Name: array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Vi vil gerne takke medlemmerne af EM-faciliteten ved universitetet i Lausanne for deres støtte under denne udvikling af forskellige trin i AT-proceduren. Vi vil gerne takke Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O'Brien og Lindsay Lewellyn for diskussioner under udarbejdelsen af manuskriptet og kritisk læsning. Vi vil gerne anerkende de grupper, der har bidraget med de prøver, der blev brugt til at demonstrere de forskellige scenarier: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat og Fanny Langlet.

BEMÆRK: Prøveforberedelsesmetoder er beskrevet andetsteds14,30,31og er ikke omfattet af denne publikation. Kort sagt, de viste eksempler var kemisk fastgjort med glutaraldehyd, post-fast med 1% OsO4, derefter behandlet med 1% vandig uranylacetat før indlejring i integrer harpiks. Alternativt kan prøver fremstilles ved hjælp af højtryksfrysning, fryse erstattet med 0,1% uranylacetat i acetone og indlejret i akrylharpiks. Prøveblokke blev udarbejdet ved hjælp af en flad indlejringsmetode, der gør det muligt at se prøven klart, hvilket letter dens orientering for afsnittet (figur 1B).
1. Arraygenereringsprocedure
<ol><li>Integreret eksempelretning og trimning<ol>
<li>Brug kikkerten/mikroskopet til at identificere og markere investeringsafkast på den indlejrede blokoverflade ved let at ridse blokkens overflade med et barberblad. Dette vil bidrage til at orientere prøven inde i ultramicrotome og vil reducere sektionsoverfladen.</li>
		<li>Prøven fastspændes på ultramikrotomholderen (figur 2A).</li>
		<li>Trim harpiksen omkring prøven, først med barberbladet (groft trimning) og fortsæt med diamantbeskæringsværktøjet (fin trimning; Figur 2A. Brug knive med 20° eller 90° kanthældning for at sikre, at blokkens top- og bundoverflader er parallelle med knivens skærkant. BEMÆRK: Dette trin er afgørende for seriel sektion og erhvervelse af lige bånd.</li>
		<li>Bland xylen og lim i 3:1 proportion. Med en øjenvippe fastgjort til en tandstikker, anvende denne blanding til toppen og de nederste kanter af den trimmede blok. Lad det tørre grundigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klargør arraymonteringsstøtten A (dvs. siliciumvafler).<ol>
<li>Skær wafer stykket ved hjælp af en wafer kavalerering værktøj (EMS), justere sin størrelse til projektets mål. 2 cm x 4 cm er praktisk til både lys- og elektronmikroskopiobservationer.</li>
		<li>Rengør waferen i destilleret vand for at slippe af med resterne.</li>
		<li>Glødudladning/plasma rengør overfladen ved hjælp af standardudstyr. De præcise parametre afhænger af den anvendte maskine. Start med parametrene for netudladningen og empirisk justere tiden. Dette trin er afgørende for en god spredning af sektionerne på understæbningen, mens sektioner tørrer og ikke bør udelades.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klargør arrays monteringsstøtte B (dvs. glasfortræk)<ol>
<li>Hvis du planlægger multiplex immunmærkningsforsøg, skal du overføre prøverne på et coverlip for bedre at opdage fluorescenssignalet. For at forbedre coverslip klæbeevne, skal du bruge en detaljeret gelatine-belægning procedure er beskrevet tidligere9.</li>
		<li>Forøg ledningsevnen ved at overlægge diasene med indium-tinoxid (ITO) eller guld ved fordampning. Opbevar de forberedte dæksler i et rent miljø. Gløden udledes prøverne som beskrevet i 1.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Udsnit af prøven
<ol><li>At kniv forberedelse BEMÆRK: For at generere arrays skal du bruge en modificeret kniv (ATS), der er designet til at lette erhvervelsen af lange bånd. Histo-Jumbo knive eller lignende knive udtænkt til generering af sektioner på store støtter kan tjene til AT-sektionsopdelning så godt.<ol>
<li>Fastgør nålen til bunden af kniven ved hjælp af det skummende klæbebånd og gennembor det (Figur 2B). Anbring ATS-kniven i ultramikrotomholderen ved 0°. Juster knivens kant parallelt med blokoverfladen ved hjælp af standardproceduren.</li>
		<li>Bring den trimmede blok til kanten af kniven i en position klar til indsnit.</li>
		<li>Placer wafer /coverlip inde i knivbassinet og fyld den med vand til samme niveau som knivkanten. Lad knivens diamantkant befugte ordentligt, og træk om nødvendigt vand tilbage ved hjælp af den tilhørende sprøjte (Figur 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Arraysektion og overførsel<ol>
<li>Indstil mikrotomen til de ønskede skæreparametre. Med ATS-kniven er rækkevidden på 50-100 nm og en skærehastighed på 0,6-1 mm/ s tilrådeligt. Start afsnit(Figur 2Di).</li>
		<li>Få fat i et bånd af længden, der dækker en målrettet z-volumen og stoppe samlingen. Afhængigt af vævets homogenitet, homogenitet og harpikstype vil båndet være relativt lige (Figur 2D-ii). Mange prøver vil ikke producere lige bånd, på trods af den investerede indsats, og typen af kniv bruges.</li>
		<li>Afhængigt af det endelige mål skal du lave et langt eller flere korte bånd justeret side om side. En 2 cm x 4 cm støtte kan nemt holde 100 til 1.000 sektioner. Arrangementet af båndet på støttetrinnet er et trin, der kræver fingerfærdighed og stabile hænder. Men indlæringskurven for denne færdighed er hurtigt erhvervet.</li>
		<li>Løsriv båndet fra knivkanten ved hjælp af en ren, ikke-klæbrig spids af en øjenvippe limet på tandstikkeren (Figur 2Diii).</li>
		<li>Brug øjenvipperne til forsigtigt at flytte båndet over midten af støttemediet. På dette tidspunkt skal du bruge kloroform eller varmepen til at strække sektionerne, hvis det er nødvendigt. Husk dog, at denne manipulation kan fremkalde båndbrud og deformation.</li>
		<li>Begynd at tømme vandet ved at trække i sprøjten. For mere sarte bånd eller en langsommere vand tilbagetrækning, lad vand dryppe ved at løsne sprøjten fra slangen. Når vandstanden sænkes til waferniveauet, skal du styre båndet og flytte det om nødvendigt ved forsigtigt at skubbe båndet til midten. Efter afregning af båndene på waferoverfladen skal du fortsætte med at dræne, indtil det resterende vand er helt trukket tilbage fra bassinet. BEMÆRK: Hvis du ikke bruger den nederste vand tilbagetrækning ATS kniv, omhyggeligt reducere vandet fra siderne af ATS kniven for ikke at fremkalde turbulens.</li>
		<li>Lad sektionerne stå på støtten inde i badet for at lade tørre helt. Afhængigt af hydrofobicity af støtte og miljømæssig luftfugtighed, vil vand fordampe med en anden hastighed (Figur 2Div). Det er vigtigt at lade prøven tørre langsomt for at mindske eller helt undgå alle folder på prøven.</li>
		<li>Den tørre prøve overføres til en tæt lukket kasse for at beskytte mod snavsforurening, og den anbringes i en 60 °C ovn i mindst 30 min. Hvis det er nødvendigt, counterstain sektioner ved hjælp af tungmetaller til at øge den samlede kontrast.</li>
		<li>Ved afslutningen af proceduren skal kniven forsigtigt rengøres efter producentens anvisninger BEMÆRK: Overførslen af flere eller serielle sektioner på en wafer (Figur 2E) i forhold til overførslen på et slotnet (Figur 2F) ændrer EM-forberedelsesoplevelsen fuldstændigt. Den uafbrudte afsnit og samling af sektionerne på enkelt support reducerer mængden af sektionsopdel og sektionssamling relaterede fejl, der hyppige i seriel sektionsopsnit. Svarende til 100 sektioner på 1000 μm x 500 μm indsamlet på en wafer svarer til 33 slotgitre (figur 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Prøveobservation
