Name: array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

We willen de leden van de EM-faciliteit van de Universiteit van Lausanne bedanken voor hun steun tijdens deze ontwikkeling van verschillende stappen van de AT-procedure. We willen Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O'Brien en Lindsay Lewellyn bedanken voor de discussies tijdens de voorbereiding van het manuscript en kritisch lezen. We willen de groepen erkennen die de monsters hebben bijgedragen die zijn gebruikt om de verschillende scenario's te demonstreren: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat en Fanny Langlet.

OPMERKING: De methoden voor monstervoorbereiding worden elders beschreven14,30,31en worden in deze publicatie niet behandeld. Kortom, de getoonde voorbeelden werden chemisch gefixeerd met glutaaraldehyde, nagefixeerd met 1% OsO4en vervolgens behandeld met 1% waterig uranylacetaat voordat het in de embedhars werd ingebed. Als alternatief kunnen monsters worden bereid met behulp van hogedrukvriezen, bevriezen vervangen door 0,1% uranylacetaat in aceton en ingebed in acrylhars. Monsterblokken werden bereid met behulp van een vlakke inbeddingsmethode die een duidelijk zicht op het monster mogelijk maakt, waardoor de oriëntatie voor de sectie wordt vergemakkelijkt(figuur 1B).
1. Procedure voor het genereren van arrays
<ol><li>Ingesloten monsteroriëntatie en bijsnijden<ol>
<li>Identificeer en markeer met behulp van de verrekijker / microscoop de ROI op het ingebedde blokoppervlak door het oppervlak van het blok lichtjes te krassen met een scheermesje. Dit zal helpen om het monster in de ultramicrotoom te oriënteren en zal het sectieoppervlak verminderen.</li>
		<li>Klem het monster op de ultramicrotoomhouder (figuur 2A).</li>
		<li>Snijd de hars rond het monster, eerst met het scheermesje (ruw trimmen) en ga verder met het diamantsnijgereedschap (fijn trimmen; Figuur 2A). Gebruik messen met een randneiging van 20° of 90° om ervoor te zorgen dat de boven- en onderkant van het blok evenwijdig zijn aan de snijkant van het mes. OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor seriële secties en de verwerving van rechte linten.</li>
		<li>Meng xyleen en lijm in 3:1 verhouding. Met een wimper bevestigd aan een tandenstoker, breng dit mengsel aan op de boven- en de onderkant van het bijgesneden blok. Laat het goed drogen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de arraymontagesteun A voor (d.w.z. siliciumwafers).<ol>
<li>Knip het waferstuk met behulp van een wafer cleaving tool (EMS) en pas de grootte aan het projectdoel aan. 2 cm x 4 cm is handig voor zowel licht- als elektronenmicroscopiewaarnemingen.</li>
		<li>Reinig de wafer in gedestilleerd water om het vuil te verwijderen.</li>
		<li>Gloeie-ontlading/plasma reinigt het oppervlak met behulp van standaardapparatuur. De precieze parameters zijn afhankelijk van de gebruikte machine. Begin met de parameters voor de afvoer van de netten en pas de tijd empirisch aan. Deze stap is cruciaal voor een goede spreiding van de secties op de ondersteuning terwijl secties drogen en mag niet worden weggelaten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de montagesteun B van de arrays voor (d.w.z. glazen afdekplaat)<ol>
<li>Als u multiplex immuno-labeling experimenten plant, breng de monsters dan over op een coverslip om het fluorescentiesignaal beter te detecteren. Om de kleefkracht van coverslip te verbeteren, gebruikt u een gedetailleerde gelatinecoatingprocedure die eerder is beschreven9.</li>
		<li>Verhoog de geleidbaarheid door de glaasjes te coaten met het indium-tinoxide (ITO) of goud door verdamping. Bewaar de voorbereide coverslips in een schone omgeving. Gloeiend ontlaadt de monsters zoals beschreven in punt 1.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Doorsnede van het monster
<ol><li>AT mesbereiding OPMERKING: Gebruik voor het genereren van de arrays een gemodificeerd mes (ATS), ontworpen om de verwerving van lange linten te vergemakkelijken. Histo-Jumbo messen of soortgelijke messen die zijn ontworpen voor het genereren van de secties op grote steunen kunnen ook dienen voor AT-secties.<ol>
