比，完全改变了EM制备体验。在单个支撑上不间断地切片和收集截面，减少了连续分切中常见的剖面和截面收集相关错误的数量。相当于在一个晶圆上收集的100个1000μm x 500μm的切片对应于33个插槽网格（图2G）。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 样品观察
注意：本节介绍使用市售软件实现的工作流步骤（请参见 材料表）。可以使用任何配备正确探测器的SEM上的任何图像采集软件，但是，特定的用户操作会有所不同，并且通常需要更多的手动操作。
<ol><li>获取SEM图像的概览图，以显示晶圆上的截面位置。内置光学相机图像有助于定义覆盖部分或所有部分的SEM图像镶嵌。通过单击-拖动鼠标在样品的相机图像上创建镶嵌，然后启动 自动采集。 注意：非常粗糙的成像设置，即1-2 μm像素大小和1 μs停留时间就足够了。这一过程在 补充材料 （第2-7页）中进行了说明。</li>
	<li>使用剖面 查找器自动检测功能查找分区 或手动查找分区。此软件可根据图像匹配自动检索截面位置和轮廓。有关此过程的说明，请参阅 补充材料（第 8-15页）。</li>
	<li>如果概览图像不能清楚地显示ROI，请获取更高分辨率的切片图像。使用 分区预览 功能自动创建和获取图像。这一过程见 《补充材料》，第16-18页。必须根据用户搜索的 ROI 的性质和大小来选择映像设置。<ol>
<li>要找到最佳设置，请激活显微镜控制软件中的 实时成像 并导航到一个ROI。更改成像设置，直到图像清楚地显示ROI，但图像采集不会太长。</li>
	</ol></li>
	<li>定义映像区域 注：提出了几种不同的策略。<ol>
<li>如果只需要对几个部分进行成像，请使用到目前为止创建的部分的图像导航到相关部分，并使用 可缩放查看器 （显示其原始相对位置中所有采集的图像）来查看所有部分。找到应以高分辨率成像的部分后，使用单击-拖动创建成像区域。选择高分辨率图像处理设置并将设置存储在模板中。将此模板重用于其他部分。</li>
		<li>要发现特别小或难以检测的罕见事件，请使用横向筛查方法。在每十个部分或每个色带的一个部分上手动创建具有高分辨率成像设置的成像区域，并获取图像。查看软件中包含ROI的图像并标记部分或做笔记。<ol>
<li>从包含 ROI 的部分开始，在部分集中向前和向后导航，并在相同的相对位置创建高分辨率成像区域，只要结构在截面中仍然可见。这可以手动完成，也可以使用后续步骤中描述的过程来完成。</li>
		</ol>
</li>
		<li>在十多个连续部分中采集图像。缩放图像后 单击"开始位置细化 "，以提高注册截面位置的精度，如手册中所述。这样做会降低图像系列的位置可变性。该过程在 补充材料 第19-21页中进行了说明和解释。</li>
		<li>单击并拖动任何部分以定义图像区域，同时按住 Alt 键，然后从释放鼠标按钮时打开的上下文菜单中选择" 创建切片集阵列"。 然后，软件会在之前找到或标记的所有部分中的同一相对位置创建映像区域。可以使用"截面范围"滑块将成像限制在特定范围的 截面 。 注意：此过程可以对任意数量的成像区域重复，因此允许记录许多小型高分辨率图像，而不是在每个部分上记录单个较大的图像。</li>
		<li>创建后，根据需要在每个图像系列中设置像素计数、像素大小、平铺布局、像素停留时间等。创建和设置成像系列后，它们都将列在工作提示中。</li>
	</ol></li>
	<li>配置自动功能并开始图像采集<ol>
<li>使用与上一步中所述相同的方法为自动功能创建单独的图像系列。将图像系列移动到包含高对比度结构的截面上的某个位置。</li>
		<li>将图像系列设置为 1024 x 884 像素，然后选择与前面步骤中设置的图像系列中使用的最高分辨率相对应的像素大小。在自动功能列表中，选中 自动对焦 和 自动污名器。</li>
		<li>在采集顺序控件中选择按 部分 ，并确保自动功能图像是列表中的第一个项目。通过单击作业提示旁边的" 运行 "按钮开始图像采集。这些程序见 《补充材料》，第22-23页。 注意：无需手动预先关注每个部分。在记录过程中，每当显微镜前进到新部分时，在本节中记录所有其他图像之前，将执行自动功能。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 数据对齐和分析
<ol><li>数据导出<ol>
<li>确保以.tif格式保存数据，因此不需要专用的导出功能。将数据排序到与层树中的层和元素直接对应的文件夹结构中。</li>
		<li>记录图像镶嵌后，使用 StitchAll 功能自动拼接所有图块。</li>