BEMÆRK: I dette afsnit beskrives arbejdsgangstrinnene som implementeret ved hjælp af en kommercielt tilgængelig software (se Materialetabel). Enhver billedopsamlingssoftware på enhver SEM, der er udstyret med de korrekte detektorer, kan bruges, men de specifikke brugerhandlinger vil variere og vil ofte være mere manuelle.
<ol><li>Få et oversigtskort over SEM-billeder, der afslører sektionsplaceringer på waferen. Et indbygget optisk kamerabillede hjælper med at definere en SEM-billedmosaik, der dækker et bånd af sektioner eller alle sektioner. Opret mosaikken ved at klikke med musen lige på kameraet billedet af prøven og starte automatisk erhvervelse. BEMÆRK: Meget grove billeddannelsesindstillinger, dvs. 1-2 μm pixelstørrelse og 1 μs, er tilstrækkelig. Denne proces er illustreret i supplerende materiale (side 2-7).</li>
	<li>Find sektioner med funktionen Automatisk registrering af sektionssøgning, eller find dem manuelt. Sektionsplaceringer og dispositioner hentes automatisk med denne software baseret på billedmatchning. For illustration af denne proces henvises til supplerende materiale (side 8 - 15).</li>
	<li>Hvis oversigtsbillederne ikke viser ROI'er klart, skal du anskaffe billeder af sektioner med højere opløsning. Brug funktionen Sektionseksempel til at oprette og hente billeder automatisk. Denne proces er illustreret i Supplerende Materiale, side 16-18. Billedbehandlingsindstillinger skal vælges i henhold til arten og størrelsen af det investeringsafkast, som brugeren søger efter.<ol>
<li>Hvis du vil finde optimale indstillinger, skal du aktivere Live Imaging i mikroskopstyringssoftwaren og navigere til ét investeringsafkast. Ændre billedindstillingerne, indtil billederne viser INVESTERINGSAFKAST tydeligt, men billedopsamlingen er ikke for lang.</li>
	</ol></li>
	<li>Definer billedområder BEMÆRK: Der foreslås flere forskellige strategier.<ol>
<li>Hvis der kun er nogle få sektioner, der skal afbildes, skal du bruge billederne af sektioner, der er oprettet indtil videre, til at navigere til de relevante sektioner og bruge Zoomable Viewer, der viser alle erhvervede billeder på deres oprindelige relative placeringer, til at se på alle sektioner. Når der er fundet en sektion, der skal afbildes i høj opløsning, skal du oprette et billedområde med klik-træk. Vælg billedindstillinger i høj opløsning, og gem indstillingerne i en skabelon. Genbrug denne skabelon til yderligere sektioner.</li>
		<li>Hvis du vil finde særligt små eller svære at opdage sjældne hændelser, skal du bruge Lateral Screening-tilgangen. Opret manuelt et billedområde med billedindstillinger i høj opløsning på hver tiende sektion eller på et afsnit pr. bånd, og hent billederne. Gennemgå de billeder og markere sektioner, der indeholder investeringsafkast i softwaren eller tage en note.<ol>
<li>Start fra sektioner, der indeholder investeringsafkast, skal du navigere frem og tilbage gennem sektionssættet og oprette billedområder med høj opløsning på de samme relative placeringer, så længe strukturen stadig er synlig i sektionen. Dette kan gøres manuelt eller ved hjælp af den procedure, der er beskrevet i de næste trin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hent billeder i mere end ti på hinanden følgende sektioner. Klik på Startplaceringsjustering efter zoom på billedet for at øge præcisionen af registrerede sektionsplaceringer som beskrevet i manualen. Dette reducerer billedseriens position variabilitet. Proceduren er illustreret og forklaret i supplerende materiale side 19-21.</li>
		<li>Klik på en sektion for at definere et billedområde, mens du holder Alt-tasten nede, og vælg Opret feltsætmatrix i genvejsmenuen, der åbnes, når museknappen slippes. Softwaren opretter derefter billedområder på samme relative placering i alle sektioner, der er fundet eller markeret tidligere. Det er muligt at begrænse billeddannelse til et bestemt område af sektioner med skyderen Sektionsspænd. BEMÆRK: Denne procedure kan gentages med et vilkårligt antal billedområder og gør det derfor muligt at optage mange små billeder i høj opløsning i stedet for at optage et enkelt større billede på hvert afsnit.</li>
		<li>Når det er oprettet, skal du konfigurere pixelantal, pixelstørrelse, fliselayout, pixelbotid osv. i hver billedserie efter behov. Når billeddiagnostiske serier er oprettet og konfigureret, vises de alle i et job cue.</li>
	</ol></li>
	<li>Konfigurer automatiske funktioner, og start afbildningsopsamling<ol>
<li>Opret en separat billedserie til automatiske funktioner ved hjælp af den samme metode som beskrevet i forrige trin. Flyt billedserien til en placering på den sektion, der indeholder strukturer med stor kontrast.</li>
		<li>Indstil billedserien til 1024 x 884 pixel, og vælg en pixelstørrelse svarende til den højeste opløsning, der blev brugt i den billedserie, der blev konfigureret i de foregående trin. Kontroller Autofokus og Automatisk stigmatiseringpå listen over automatiske funktioner.</li>
		<li>Vælg efter sektion i anskaffelsessekvenskontrolelementerne, og kontroller, at billedet af automatiske funktioner er det første element på listen. Start billedopsamlingen ved at klikke på knappen Kør ud for jobkøen. Disse procedurer er illustreret i supplerende materiale, side 22-23. BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt manuelt at fokusere manuelt på hvert afsnit. Under optagelsessessionen udføres de automatiske funktioner, hver gang mikroskopet går videre til en ny sektion, før alle andre billeder optages i dette afsnit.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Datajustering og -analyse
<ol><li>Dataeksport<ol>
<li>Sørg for, at data gemmes i .tif format, så der ikke er behov for en dedikeret eksportfunktion. Sorter data i en mappestruktur, der svarer direkte til lagene og elementerne i lagtræet.</li>
		<li>Når billedmosaikker er optaget, skal du bruge stitchall-funktionen til automatisk at sy alle fliser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stakjustering og beskæring i Fiji SEDDEL. Mange softwarepakker (gratis og kommercielle) kan bruges til at arbejde med Array Tomography data. Nedenstående trin vises med open source-program Fiji32, fordi det er bredt tilgængeligt og indeholder alle de nødvendige funktioner.<ol>
<li>Importer en stak billeder (eller syede billeder) til Fiji som en virtuel stak.</li>
		<li>Hvis kontrast/lysstyrke skal normaliseres, skal du vælge Udvidet kontrast... fra menuen Proces. Angiv mættede pixel til 0,1 eller mindre, og kontroller Udfør alle udsnit.</li>
		<li>Vælg Registrering | Lineær stakjustering med SIGTEFT.</li>