<li>Bevestig de naald aan de onderkant van het mes met behulp van de schuimende plakband en doorboort deze(figuur 2B). Plaats het ATS-mes op 0° in de ultramicrotomehouder. Stel de rand van het mes evenwijdig aan het blokoppervlak in met behulp van de standaardprocedure.</li>
		<li>Breng het bijgesneden blok naar de rand van het mes in een positie die klaar is voor sectie.</li>
		<li>Plaats de wafer/coverslip in het mesbassin en vul deze met water tot hetzelfde niveau als de mesrand. Laat de diamantrand van het mes goed bevochtigen en zuig indien nodig water op met de bijgevoegde spuit(figuur 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Arraysectie en -overdracht<ol>
<li>Stel de microtoom in op de gewenste snijparameters. Met het ATS-mes is het bereik van 50-100 nm en een snijsnelheid van 0,6-1 mm / s aan te raden. Begin met secties maken (Figuur 2Di).</li>
		<li>Verkrijg een lint van de lengte dat een gericht z-volume bedekt en stop de verzameling. Afhankelijk van de blokgrootte, homogeniteit van het weefsel en het type hars, zal het lint relatief recht zijn (Figuur 2D-ii). Veel monsters zullen geen rechte linten produceren, ondanks de geïnvesteerde inspanning en het type mes dat wordt gebruikt.</li>
		<li>Afhankelijk van het einddoel, maak je een lang of meerdere korte linten naast elkaar uitgelijnd. Een steun van 2 cm x 4 cm kan gemakkelijk 100 tot 1.000 secties bevatten. De opstelling van het lint op de steunstap is een stap die behendigheid en vaste handen vereist. De leercurve voor deze vaardigheid wordt echter snel verworven.</li>
		<li>Maak het lint los van de mesrand met behulp van een schone, niet-kleverige punt van een wimper die op de tandenstoker is gelijmd(figuur 2Diii).</li>
		<li>Gebruik de wimper en beweeg het lint voorzichtig boven het midden van het steunmedium. Gebruik op dit punt chloroform of verwarmingspen voor het uitrekken van de secties indien nodig. Vergeet echter niet dat deze manipulatie kan leiden tot het breken en vervormen van linten.</li>
		<li>Begin met het aftappen van het water door aan de spuit te trekken. Voor delicatere linten of een langzamere waterterugtrekking, laat u water druppelen door de spuit van de slang los te maken. Wanneer het waterniveau daalt tot het waferniveau, controleert u het lint en verplaatst u het indien nodig door het lint voorzichtig naar het midden te duwen. Nadat u de linten op het waferoppervlak hebt geplaatst, gaat u door met draineren totdat het resterende water volledig uit het bassin is teruggetrokken. OPMERKING: Als u het ATS-mes met intreksel van het bodemwater niet gebruikt, verminder dan voorzichtig het water van de zijkanten van het ATS-mes om geen turbulentie te veroorzaken.</li>
		<li>Laat de delen op de steun in het bad om volledig te laten drogen. Afhankelijk van de hydrofobiciteit van de ondersteuning en de omgevingsvochtigheid, zal water met een andere snelheid verdampen(figuur 2Div). Het is belangrijk om het monster langzaam te laten drogen om alle plooien op het monster te verminderen of helemaal te vermijden.</li>
		<li>Breng het droge monster over in een goed gesloten doos ter bescherming tegen vuilverontreiniging en plaats het gedurende ten minste 30 minuten in een oven van 60 °C. Indien nodig, counterstain secties met behulp van zware metalen om het algehele contrast te verbeteren.</li>
		<li>Reinig het mes aan het einde van de procedure voorzichtig volgens de instructies van de fabrikant OPMERKING: De overdracht van meerdere of seriële secties op een wafer(figuur 2E)in vergelijking met de overdracht op een slotraster(figuur 2F)verandert de EM-voorbereidingservaring volledig. De ononderbroken sectie en verzameling van de secties op enkele ondersteuning vermindert de hoeveelheid sectie- en sectieverzamelingsgerelateerde fouten die vaak voorkomen bij seriële secties. Het equivalent van 100 secties van 1000 μm x 500 μm verzameld op één wafer komt overeen met 33 slotroosters (Figuur 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Observatie van het monster
OPMERKING: In dit gedeelte worden de workflowstappen beschreven zoals geïmplementeerd met behulp van in de handel verkrijgbare software (zie Tabel met materialen). Elke beeldacquisitiesoftware op elke SEM die is uitgerust met de juiste detectoren kan worden gebruikt, maar de specifieke gebruikersacties zullen verschillen en zullen vaak handmatiger zijn.