	</ol>
</li>
	<li>斐济的堆叠对齐和裁剪 注意。许多软件包（免费和商业）可用于处理阵列断层扫描数据。以下步骤与开源程序Fiji32一起显示，因为它广泛可用并且包含所有必需的功能。<ol>
<li>将图像堆栈（或拼接的图像）作为虚拟堆栈导入斐济。</li>
		<li>如果需要对对比度/亮度进行标准化，请选择 "增强对比度..."从 "进程 "菜单中。将 饱和像素 设置为 0.1 或更低，然后选中 处理所有切片。</li>
		<li>从插件菜单中，选择 注册|线性堆栈与 SIFT 对齐。</li>
		<li>从预期转换下拉菜单中选择刚性或仿射。否则，请保留默认设置。通过单击"确定"开始对齐。 注意：将数据加载为虚拟堆栈允许斐济处理任何大小的堆栈。对齐的输出在RAM中创建;但是，这可能会限制可以处理的堆栈的最大大小。在这种情况下，请使用 注册虚拟堆栈切片，这是相同注册算法的文件夹到文件夹实现。注册完成后，将输出数据作为虚拟堆栈加载。</li>
		<li>通过单击"裁剪"来 裁剪 图像堆栈，使其仅包含 ROI。</li>
		<li>将堆栈另存为单个.tif图像或一系列.tif图像。 注：阵列断层扫描的关键步骤如图 3所示。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Luckner, M., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+light+microscopy+to+analytical+scanning+electron+microscopy+(SEM)+and+focused+ion+beam+(FIB)/SEM+in+biology:+Fixed+coordinates,+flat+embedding,+absolute+references.">From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+interphase+microtubules+in+fission+yeast+analyzed+by+electron+tomography.">Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography.</a> Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).</li><li>Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+studies+of+eukaryotic+cells+by+cryo-electron+tomography.">Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography.</a> Cells. 8 (1), 57 (2019).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).</li><li>Kubota, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+nanotube+tape+for+serial-section+electron+microscopy+of+brain+ultrastructure.">A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure.</a> Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).</li><li>Wacker, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+Hierarchical+Imaging+of+Serial+Sections+for+Finding+Specific+Cellular+Targets+within+Large+Volumes.">Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes.</a> Journal of Visualized Experiments. 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作者Tilman Franke是Thermo Fisher的员工，该公司生产本文中使用的电子显微镜和试点程序。