		<li>Vælg Rigid eller Affine i rullemenuen Forventet transformation. Ellers skal du beholde standardindstillingerne. Start justeringen ved at klikke på OK. BEMÆRK: Indlæsning af data som Virtual Stack giver Fiji mulighed for at håndtere stakke af enhver størrelse. Outputtet af justeringen oprettes i RAM. Dette kan dog begrænse den maksimale størrelse på stakke, der kan behandles. I så fald skal du bruge Registrer virtuelle stakskiver, som er en mappe-til-mappe-implementering af den samme registreringsalgoritme. Når registreringen er fuldført, skal du indlæse outputdataene som en virtuel stak.</li>
		<li>Beskær billedstakken ved at klikke på Beskær, så den kun indeholder investeringsafkast.</li>
		<li>Gem stakken som et enkelt .tif billede eller en række .tif billeder. BEMÆRK: Kritiske trin i matrixtomografi vises i figur 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Luckner, M., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+light+microscopy+to+analytical+scanning+electron+microscopy+(SEM)+and+focused+ion+beam+(FIB)/SEM+in+biology:+Fixed+coordinates,+flat+embedding,+absolute+references.">From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+electron+microscopy+volume+of+the+brain+of+adult+Drosophila+melanogaster.">A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster.</a> Cell. 174 (3), 730-743 (2018).</li><li>Mulcahy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+volume+electron+microscopy+of+the+caenorhabditis+elegans+nervous+system.">A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system.</a> Frontiers in Neural Circuits. 12, 94 (2018).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+molecules+and+cells.">Electron tomography of molecules and cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).</li><li>Hoog, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+interphase+microtubules+in+fission+yeast+analyzed+by+electron+tomography.">Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography.</a> Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).</li><li>Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+studies+of+eukaryotic+cells+by+cryo-electron+tomography.">Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography.</a> Cells. 8 (1), 57 (2019).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+(S3EM)+on+silicon+wafers+for+ultra-structural+volume+imaging+of+cells+and+tissues.">Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues.</a> PLoS One. 7 (4), 35172 (2012).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).</li><li>Kubota, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+nanotube+tape+for+serial-section+electron+microscopy+of+brain+ultrastructure.">A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure.</a> Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).</li><li>Wacker, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+Hierarchical+Imaging+of+Serial+Sections+for+Finding+Specific+Cellular+Targets+within+Large+Volumes.">Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57059 (2018).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Templier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MagC,+magnetic+collection+of+ultrathin+sections+for+volumetric+correlative+light+and+electron+microscopy.">MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy.</a> Elife. 8, 45696 (2019).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).</li><li>Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+EM-based+reconstruction+of+the+interglomerular+projectome+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).</li><li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology:+Applications+and+technology.">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).</li><li>Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIB-SEM+tomography+in+biology.">FIB-SEM tomography in biology.</a> Methods in Molecular Biology. 1117, 541-558 (2014).</li><li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging.">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, 25916 (2017).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+cluster+ion+beam+SEM+for+imaging+of+large+tissue+samples+with+10+nm+isotropic+resolution.">Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution.</a> Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).</li><li>Maco, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+in+vivo+2+photon+and+focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+of+cortical+neurons.">Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons.</a> PLoS One. 8 (2), 57405 (2013).</li><li>Russell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+microscopes:+3D+correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+of+complex+biological+structures.">Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures.</a> Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).</li><li>Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+for+observing+the+three-dimensional+ultrastructure+of+membranous+cell+organelles+in+relation+to+their+molecular+components.">Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).</li><li>Peddie, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+and+integrated+light+and+electron+microscopy+of+in-resin+GFP+fluorescence,+used+to+localise+diacylglycerol+in+mammalian+cells.">Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).</li><li>Markert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+subcellular+localization+with+superresolution+array+tomography+on+ultrathin+sections+of+various+species.">3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species.</a> Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).</li><li>Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+precise+and+rapid+mapping+protocol+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+small+invertebrate+organisms.">A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms.</a> Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).</li><li>Kolotuev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+correlative+anatomy+of+invertebrate+model+organisms+increases+efficiency+of+TEM+data+production.">Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).</li><li>Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+acetylcholine+signaling+through+a+muscarinic+receptor+regulates+cell+migration.">Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster.">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li><li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis.">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+asymmetric+stem+cell+division.">Mechanisms of asymmetric stem cell division.</a> Cell. 132 (4), 583-597 (2008).</li><li>Daniel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+septate+junctions+assembly+and+completion+of+cytokinesis+in+proliferative+epithelial+tissues.">Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues.</a> Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).</li><li>Pasquettaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peculiar+protrusions+along+tanycyte+processes+face+diverse+neural+and+non-neural+cell+types+in+the+hypothalamic+parenchyma.">Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2020).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+image+browser:+A+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets.">Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li></ol>