<ol><li>Verkrijg een overzichtskaart van SEM-afbeeldingen die sectielocaties op de wafer onthult. Een ingebouwde optische cameraafbeelding helpt bij het definiëren van een SEM-beeldmozaïek dat een lint van secties of alle secties bedekt. Maak het mozaïek door met de muis rechts op de cameraafbeelding van het monster te klikken en te slepen en de automatische acquisitie testarten. OPMERKING: Zeer grove beeldvormingsinstellingen, d.w.z. 1-2 μm pixelgrootte en 1 μs verblijftijd volstaan. Dit proces wordt geïllustreerd in Aanvullend materiaal (pagina 2-7).</li>
	<li>Zoek secties met de functie Automatische detectie van sectiezoeker of zoek ze handmatig. Sectieposities en contouren worden automatisch opgehaald met deze software op basis van beeldmatching. Ter illustratie van dit proces, zie Aanvullend Materiaal (pagina's 8 - 15).</li>
	<li>Als de overzichtsafbeeldingen de ROI's niet duidelijk weergeven, moet u afbeeldingen met een hogere resolutie van secties verkrijgen. Gebruik de functie Sectievoorbeeld om automatisch afbeeldingen te maken en te verkrijgen. Dit proces wordt geïllustreerd in Aanvullend Materiaal,pagina 16-18. Beeldinstellingen moeten worden gekozen op basis van de aard en grootte van de ROI waarnaar de gebruiker zoekt.<ol>
<li>Om optimale instellingen te vinden, activeert u de Live Imaging in de microscoopbesturingssoftware en navigeert u naar één ROI. Wijzig de beeldinstellingen totdat de afbeeldingen ROIs duidelijk laten zien, maar de beeldacquisitie is niet overdreven lang.</li>
	</ol></li>
	<li>Afbeeldingsgebieden definiëren OPMERKING: Er worden verschillende strategieën voorgesteld.<ol>
<li>Als slechts een paar secties moeten worden afgebeeld, gebruikt u de afbeeldingen van secties die tot nu toe zijn gemaakt om naar de relevante secties te navigeren en gebruikt u de zoombare viewer die alle verkregen afbeeldingen op hun oorspronkelijke relatieve locaties toont om alle secties te bekijken. Zodra een sectie is gevonden die met hoge resolutie moet worden afgebeeld, maakt u een afbeeldingsgebied met klikken en slepen. Kies beeldinstellingen met hoge resolutie en sla de instellingen op in een sjabloon. Hergebruik deze sjabloon voor verdere secties.</li>
		<li>Om bijzonder kleine of moeilijk te detecteren zeldzame voorvallen te vinden, gebruikt u de laterale screeningsbenadering. Maak handmatig een beeldgebied met hoge resolutie beeldinstellingen op elke tiende sectie of op één sectie per lint en verkrijg de afbeeldingen. Bekijk de afbeeldingen en markeer secties die de ROI in de software bevatten of maak een notitie.<ol>
<li>Ga uit van secties die de ROI bevatten, navigeer vooruit en achteruit door de sectieset en maak afbeeldingsgebieden met hoge resolutie op dezelfde relatieve locaties zolang de structuur nog zichtbaar is in de sectie. Dit kan handmatig worden gedaan of met behulp van de procedure die in de volgende stappen wordt beschreven.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verkrijg afbeeldingen in meer dan tien opeenvolgende secties. Klik op Verfijning van positie starten nadat u inzoomt op de afbeelding om de precisie van geregistreerde sectielocaties te vergroten, zoals beschreven in de handleiding. Hierdoor neemt de positievariabiliteit van beeldreeksen af. De procedure wordt geïllustreerd en uitgelegd in aanvullend materiaal pagina's 19-21.</li>
		<li>Klik en sleep op een sectie om een afbeeldingsgebied te definiëren terwijl u de Alt-toets ingedrukt houdt en selecteer Tegelsetarray maken in het contextmenu dat wordt geopend wanneer de muisknop wordt losgelaten. De software maakt vervolgens beeldgebieden op dezelfde relatieve locatie in alle secties die eerder zijn gevonden of gemarkeerd. Het is mogelijk om de beeldvorming te beperken tot een specifiek bereik van secties met de schuifregelaar Sectiebereik. OPMERKING: Deze procedure kan worden herhaald met een willekeurig aantal beeldgebieden en maakt het daarom mogelijk om veel kleine afbeeldingen met een hoge resolutie op te nemen in plaats van een enkele grotere afbeelding op elke sectie op te nemen.</li>