电子显微镜可以深入了解细胞和生物体的超微结构，为此，通常需要在其3维环境中对感兴趣的结构进行成像。尽管超微结构分析采用了多种EM策略，但仍然没有"黄金标准"解决方案。主要原因是样品种类繁多，许多生物学问题，通常需要量身定制的方法。建议的AT工作流程旨在最大限度地减少样品处理，数据采集，评估和存储所需的时间。此外，改进的刀为简化阵列采集提供了有用的工具。晶圆上切片的紧凑布局便于观察和随后的样品存储。这种布置通过从色带水平移动到另一个色带并仅扫描每个色带上的一个部分来实现样品的"横向筛选"，从而大大减少了定位ROI所需的时间。所提出的数据采集方案有助于瞄准小而随机分布的区域。一旦发现，AT/SEM将高分辨率成像精确地限制在感兴趣的体积，无论是手动执行还是在自动功能的帮助下执行。对于有限体积的AT，可以手动完成，操作员可以浏览样品并逐个定义成像区域。该软件的自动化模块为大截面上的小区域成像提供了灵活的图像采集策略。该软件中的自动化允许在数百个切片上记录大型高分辨率图像，从而实现与SBFI相似的体积。记录所有切片的概述图像可简化ROI定位并减少在显微镜下花费的时间。由于在记录概览和更高分辨率预览期间，这些部分不会受到损害，因此AT/SEM允许重复使用样品以收集其他ROI的进一步数据或以更高的分辨率。
图像采集时间是3D EM最重要（也是最昂贵）的方面之一，因此在实验设计中应予以考虑。虽然大面积成像比小面积成像需要更长的时间并不奇怪，但很容易低估其影响：根据所选的成像参数，每个部分的采集时间可能从几秒钟到几小时不等。关键成像参数包括视场大小、分辨率和停留时间。假设目标分辨率为每像素 10nm，停留时间为 1 μs，则成像 20 μm x 20 μm、100 μm x100 μm 或 500 μm x500 μm 的磁场需要 4 秒、100 秒或 2，500 秒才能记录下来。我们可以将这些每节成像时间乘以截面数，以估计完成成像作业所需的时间。如果切片数量很少或显微镜工具时间无关紧要，则每段成像时间长是可以接受的。
但是，在大多数情况下，有必要将录制时间限制为通宵工作或周末工作。应该考虑的3D EM的一个同样关键的方面是生成的图像数据的数量和结构。在100个部分中记录上述成像场分别生成400 mb，10 gb或250 gb的图像数据;500 μm x 500 μm 图像带来了每个大于 2 gb 的额外问题。许多用于数据评估的软件程序无法打开这种大小的图像。
为了缩短成像时间，选择像素停留时间以满足后续数据评估（例如，重建、跟踪）的信噪比要求非常重要，并将记录限制在定义的ROI内。该软件的AT扩展便于在串行部分的小区域内采集图像。该软件支持手动和自动工作流程以及许多半自动变体：成像区域可以手动定位并聚焦在每个部分，或者用户可以使用自动切片查找器和位置对齐功能。根据样品类型或成像目标选择和支持的自动化水平，在数百个切片中设置图像采集所需的时间可能需要整个工作日（手动完成）或几分钟。原则上，阵列断层扫描使得获得小投资回报率比其他3D EM方法更具挑战性;在连续截面上不精确的区域放置必须通过获取更大的区域来补偿。例如，如果ROI尺寸为20 μm x 20 μm，成像场的截面间位置变异性为10μm，则需要获取40 μm x 40 μm的图像，以确保在每个部分的每个图像中完全捕获ROI。实际图像位置变化范围从 100 μm 到 <10 μm，具体取决于用于位置对齐的软件功能的可用性或质量或用户的耐心。使用此软件，可以在大多数样品中实现10μm，而无需过多的手动干预。