Forfatteren Tilman Franke er ansat hos Thermo Fisher, der fremstiller elektronmikroskoper og pilotprogrammer, der bruges i artiklen.

Elektronmikroskopi giver indsigt i cellernes og organismernes ultrastruktur, for hvilke det ofte er ønskeligt at afbilde strukturer af interesse i deres 3-dimensionelle kontekst. På trods af talrige EM taktik for ultrastrukturelle analyse, er der stadig ingen "guld standard" løsning. Hovedårsagen er den brede vifte af prøver, mange biologiske spørgsmål, som ofte kræver en skræddersyet tilgang. Den foreslåede AT-arbejdsproces er designet til at minimere den tid, der er nødvendig for prøvebehandling, dataindsamling, evaluering og lagring. Desuden giver den modificerede kniv et nyttigt værktøj til at forenkle array erhvervelse. Det kompakte layout af sektioner på wafers er praktisk, både til observation og efterfølgende opbevaring af prøverne. Dette arrangement muliggør "Lateral Screening" af prøver ved vandret at flytte fra bånd til bånd og scanne kun et afsnit på hver, hvilket reducerer den tid, der kræves for at lokalisere et investeringsafkast. Foreslåede scenarier for dataindsamling gør det lettere at målrette mod små og tilfældigt fordelte områder. Når at/SEM er fundet, begrænses den højopløsningsbilleddannelse præcist til mængden af interesse, uanset om den udføres manuelt eller ved hjælp af automatisk funktion. AT for begrænsede mængder kan udfyldes manuelt, hvor operatøren navigerer gennem prøven og definerer billedbehandlingsområder en efter en. Det automatiserede modul af softwaren giver en fleksibel image erhvervelse strategi for billedbehandling af små områder på store sektioner. Automatiseringen i denne software gør det muligt at optage store billeder i høj opløsning på hundredvis af sektioner og opnå lignende mængder som SBFI. Optagelse af oversigtsbilleder af alle sektioner forenkler roi-lokaliseringen og reducerer den tid, der bruges på mikroskopet. Da afsnittene ikke er skadet under registreringen af oversigter og forhåndsvisninger med højere opløsning, tillader AT/SEM at genbruge prøven til at indsamle yderligere data om andre investeringsafkast eller ved en højere opløsning.
Image erhvervelse tid er en af de vigtigste (og dyreste) aspekter af 3D EM og bør derfor overvejes i eksperimentet design. Selvom det ikke er overraskende, at billeddannelse af store områder tager længere tid end billeddannelse af små områder, er det let at undervurdere virkningen: Afhængigt af de valgte billedbehandlingsparametre kan anskaffelsestiden på hvert afsnit variere fra sekunder til timer. Vigtige billedbehandlingsparametre omfatter størrelsen på syns-, opløsnings- og opholdstiden. Hvis der antages en målopløsning på 10nm pr. pixel og 1 μs, skal der billeddannelse et felt på 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm eller 500 μm x500 μm tager 4 sekunder, 100 sekunder eller 2.500 s at registrere. Vi kan gange disse billedtider pr. sektion med antallet af sektioner for at estimere den tid, der kræves til det komplette billedjob. Lange billedtider pr. sektion kan være acceptable, hvis antallet af sektioner er lille, eller hvis mikroskopværktøjstiden ikke giver anledning til bekymring.
Det er dog nødvendigt at begrænse registreringstiden til et overnatningsjob eller et weekendjob i de fleste tilfælde. Et lige så kritisk aspekt af 3D EM, der bør overvejes, er mængden og strukturen af de resulterende billeddata. Optagelse af ovennævnte billedfelter i 100 sektioner genererer henholdsvis 400 mb, 10 gb eller 250 gb billeddata. de 500 μm x 500 μm billeder udgør det ekstra problem at være større end 2 gb hver. Mange af de softwareprogrammer, der bruges til dataevaluering, kan ikke åbne billeder af denne størrelse.
For at reducere billedtiden er det vigtigt at vælge pixelbotid for at opfylde kravene til signal-til-støj-forholdet til den efterfølgende dataevaluering (f.eks. rekonstruktion, sporing) og begrænse optagelserne til definerede INVESTERINGSAFKAST. AT-udvidelsen af softwaren letter billedopsamling i små områder i serielle sektioner. Softwaren understøtter manuelle og automatiske arbejdsgange og mange halvautomatiske varianter: billedområder kan placeres manuelt og fokuseres på hvert afsnit, eller brugeren kan bruge den automatiske sektionsfinder og positionjusteringsfunktioner. Afhængigt af det automatiseringsniveau, der er valgt og understøttet af eksempeltypen eller billedmålene, kan den tid, der kræves til opsætning af billedopsamling i hundredvis af sektioner, tage en hel arbejdsdag (udført manuelt) eller kun få minutter. I princippet gør Array Tomography det mere udfordrende end andre 3D EM-metoder til at erhverve små INVESTERINGSAFKAST; Upræcise placering i regionen på sammenhængende strækninger skal kompenseres ved at erhverve større arealer. Hvis roi'et f.eks. er 20 μm x 20 μm i størrelse, og billeddannelsesfelternes sektion-til-sektionsposition er 10μm, skal man anskaffe 40 μm x 40 μm billeder for at være sikker på, at investeringsafkast er fuldt optaget i hvert billede på hvert afsnit. Den virkelige billedposition varierer fra 100 μm til <10 μm afhængigt af tilgængeligheden eller kvaliteten af softwarefunktioner til positionsjustering eller brugerens tålmodighed. Med denne software kan 10 μm opnås uden for meget manuel indgriben i de fleste prøver.