		<li>Eenmaal gemaakt, stelt u het aantal pixels, de pixelgrootte, de tegellay-out, de pixelverblijftijd, enz. in elke afbeeldingsreeks in als dat nodig is. Zodra beeldreeksen zijn gemaakt en ingesteld, worden ze allemaal vermeld in een taakcue.</li>
	</ol></li>
	<li>Automatische functies configureren en de verwerving van afbeeldingen starten<ol>
<li>Maak een afzonderlijke afbeeldingsreeks voor automatische functies met dezelfde methode als beschreven in de vorige stap. Verplaats de afbeeldingsreeks naar een positie op de sectie die structuren met een hoog contrast bevat.</li>
		<li>Stel de afbeeldingsreeks in op 1024 x 884 pixels en kies een pixelgrootte die overeenkomt met de hoogste resolutie die wordt gebruikt in de afbeeldingsreeks die in de vorige stappen is ingesteld. Vink in de lijst met automatische functies Auto Focus en Auto Stigmator aan.</li>
		<li>Selecteer Op sectie in de besturingselementen voor acquisitievolgorde en zorg ervoor dat de afbeelding met automatische functies het eerste item in de lijst is. Start de afbeeldingsverwerving door op de knop Uitvoeren naast de taakcue te klikken. Deze procedures worden geïllustreerd in Aanvullend materiaal,pagina's 22-23. OPMERKING: Het is niet nodig om handmatig vooraf scherp te stellen op elke sectie. Tijdens de opnamesessie, wanneer de microscoop naar een nieuwe sectie gaat, worden de automatische functies uitgevoerd voordat alle andere beelden in deze sectie worden opgenomen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Afstemming en analyse van gegevens
<ol><li>Gegevens exporteren<ol>
<li>Zorg ervoor dat gegevens in .tif-indeling worden opgeslagen, zodat er geen speciale exportfunctie nodig is. Sorteer gegevens in een mappenstructuur die rechtstreeks overeenkomt met de lagen en elementen in de lagenstructuur.</li>
		<li>Zodra afbeeldingsmozaïeken zijn opgenomen, gebruikt u de StitchAll-functie om alle tegels automatisch te naaien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stapeluitlijning en bijsnijden in Fiji NOTITIE. Veel softwarepakketten (gratis en commercieel) kunnen worden gebruikt om met Array Tomography-gegevens te werken. De onderstaande stappen worden weergegeven met het open-sourceprogramma Fiji32 omdat het algemeen beschikbaar is en alle vereiste functies bevat.<ol>
<li>Importeer een stapel afbeeldingen (of samengevoegde afbeeldingen) in Fiji als een virtuele stapel.</li>
		<li>Als contrast/helderheid moet worden genormaliseerd, kiest u Verbeterd contrast... in het menu Proces. Stel Verzadigde pixels in op 0,1 of minder en schakel Alle segmenten verwerken in.</li>
		<li>Kies in het menu Plug-ins de optie Registratie | Lineaire stack-uitlijning met SIFT.</li>
		<li>Kies Rigid of Affine in het vervolgkeuzemenu Verwachte transformatie. Bewaar anders de standaardinstellingen. Start de uitlijning door op OKte klikken. OPMERKING: Door de gegevens als Virtual Stack te laden, kan Fiji stapels van elke grootte verwerken. De uitvoer van de uitlijning wordt gemaakt in RAM; Dit kan echter de maximale grootte van stapels die kunnen worden verwerkt beperken. Gebruik in dat geval Register Virtual Stack Slices, een map-naar-map implementatie van hetzelfde registratiealgoritme. Zodra de registratie is voltooid, laadt u de uitvoergegevens als een virtuele stack.</li>
		<li>Snijd de afbeeldingsstapel bij door op Bijsnijden te klikken zodat deze alleen de ROI bevat.</li>