与任何技术一样，AT有几个弱点可以影响成功的数据采集，其中许多类似于其他基于切片的方法。空树脂与组织缺乏均匀分布可能导致弯曲或破碎的阵列。在极端情况下，各部分可以从支撑上分离（图6A）。切割过程中的可变压缩或拉伸会产生褶皱，这些褶皱可能会在后续切片的可变区域破坏样品（图6B）。使用损坏的刀，在收集的部分的表面上可能会出现刀痕（图6C）。切片条件的差异会导致偶尔的切片压缩和厚度差异。灰尘或污垢颗粒可以落在一个部分并部分遮挡感兴趣的区域（图6D）。由于自动对比度、自动对焦和自动污名器功能不完善，图像采集可能会失败。自动创建的成像区域的定位可能是可变的，可能无法捕获所有部分的投资回报率。
在拼接和对准阶段可能会出现几个问题。例如，由于样品内部的大空白空间，马赛克瓷砖采集的自动拼接可能会失败。由于 3D 中形状的巨大变化，图像堆栈可能难以注册。专门开发的程序（例如，IMOD，斐济，TrackEM2，MIB或MAPS-AT）可以促进半自动对齐32，38，39，40。更具挑战性的部分可以使用照片编辑软件手动对齐。遗憾的是，某些数据集可能无法正确对齐。
对于安装在网格上的TEM连续截面来说，大样品具有挑战性;另一方面，许多项目没有理由使用FIB / SEM或SBF-SEM进行长时间的自动采集。AT是繁琐的串行截面TEM的直接替代方案，其中晶圆上串行截面的收集和操作比使用插槽网格更直接。我们开发了几种策略来促进数组的收集，我们分享了扩展现有工具包的方法。在ROI鉴定具有挑战性的情况下，AT-SEM提供了一个基本优势，可以有效地筛选需要50至500个切片的细胞器规模分辨率的样品。对于较大的卷，如果需要更多部分，可以有效地收集自动收集 AT 策略。AT样品可以多次重新成像，便于根据先前获取的概述图像对高分辨率区域进行有针对性的成像。我们认为，这里提出的AT/SEM的针对性分析和减少过采样降低了劳动力和数据存储要求。最终，可以收集和维护章节库，以便以后重用和咨询。对于体积采集，FIB或SBF-SEM方法在块面上易于识别ROI或分析需要大3D体积时，可提供出色的解决方案。但是，当必须有针对性地从定义的 ROI 收集高分辨率堆栈图像时，FIB/SBF-SEM 的效率会降低。综上所述，所提出的AT样品筛选方法和使用中分辨率的概述图像允许将图像采集限制在截面阵列的相关部分。成像区域的精确瞄准可加快数据获取时间并简化数据评估。
总而言之，尽管AT/SEM的概念并不新颖，但其使用仍然不像其优点所暗示的那样广泛。总体而言，它提供了与其他现有EM方法的补充程序。AT/SEM与最广泛的样品制备方案和成像工作流程兼容，可以在任何FIB/SEM或SBF-SEM显微镜上作为附带技术完成。在本文中，我们专注于AT，用于记录来自其他方法不太可能成功解决的样品的超微结构数据。我们希望，所描述的方便收集部分和相当自动化的获取策略的过程将有助于那些从未遇到过该方法的人的首次尝试，并将有助于为那些已经具有一定经验的人完善它。