Som enhver teknik har AT flere svage punkter, der kan påvirke vellykket dataindsamling, og mange ligner andre sektionsbaserede metoder. Mangel på homogen fordeling af tom harpiks versus væv kan resultere i buede eller brudte arrays. I ekstreme tilfælde kan sektioner frigøre sig fra støtten (Figur 6A). Variabel komprimering eller strækning under skæreprocessen kan oprette folder, der kan forstyrre prøven i variable områder på efterfølgende afsnit (Figur 6B). Knivmærker kan forekomme på overfladen af de indsamlede sektioner ved hjælp af en beskadiget kniv (Figur 6C). Forskelle i sektionsforhold kan medføre lejlighedsvise sektionskomprimerings- og tykkelsesforskelle. Støv- eller snavspartikler kan lande på en sektion og delvis tilsløre interessezonen (Figur 6D). Billedopsamling kan mislykkes på grund af ufuldkomne funktioner med automatisk kontrast, automatisk fokus og automatisk stigmatisering. Placeringen af automatisk oprettede billedområder kan være variabel og kan muligvis ikke registrere investeringsafkast i alle sektioner.
Flere problemer kan opstå på tidspunktet for syninger og tilpasning. Den automatiske syning af mosaikfliser erhvervelser kan mislykkes, for eksempel på grund af den store tomme plads inde i prøven. På grund af en drastisk ændring i form i 3D kan billedstakke være udfordrende at registrere. Specialudviklede programmer (f.eks. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB eller MAPS-AT) kan lette halvautomatisk justering32,38,39,40. Mere udfordrende sektioner kan justeres manuelt ved hjælp af fotoredigeringssoftware. Desværre kan nogle datasæt være umulige at justere korrekt.
Store prøver er udfordrende for TEM serielle sektioner passer på gitre; På den anden side berettiger mange projekter ikke til lang automatisk erhvervelse ved hjælp af FIB/SEM eller SBF-SEM. AT er et ligetil alternativ til en kedelig seriel sektion TEM, hvor indsamling og manipulation af serielle sektioner på en wafer er mere ligetil end med slotgitre. Der blev udviklet flere strategier for at lette indsamlingen af arrays, og vi deler vores metode til at udvide den eksisterende værktøjskasse. I tilfælde, hvor identifikationen af investeringsafkast er udfordrende, giver AT-SEM en grundlæggende fordel med en effektiv screening af prøverne, hvor der kræves organelskalaopløsning på tværs af 50 til 500 sektioner. For større mængder kan de automatiske indsamlings-AT-strategier indsamles effektivt, hvis der kræves flere sektioner. AT prøver kan re-imaged flere gange, lette målrettet billeddannelse af områder med høj opløsning baseret på tidligere erhvervede oversigt billeder. Vi mener, at den målrettede analyse og reduceret oversampling af AT / SEM foreslået her reducerer arbejdskraft og datalagring krav. I sidste ende kan biblioteker af sektioner indsamles og vedligeholdes til senere genbrug og høring. Til volumenerhvervelse tilbyder FIB- eller SBF-SEM-tilgange en fremragende løsning, når investeringsafkast er let at identificere på blokfladen, eller hvis der er behov for store 3D-mængder til analysen. FIB/SBF-SEM er dog mindre effektive, når stakbilledet med høj opløsning skal indsamles fra et defineret investeringsafkast på en målrettet måde. Afslutningsvis vil jeg sige, at de foreslåede metoder til screening af AT-prøver og brugen af oversigtsbilleder med medium opløsning gør det muligt at begrænse billedopsamlingen til de relevante dele af sektionsmatrixen. Præcis sigte med billeddannelsesområder fremskynder time-to-data og forenkler dataevalueringen.
Sammenfattende, selv om begrebet AT / SEM ikke er nyt, dets anvendelse er stadig ikke så udbredt som dens fordele antyder. Samlet set giver den en supplerende procedure til andre eksisterende EM-metoder. AT/SEM er kompatibel med det bredeste udvalg af prøveforberedelsesprotokoller og billedbehandlingsarbejdsgange og kan udføres på enhver FIB/SEM eller SBF-SEM-mikroskop som en ledsagende teknik. I dette papir har vi koncentreret os om AT til registrering af ultrastrukturelle data fra prøver, der er mindre tilbøjelige til at blive behandlet med succes ved andre metoder. Vi håber, at den beskrevne procedure for bekvem indsamling af sektioner og betydeligt automatiserede erhvervelsesstrategier vil hjælpe i de første forsøg for dem, der aldrig har stødt på metoden og vil bidrage til at perfektionere den til dem, der allerede har en vis erfaring.