		<li>Sla de stapel op als één .tif afbeelding of reeks .tif afbeeldingen. OPMERKING: Kritieke stappen van Array Tomography worden weergegeven in Figuur 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Luckner, M., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+light+microscopy+to+analytical+scanning+electron+microscopy+(SEM)+and+focused+ion+beam+(FIB)/SEM+in+biology:+Fixed+coordinates,+flat+embedding,+absolute+references.">From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+electron+microscopy+volume+of+the+brain+of+adult+Drosophila+melanogaster.">A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster.</a> Cell. 174 (3), 730-743 (2018).</li><li>Mulcahy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+volume+electron+microscopy+of+the+caenorhabditis+elegans+nervous+system.">A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system.</a> Frontiers in Neural Circuits. 12, 94 (2018).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+molecules+and+cells.">Electron tomography of molecules and cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).</li><li>Hoog, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+interphase+microtubules+in+fission+yeast+analyzed+by+electron+tomography.">Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography.</a> Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).</li><li>Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+studies+of+eukaryotic+cells+by+cryo-electron+tomography.">Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography.</a> Cells. 8 (1), 57 (2019).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+(S3EM)+on+silicon+wafers+for+ultra-structural+volume+imaging+of+cells+and+tissues.">Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues.</a> PLoS One. 7 (4), 35172 (2012).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).</li><li>Kubota, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+nanotube+tape+for+serial-section+electron+microscopy+of+brain+ultrastructure.">A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure.</a> Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).</li><li>Wacker, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+Hierarchical+Imaging+of+Serial+Sections+for+Finding+Specific+Cellular+Targets+within+Large+Volumes.">Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57059 (2018).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Templier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MagC,+magnetic+collection+of+ultrathin+sections+for+volumetric+correlative+light+and+electron+microscopy.">MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy.</a> Elife. 8, 45696 (2019).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).</li><li>Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+EM-based+reconstruction+of+the+interglomerular+projectome+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).</li><li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology:+Applications+and+technology.">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).</li><li>Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIB-SEM+tomography+in+biology.">FIB-SEM tomography in biology.</a> Methods in Molecular Biology. 1117, 541-558 (2014).</li><li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging.">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, 25916 (2017).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+cluster+ion+beam+SEM+for+imaging+of+large+tissue+samples+with+10+nm+isotropic+resolution.">Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution.</a> Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).</li><li>Maco, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+in+vivo+2+photon+and+focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+of+cortical+neurons.">Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons.</a> PLoS One. 8 (2), 57405 (2013).</li><li>Russell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+microscopes:+3D+correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+of+complex+biological+structures.">Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures.</a> Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).</li><li>Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+for+observing+the+three-dimensional+ultrastructure+of+membranous+cell+organelles+in+relation+to+their+molecular+components.">Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).</li><li>Peddie, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+and+integrated+light+and+electron+microscopy+of+in-resin+GFP+fluorescence,+used+to+localise+diacylglycerol+in+mammalian+cells.">Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).