尽管EM相关技术的重要性，但掌握它们所需的努力使整个领域仅限于少数专家。一个重大困难是为EM保存的样品中识别和检索感兴趣区域（ROI）。当通过光学显微镜分析和经过EM观察处理后，同一样品的外观有很大不同。化学制备的样品的变化包括脱水步骤后的各向异性样品收缩（每个维度约10%）以及在固定和染色方案中使用锇时荧光的损失（图1A）。对于超薄切片，使用不同的策略将样品嵌入环氧树脂或丙烯酸树脂中（图1B）。为了获得该制备的成功结果，必须将整个样品分馏成不超过1 mm x 1 mm的碎片。为了满足标准透射电子显微镜（TEM）观察条件的要求，样品的这一小部分被进一步切片为50-150nm厚的切片。由此产生的灰度图像比任何其他显微镜技术更详细地显示了整个样品的微小部分的组织组织和细胞器结构（图1C）。典型的TEM数据集提供2D信息，理论上推断以了解细胞和组织中3D空间中自然发生的过程。 图1D 提出了超微结构体积采集的挑战：如果在50nm厚度下切割1，000μm侧的立方体，则需要20，000个切片才能覆盖整个体积;对于500μm的侧立方体，它将是10，000个截面。要覆盖50 μm x 50 μm x 50 μm的体积，可能需要"仅"1，000个部分。手动获取此体积几乎是不可能的，并且对于自动化执行极具挑战性。如果除了样品深度之外，我们还需要覆盖这种假设立方体的整个表面，那么以合理的分辨率覆盖1μm2 表面就成为一个严重的逻辑问题（图1E）。虽然对于非同寻常的大型项目，如连接组学方法，大量的部分至关重要，但对于大多数"普通"的EM项目来说，生成观察所需的更多部分是一个显着的缺点。
有几种方法可以获取3D超微结构信息：连续切片透射电子显微镜（TEM），TEM断层扫描，阵列断层扫描（AT），连续块面成像扫描电子显微镜（SBF-SEM）和聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）。这些方法之间的主要区别在于切片策略以及图像采集是否耦合到第1代截面。在串行切片TEM中，在插槽网格上收集顺序截面，从这些序列生成TEM图像并对齐2，3，4，5。在TEM断层扫描中，倾斜网格上150-300nm截面的串联，并且当与串联切片时，可提供非常高的分辨率，尽管体积相对较小6，7，8。AT方法使用物理切片，在相对较大的支撑（例如玻璃盖玻片，硅晶圆或特殊胶带）上以各种手动和半自动方式收集切片。对于图像采集，在SEM中分析支持，具有不同的图像采集策略，可用9，10，11，12，13，14，15。 对于SBF-SEM，使用微型切片机实现物理切片，金刚石刀直接设置在SEM腔室内，从树脂块16，17，18，19的表面生成SEM图像。对于FIB-SEM，离子源去除样品的薄层，然后通过SEM20，21对暴露的表面进行自动成像。透射电镜断层扫描和AT产生物理切片，必要时可以重新成像，而FSBF-SEM和FIB-SEM在成像后消除切片。最近由多波束SEM成像的物理部分的组合提供了一种方法的组合，解决了图像采集速度22的"瓶颈"问题。这些技术中的每一种都彻底改变了获取和分析EM数据的方式，并且每种方法都有其与给定研究问题相关的实际影响。
鉴于制备的性质和超微结构尺寸的规模，预测特定目标结构在样品块中的位置并不简单（图1D，E）。ROI定位的一种解决方案是从一开始就以所需的分辨率记录整个块的图像。当远离显微镜时，感兴趣的结构可以在采集的数据量中。与此策略相关的采集时间和数据处理存在问题。需要减少记录的数据量，特别是如果ROI比组织块小得多，即，如果感兴趣的对象是特定类型的细胞（而不是整个器官）。不同的相关光和电子显微镜技术（CLEM）可以成功地在制备之前或之后在同一样品23，24，25，26，27，28，29中保存和定位荧光。然而，即使没有荧光相关性，许多细胞结构也是可识别的，仅基于已知的超微结构。对于这些情况，我们认为横向筛选阵列断层扫描在投资回报率定位和超微结构信息质量方面投入的努力之间提供了平衡的权衡。使用这种策略，在定期间隔内筛选晶圆上的子部分集，这可以根据ROI的大小和性质建立。一旦找到ROI，数据采集就会在锚点部分之前和之后开始的连续一系列部分中设置，从而有针对性地收集相关信息。
我们提出了AT协议，可以简化和加速在众多部分中获取感兴趣的区域或事件，并产生更协调的图像量。横向筛选和多步骤采集可在精确目标区域生成非常高分辨率的数据。我们描述的程序解决了3D EM数据采集的几个挑战，因为它提供了：与各种样品的兼容性，而不会从根本上改变样品制备工作流程;针对切片和扫描电镜采集进行有针对性的本地化;减少设置过程中的时间和精力;对多个部分的区域进行成像，并更好地对齐所得体积;以及平滑的拼接和对齐程序，将不同的图像编译成拼接的马赛克图片。我们选择通过来自已发布和正在进行的项目的几个示例来展示我们方法的强度。我们相信，这种方法可以极大地促进目标EM数据的生成和获取，即使对于EM经验有限的调查人员也是如此。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AT sectioning knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUATS3530</td>
			<td>Diatome Jumbo knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td>Diatome trimming 20&#176; 
			Glass knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16015</td>
			<td>Resistance: 1-30 Ohms 
			Type P: (Boron) (1 primary flat) 
			Roughness: 2 nm 
			No SiO2 top coating 
			TTV: = &#60;20 &#181;m 
			Wafer is polished on one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer cleaving kit</td>
			<td>EMS</td>
			<td>7642</td>
			<td>EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Thermo Fischer Helios</td>
			<td>1072419</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maps 3 for SEM with Correlative Workflow &#38; Array Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1135932</td>
			<td>Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira x.y</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131599</td>
			<td>Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td>IMOD, MIB (See text for refferences)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy

电子显微镜在生物学和医学中应用于以纳米分辨率对细胞和结构细节进行成像。从历史上看，透射电子显微镜（TEM）提供了对细胞超微结构的见解，但在最近十年中，现代扫描电子显微镜（SEM）的发展改变了观察细胞内部的方式。尽管当需要蛋白质水平的结构细节时，TEM的分辨率更优越，但SEM分辨率足以解决大多数细胞器水平细胞生物学相关问题。技术的进步使自动体积采集解决方案成为可能，例如串行块面成像（SBF-SEM）和聚焦离子束SEM（FIB-SEM）。然而，直到今天，当识别和导航到感兴趣的区域至关重要时，这些方法仍然效率低下。如果没有在成像前精确定位目标区域的方法，操作员需要获取比他们需要的多得多的数据（在SBF-SEM中），或者更糟糕的是，准备许多网格并对其进行全部成像（在TEM中）。我们提出了在SEM中使用阵列断层扫描的"横向筛选"策略，该策略有助于定位感兴趣区域，然后对总样品体积的相关部分进行自动成像。阵列断层扫描样品在成像过程中是保守的，它们可以被安排成切片库，准备重复成像。展示了几个示例，其中横向筛选使我们能够分析结构细节，这些细节对于使用任何其他方法都非常困难。