På trods af betydningen af EM-relaterede teknikker holder den indsats, der kræves for at mestre dem, hele området begrænset til et lille antal specialister. Et væsentligt problem er identifikation og hentning af en region af interesse (ROI) i prøverne bevaret for EM. Udseendet af den samme prøve adskiller sig betydeligt, når den analyseres ved optisk mikroskopi og efter behandling til EM-observation. Ændringerne for kemisk forberedte prøver omfatter anisotropisk prøve krympning efter dehydrering trin (~ 10% i hver dimension) og tab af fluorescens ved brug af osmium i fiksering og farvning protokol (Figur 1A). For ultratynde afsnit, prøverne er indlejret i epoxy eller akryl harpikser ved hjælp af forskellige strategier (Figur 1B). For at opnå vellykkede resultater af dette præparat skal hele prøven være fraktioneret i stykker, der ikke overstiger 1 mm x 1 mm. For at opfylde standardkravene til TEM(Transmission Electron Microscopy) er denne lille del af prøven yderligere opdelt til 50-150 nm tykke skiver. De resulterende gråtonebilleder viser vævsorganisation og organellestruktur på en minutfraktion af hele prøven mere detaljeret end nogen anden mikroskopiteknik (Figur 1C). Et typisk TEM datasæt giver 2D-information, teoretisk ekstrapoleret til at forstå de processer, der naturligt forekommer i et 3D-rum i celler og væv. Figur 1D udgør udfordringen ved erhvervelse af ultrastrukturelle mængder: Hvis en terning på side 1.000 μm er opdelt ved 50 nm tykkelse, kræves der 20.000 sektioner til at dække hele volumen; for en 500 μm sidekube, vil det være 10.000 sektioner. For at dække et volumen på 50 μm x 50 μm x 50 μm kan det være nødvendigt med 1.000 sektioner "kun". At opnå dette volumen manuelt er praktisk talt umuligt og ekstremt udfordrende at udføre med automatisering. Hvis vi ud over prøvedybden skal dække hele overfladen af sådanne hypotetiske terninger, bliver dækningen af 1 μm2 overflade ved rimelig opløsning et alvorligt logistisk problem (figur 1E). Selv om det store antal sektioner for de ekstraordinære store projekter, såsom connectomics-tilgange, er afgørende for de fleste "verdslige" EM-projekter, udgør det en betydelig ulempe at generere flere sektioner, der er nødvendige for observationen.
Der er flere metoder til at erhverve 3D ultrastrukturelle oplysninger: seriel afsnit Transmission Electron Microscopy (TEM), TEM tomografi, Array Tomography (AT), Serial Block Face Imaging Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM), og Fokuseret Ion Beam Scanning ElektronMikroskopi (FIB-SEM). De væsentligste forskelle mellem disse metoder er sektionsstrategien , og om billedopsamlingen er koblet til sektionsgenerering1. I seriel afsnit TEM indsamles sekventielle sektioner på slotgitre, TEM-afbildninger genereres fra disse sekvenser og justeres2,3,4,5. I TEM-tomografi giver vippeserier fra 150-300 nm sektioner på et gitter, og når de kombineres med seriel sektion, en meget høj opløsning, men relativt små mængder6,7,8. AT-tilgangen bruger fysisk sektion med forskellige manuelle og halvautomatiske manerer af sektioner, der er samlet på relativt stor støtte, såsom glasovertræk, silicium wafers eller et specielt bånd. Til billedopsamling analyseres supporten i SEM, med forskellige strategier for billedopsamling er tilgængelige9,10,11,12,13,14,15 . For SBF-SEM opnås fysisk sektion ved hjælp af en minimikrotom med en diamantkniv, der er indstillet direkte inde i SEM-kammeret, med SEM-billedet genereret fra overfladen af harpiksblokken16,17,18,19. For FIB-SEM fjerner ionkilden tynde lag af prøven efterfulgt af automatisk billeddannelse af den eksponerede overflade af SEM20,21. TEM-tomografi og AT generere fysiske sektioner, som kan re-billederes, hvis det er nødvendigt, mens FSBF-SEM og FIB-SEM fjerne afsnittet efter billeddannelse. En nylig kombination af fysiske sektioner afbildet af en multi-beam SEM giver en kombination af metoder, der løser "flaskehals" spørgsmålet om hastigheden af billedet erhvervelse22. Hver af disse teknikker har revolutioneret den måde, EM-data kan indhentes og analyseres på, og hver tilgang har sine praktiske virkninger relateret til et givet forskningsspørgsmål.
I betragtning af præparatets art og omfanget af de ultrastrukturelle dimensioner er det ikke ligetil at forudsige, hvor en bestemt målstruktur er placeret i prøveblokken (Figur1D, E). En løsning til ROI lokalisering er at optage billederne fra hele blokken i den ønskede opløsning fra begyndelsen. Interessestrukturerne kan være i den erhvervede datamængde, når de er væk fra mikroskopet. Anskaffelsestid og datahåndtering i forbindelse med denne strategi er problematisk. Det er ønskeligt at reducere mængden af registrerede data, især hvis INVESTERINGSAFKAST'erne er meget mindre end vævsblokken, dvs. hvis objekter af interesse er specifikke typer celler (ikke hele organer). Forskellige korrelative lys - og elektronmikroskopiteknikker (CLEM) kan lykkes , når fluorescensen bevares og lokaliseres før eller efter tilberedningen inden for samme prøve23,24,25,26,27,28,29. Ikke desto mindre er mange cellulære strukturer genkendelige selv uden fluorescens korrelation, kun baseret på den kendte ultrastruktur. I disse tilfælde mener vi, at lateral screening Array Tomography giver en balance mellem indsatsen investeret i ROI lokalisering og den ultrastrukturelle informationskvalitet. Ved hjælp af denne strategi screenes et undersæt af sektioner på waferen med jævne mellemrum, som kan etableres baseret på INVESTERINGSAFKAST'ets størrelse og natur. Når investeringsafkast er fundet, konfigureres dataindsamlingen i en kontinuerlig række sektioner, der starter før og slutter efter ankersektionen, og indsamler de relevante oplysninger målrettet.
Vi præsenterer protokoller for AT, der forenkler og fremskynder erhvervelsen af regioner eller begivenheder af interesse i mange sektioner og giver bedre afstemt billedvolumener. Lateral screening og erhvervelse af flere skridt producerer data med meget høj opløsning i netop målrettede regioner. Den procedure, vi beskriver, løser flere udfordringer ved 3D EM-dataindsamling, som den giver: kompatibilitet med en bred vifte af prøver uden grundlæggende at ændre arbejdsgangen for prøveforberedelse; målrettet lokalisering af lokaliseringer og SEM-erhvervelser reduceret tid og kræfter under installationen; billedbehandling af områder i flere sektioner med bedre tilpasning af de resulterende diskenheder; og en glat syning og justering procedure for at kompilere forskellige billeder i en syet mosaik billede. Vi valgte at demonstrere styrken af vores metode med flere prøver fra offentliggjorte og igangværende projekter. Vi mener, at denne tilgang i høj grad kan lette generering og erhvervelse af målrettede EM-data, selv for efterforskere med begrænset EM-erfaring.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AT sectioning knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUATS3530</td>
			<td>Diatome Jumbo knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td>Diatome trimming 20&#176; 
			Glass knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16015</td>
			<td>Resistance: 1-30 Ohms 
			Type P: (Boron) (1 primary flat) 
			Roughness: 2 nm 
			No SiO2 top coating 
			TTV: = &#60;20 &#181;m 
			Wafer is polished on one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer cleaving kit</td>
			<td>EMS</td>
			<td>7642</td>
			<td>EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Thermo Fischer Helios</td>
			<td>1072419</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maps 3 for SEM with Correlative Workflow &#38; Array Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1135932</td>
			<td>Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira x.y</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131599</td>
			<td>Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td>IMOD, MIB (See text for refferences)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy

Elektronmikroskopi påføres i biologi og medicin til billeddannelse af cellulære og strukturelle detaljer ved nanometeropløsning. Historisk set har Transmission Electron Microscopy (TEM) givet indsigt i celle ultrastruktur, men i det seneste årti har udviklingen af moderne Scanning Electron Microscopes (SEM) ændret måden at se inde i cellerne. Selv om opløsningen af TEM er overlegen, når protein-niveau strukturelle detaljer er nødvendige, SEM-opløsning er tilstrækkelig til de fleste af de organelle-niveau cellebiologi-relaterede spørgsmål. Udviklingen inden for teknologi muliggjorde automatiske volumenopsamlingsløsninger som Serial block-face imaging (SBF-SEM) og Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Ikke desto mindre forbliver disse metoder den dag i dag ineffektive, når identifikation og navigation til interesseområder er afgørende. Uden midler til præcis lokalisering af målområder før billeddannelse skal operatørerne erhverve meget flere data, end de har brug for (i SBF-SEM), eller endnu værre forberede mange gitre og afbilde dem alle (i TEM). Vi foreslår strategien med "lateral screening" ved hjælp af Array Tomography i SEM, som letter lokaliseringen af interesseområder, efterfulgt af automatiseret billeddannelse af den relevante brøkdel af det samlede prøvevolumen. Arraytomografiprøver bevares under billeddannelse, og de kan arrangeres i sektionsbiblioteker, der er klar til gentagen billedbehandling. Flere eksempler er vist, hvor lateral screening gør det muligt for os at analysere strukturelle detaljer, der er utroligt udfordrende at få adgang til med enhver anden metode.

Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Vi beskriver forberedelsen af bånd af serielle sektioner og deres samling på stor overførsel støtte til brug som Array Tomography prøver, sammen med automatiserede billedbehandling procedurer i en scanning elektron mikroskop. Protokollen tillader screening, hentning og målrettet billeddannelse af lokale, sjældne hændelser og erhvervelse af store datamængder.

Arraytomografiarbejdsgang for målrettet anskaffelse af volumenoplysninger ved hjælp af scanningselektronmikroskopi

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Elektronmikroskopianalyse er ofte kompleks. Vi mener, at vores protokol letter behandling og erhvervelse af EM-data fra den store prøve overflade og mellemliggende volumen. Vores protokol hjælper med at finde målstrukturer i serielle sektioner.Dataregistrering er begrænset til, hvad der er nødvendigt. Sammenlignet med dataindsamling i hele vævsblokke reduceres registreringstiden og dataanalyse lettere. I betragtning af den generelle lethed ved tilgangen mener vi, at den kan bruges til at behandle ikke kun videnskabelige spørgsmål, men også som et diagnostisk værktøj.For at generere et array til analyse skal prøven først klemmes fast på en ultramikrotomholder og bruge et barberblad til groft at trimme harpiksen omkring prøven. Brug et diamantbeskæringsværktøj til at finpudse prøven og bruge trimmeknive med 20-eller 90 graders hældning for at sikre, at blokkens øverste og nederste overflader er parallelle med knivens skærkant. Bland xylen og lim i en 3:1 proportion og bruge en øjenvippe knyttet til en tandstikker til at anvende blandingen til toppen og nederste kanter af trimmet blok.Mens blandingen tørrer, skal du bruge et wafer kavalereringsværktøj til at skære et stykke wafer til den passende størrelse til analysen. Rengør vaflerne i destilleret vand for at skylle snavs væk og rengør overfladen med plasma, når waferen er tør. For at forberede en array tomografi kniv, skal du bruge skummende tape til at fastgøre en nål til bunden af en histo jumbo kniv og placere kniven i ultra mikrotom indehaveren på nul grader.Juster knivens kant parallelt med blokoverfladen, og bring den trimmede blok til knivens kant i en position, der er klar til indsnit. Placer den rene wafer i knivbassinet og fyld bassinet med vand til samme niveau som knivkanten, og lad derefter knivens diamantkant befugte ordentligt ved hjælp af den vedhæftede sprøjte til at tilføje eller trække vand tilbage efter behov. For array sektion, indstille mikrotom til en skæring rækkevidde på 50 til 100 nanometer og en skærehastighed på 6 til 1 millimeter i sekundet, og begynde at skære for at få et bånd længe nok til at dække en målrettet Z volumen.Afhængigt af blokstørrelsen, homogeniteten af vævet og typen af harpiks vil båndet være omtrent lige. Brug en ren, ikke-klæbrig spids af en øjenvippe til at løsne båndene fra knivkanten. Brug øjenvipperne til forsigtigt at flytte båndet over til midten af støttemediet.Kloroform eller en varmepen kan bruges til at strække sektionen, hvis det er nødvendigt. Når du har strakt, trækkes sprøjten tilbage for at begynde at dræne vandet. For mere sarte bånd, eller en langsommere vand tilbagetrækning, løsne sprøjten fra slangen for at lade vandet dryppe.Når vandstanden når waferniveauet, skubbes båndet forsigtigt til midten af bassinet og fortsæt med at dræne, indtil alt det resterende vand er helt fjernet fra bassinet. Lad waferen tørre i et rent miljø. Tørring tager cirka 30 minutter.Når prøven er helt tørret, overføres arrayet til en tæt lukket kasse for at beskytte den mod snavsforurening. Og læg kassen i en 60 graders ovn i mindst 30 minutter. Hvis du vil have et oversigtskort over SEM-billeder, der afslører sektionsplaceringer på waferen, skal du bruge det indbyggede optiske kamera til at anskaffe et SEM-billede, der dækker et bånd af sektioner.Hvis du vil oprette en mosaik, skal du klikke og trække kamerabilledet af prøven og starte den automatiske erhvervelse. Få oversigter ved højere opløsning for at finde målstrukturer. Hvis kun nogle få sektioner skal afbildes, skal du bruge seeren, der kan zoomes, til at få vist erhvervede billeder på deres oprindelige placeringer.Når en sektion, der skal afbildes i høj opløsning, er blevet identificeret, skal du klikke og trække for at oprette et billedområde og derefter vælge Billedindstillinger i høj opløsning og gemme indstillingerne i en skabelon Hvis du vil finde særligt små eller svære at registrere sjældne hændelser, skal du bruge billedindstillingerne i høj opløsning på hver 10. sektion eller på et afsnit pr. bånd til manuelt at oprette et billedområde og hente billederne. Gennemse derefter de billeder og markere sektioner, der indeholder det område af interesse. Hvis du vil hente mere end 10 på hinanden følgende sektioner, skal du bruge sektionsfinderen til at finde alle sektioner automatisk.Hvis oversigtsbillederne ikke viser klare interesseområder, skal du anskaffe billeder i højere opløsning af sektionerne og bruge sektionseksempelfunktionen til at oprette og hente billederne automatisk. For at bestemme de optimale billedindstillinger skal du aktivere den levende billedbehandling i mikroskopstyringssoftwaren og navigere til et interesseområde og derefter justere billedindstillingerne, indtil billederne viser klare interesseområder, men uden en alt for lang billedopsamling, i henhold til producentens retningslinjer. Hvis du vil optimere placeringen af billedområderne på fortløbende sektioner, skal du zoome til billedet af interesse og klikke på Forfinelse af startposition for at øge præcisionen af registrerede sektionsplaceringer.Hvis du vil definere et billedområde, skal du klikke og trække i en sektion, mens du holder Alt-tasten nede, og vælge Opret feltsætmatrix i genvejsmenuen. Softwaren opretter billedområder på samme relative placering i alle de sektioner, der er fundet eller tidligere markeret. Konfigurer derefter pixelantal, pixelstørrelse, fliselayout og pixelbotid i hver billedserie efter behov.Hvis du vil konfigurere den automatiske funktion, skal du oprette en separat billedserie til automatiske funktioner som demonstreret og flytte billedserien til en placering på den sektion, der indeholder strukturer med stor kontrast. Indstil billedserien til 1024 x 884 pixel, og vælg en pixelstørrelse svarende til den højeste opløsning, der bruges i billedserien. Kontroller Autofokus og Automatisk stigmatisering på listen over automatiske funktioner.Vælg Bisection i anskaffelsessekvenskontrolelementerne, og bekræft, at den automatiske funktions billede er det første element på listen, og klik derefter på Hent alle for at starte billedopsamlingen. Når alle billedserierne er oprettet og konfigureret, vises serien i en opgavekø. Erhvervelse med lav opløsning kan udføres manuelt eller automatisk direkte på udvalgte dele af sektionen eller en hel sektion ved hjælp af enkelt- eller mosaikbilleddannelse efterfulgt af syninger.Billeder fra det valgte område kan derefter erhverves ved hjælp af høj opløsning parametre til at visualisere mitokondrier, kerner og microvilli, for eksempel, Efter den automatiske erhvervelse af løste mosaik kort har valgt, flere regioner af interesse kan beskæres ud eller bruges til at definere yderligere lokale billeddannelse områder inden for regionerne. Selvom forskellige specialiserede celletyper i Drosophila-tarmen er tilfældigt fordelt, kan de visuelt skelnes efter screening af billederne ved hjælp af parametre med høj opløsning, enten fra enkelte sektioner eller som en samling af serielle billeder. Efter justeringen kan stakkene gengives ved hjælp af forskellige softwareløsninger.Matrixtomografianalyse gør det muligt at generere mange sekventielle sektioner på den enkelte wafer og screenes ved hjælp af parametre med lav opløsning for at lokalisere de generelle interesseområder. Disse områder kan målrettes til yderligere analyse ved hjælp af avancerede anskaffelsesparametre. For eksempel er mytotiske divisioner i notum ikke nemme at lokalisere på det ultrastrukturelle niveau, da cellerne er relativt store sammenlignet med abscissionszonen.Ved hjælp af denne metode kan de automatiske oversigtsbilleder med middel opløsning af spring på 20 til 40 sektioner dog bruges til at lokalisere skillecellerne. Arraytomografiproceduren giver en mere ligetil elektronmikroskopidataanalyse. Vi opfordrer seerne til at investere i at mestre regenereringen og sætte sig ind i den kortrelaterede arbejdsgang Det er vores erfaring, at få forskningsemner kræver en ultrastrukturel analyse af hele dyr eller hele organer.Vores metode hjælper med hurtig lokalisering af celler og deres interaktionspartnere i væv.

Research

JoVE Journal

Biology

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

En standardiseret metode til analyse af Liver Sinusformet endotelceller og deres fenestrationer af Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Scanning Electron Microscopy af udblødt Tissue at visualisere den ekstracellulære matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Undersøgelse af Supramolekylær Organisationen af ​​photosynthetic Membraner inden Freeze-brækkede Leaf Væv af Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protokoller for Problematisk Plant, ægsporesvampe, og Fungal Prøver

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Forberedelse og Observation af Thick Biologiske prøver ved scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Undersøge de skadelige effekter af lav pres Plasma sterilisation på overlevelse af Bacillus subtilis sporer ved hjælp af Live celle mikroskopi

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Forberedelse af prokaryote og eukaryote organismer ved hjælp af kemiske tørring til morfologisk analyse i Scanning elektronmikroskopi (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske prøveforberedelse højtryks frysebehandling, mikrobølgeovn-assisteret kontrastforbedring og Minimal harpiks indlejring for volumen Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

Målrettede undersøgelser ved hjælp af seriel blok ansigt og fokuseret ion Beam Scan elektronmikroskopi

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Seriel blok-ansigt scanning elektron mikroskopi (SBF-SEM) af biologiske vævsprøver

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...