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Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

我们描述了连续切片的色带的制备及其在大型转移支持上的收集，以用作阵列断层扫描样品，以及扫描电子显微镜中的自动成像程序。该协议允许对局部罕见事件进行筛选，检索和有针对性的成像，并采集大量数据。

阵列断层扫描工作流程，用于使用扫描电子显微镜有针对性地采集体积信息

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

电子显微镜分析通常很复杂。我们相信，我们的协议有助于处理和获取来自大样品表面和中间体积的EM数据。我们的协议有助于在串行部分中找到目标结构。数据记录仅限于必要的内容。与全组织块中的数据采集相比，记录时间缩短，数据分析更容易。鉴于这种方法总体上很容易，我们认为它不仅可以用于解决科学问题，还可以用作诊断工具。要生成用于分析的阵列，首先将样品夹在超微量镜支架上，并使用剃须刀片粗略地修剪样品周围的树脂。使用金刚石修剪工具对样品进行精细修剪，并使用倾斜度为20或90度的修剪刀，以确保块的顶部和底部与刀的切削刃平行。以3：1的比例混合二甲苯和胶水，并使用连接到牙签的睫毛将混合物涂抹在修剪过的块的顶部和底部边缘。当混合物干燥时，使用晶圆切割工具将一块晶圆切割成适合分析的尺寸。在蒸馏水中清洁晶圆以冲洗掉任何碎屑，并在晶圆干燥后用等离子体清洁表面。要准备阵列断层扫描刀，请使用泡沫粘性胶带将针头连接到histo巨型刀的底部，并将刀以零度度放入超切片机支架中。调整平行于块表面的刀刃，并将修剪过的块带到刀的边缘，使其处于准备切片的位置。将干净的晶圆放入刀盆中，将水盆装满与刀刃相同的水平，然后，让刀的金刚石边缘适当加湿，根据需要使用随附的注射器添加或取水。对于阵列切片，将切片机设置为50至100纳米的切割范围和每秒6至1毫米的切割速度，然后开始切片以获得足够长的色带以覆盖目标Z体积。根据块的大小，组织的均匀性和树脂的类型，色带将大致为直的。使用干净、不粘的睫毛尖端将丝带从刀刃上取下。使用睫毛轻轻地将丝带移到支撑介质的中心。如有必要，可以使用氯仿或加热笔来拉伸该部分。拉伸后，缩回注射器以开始排干水。对于更精致的碳带或较慢的水回缩，请将注射器从软管上拆下，让水滴落。当水位达到晶圆水平时，轻轻地将带子推到盆的中心并继续排水，直到所有剩余的水完全从盆中除去。让晶圆在清洁的环境中干燥。干燥大约需要30分钟。当样品完全干燥后，将阵列转移到紧密封闭的盒子中，以保护其免受污垢污染。并将盒子放入60摄氏度的烤箱中至少30分钟。要获取显示晶圆上截面位置的SEM图像总览图，请使用内置光学相机获取覆盖部分功能区的SEM图像。要创建镶嵌，请单击并拖动样品的相机图像，然后开始自动采集。以更高的分辨率获取概视图以查找目标结构。如果只需要对几个部分进行成像，请使用可缩放查看器在其原始位置查看采集的图像。确定应以高分辨率成像的部分后，单击并拖动以创建成像区域，然后选择高分辨率成像设置并将设置存储在模板中 要查找特别小或难以检测的罕见事件，请使用每个第 10 个部分或每个功能区的一个部分上的高分辨率成像设置来手动创建成像区域并获取图像。然后查看图像并标记包含感兴趣区域的部分。要获取超过 10 个连续的剖面，请使用剖面查找器自动查找所有剖面。如果概览图像未显示清晰的感兴趣区域，请获取部分的更高分辨率图像，并使用部分预览功能自动创建和获取图像。要确定最佳成像设置，请根据制造商的指南，在显微镜控制软件中激活实时成像并导航到一个感兴趣区域，然后调整成像设置，直到图像显示清晰的感兴趣区域，但不会进行过长的图像采集。要优化连续截面上成像区域的定位，请缩放至感兴趣的图像，然后单击"开始位置细化"以提高注册截面位置的精度。要定义图像处理区域，请在按住 Alt 键的同时单击并拖动任何部分，然后从弹出式上下文菜单中选择"创建切片集阵列"。该软件将在已找到或先前标记的所有部分中的同一相对位置创建映像区域。然后根据需要在每个图像系列中设置像素计数、像素大小、平铺布局和像素停留时间。要配置自动功能，请为自动功能创建单独的图像系列，如所示，并将图像系列移动到包含高对比度结构的截面上的位置。将图像系列设置为 1024 x 884 像素，然后选择与图像系列中使用的最高分辨率相对应的像素大小。在自动功能列表中，选中自动对焦和自动污名化器。在采集序列控件中选择"双分"，并确认自动功能的图像是列表中的第一个项目，然后单击"全部采集"以开始图像采集。创建并设置所有映像系列后，该系列将列在作业队列中。低分辨率采集可以使用单个或镶嵌成像手动或直接在截面的选定部分或整个截面上自动执行，然后进行拼接。然后可以使用高分辨率参数从所选区域获取图像，以可视化线粒体，核和微绒毛，例如，在自动获取已选择的解析镶嵌贴图后，可以裁剪出多个感兴趣区域或用于定义区域内的其他局部成像区域。虽然果蝇肠道中的不同特殊细胞类型是随机分布的，但在使用高分辨率参数筛选图像后，可以从视觉上区分它们，无论是来自单个切片还是作为连续图像的集合。对齐后，可以使用不同的软件解决方案渲染堆栈。阵列层析成像分析允许在单个晶圆上生成许多连续截面，并使用低分辨率参数进行筛选，以定位感兴趣的一般区域。这些区域可以使用高级采集参数进行进一步分析。例如，notum中的真菌分裂不容易在超结构水平上定位，因为与脱落区相比，细胞相对较大。然而，使用这种方法，可以使用20到40个部分的跳跃的自动中分辨率概览图像来定位分裂的单元格。阵列断层扫描程序提供了更直接的电子显微镜数据分析。我们鼓励观众投资掌握再生并熟悉与地图相关的工作流程 根据我们的经验，很少有研究课题需要对整个动物或整个器官进行超结构分析。我们的方法有助于细胞及其相互作用伙伴在组织中的快速定位。

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扫描电子显微镜（SEM）协议有问题的工厂，卵菌和真菌样本

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

准备厚生物样品的观察扫描透射电子断层扫描

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

用活细胞显微镜研究低压等离子体灭菌对枯草芽孢杆菌孢子存活的不利影响

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

用化学干燥进行扫描电镜 (sem) 形态分析的原核生物和真核生物的制备

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

高压冷冻、微波辅助对比度增强和最小树脂嵌入在体积成像中的生物样品制备

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

使用串行块面和聚焦的Ion光束扫描电子显微镜进行有针对性的研究

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

生物组织样本的串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM）

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...