</li><li>Markert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+subcellular+localization+with+superresolution+array+tomography+on+ultrathin+sections+of+various+species.">3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species.</a> Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).</li><li>Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+precise+and+rapid+mapping+protocol+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+small+invertebrate+organisms.">A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms.</a> Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).</li><li>Kolotuev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+correlative+anatomy+of+invertebrate+model+organisms+increases+efficiency+of+TEM+data+production.">Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).</li><li>Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+acetylcholine+signaling+through+a+muscarinic+receptor+regulates+cell+migration.">Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster.">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li><li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis.">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+asymmetric+stem+cell+division.">Mechanisms of asymmetric stem cell division.</a> Cell. 132 (4), 583-597 (2008).</li><li>Daniel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+septate+junctions+assembly+and+completion+of+cytokinesis+in+proliferative+epithelial+tissues.">Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues.</a> Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).</li><li>Pasquettaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peculiar+protrusions+along+tanycyte+processes+face+diverse+neural+and+non-neural+cell+types+in+the+hypothalamic+parenchyma.">Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2020).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+image+browser:+A+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets.">Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li></ol>

De auteur Tilman Franke is een medewerker van Thermo Fisher die elektronenmicroscopen en pilotprogramma's produceert die in het artikel worden gebruikt.

Elektronenmicroscopie geeft inzicht in de ultrastructuur van de cellen en organismen, waarvoor het vaak wenselijk is om interessante structuren in hun 3-dimensionale context in beeld te brengen. Ondanks talloze EM-tactieken voor ultrastructurele analyse, is er nog steeds geen "gouden standaard" -oplossing. De belangrijkste reden is de grote verscheidenheid aan monsters, veel biologische vragen, die vaak een aanpak op maat vereisen. De voorgestelde AT-workflow is ontworpen om de tijd die nodig is voor monsterverwerking, gegevensverzameling, evaluatie en opslag te minimaliseren. Bovendien biedt het aangepaste mes een nuttig hulpmiddel om de acquisitie van arrays te vereenvoudigen. De compacte lay-out van secties op wafers is handig, zowel voor de observatie als de daaropvolgende opslag van de monsters. Deze opstelling maakt "Laterale screening" van monsters mogelijk door horizontaal van lint naar lint te gaan en slechts één sectie op elk te scannen, waardoor de tijd die nodig is om een ROI te lokaliseren aanzienlijk wordt verkort. Voorgestelde scenario's voor gegevensverzameling vergemakkelijken het richten van kleine en willekeurig verspreide gebieden. Eenmaal gevonden, beperkt AT / SEM beeldvorming met hoge resolutie precies tot het volume van interesse, of het nu handmatig of met behulp van een automatische functie wordt uitgevoerd. AT voor beperkte volumes kan handmatig worden voltooid, waarbij de operator één voor één door het monster navigeert en beeldgebieden definieert. De geautomatiseerde module van de software biedt een flexibele beeldacquisitiestrategie voor beeldvorming van kleine gebieden op grote secties. De automatisering in deze software maakt het mogelijk om grote beelden met een hoge resolutie op honderden secties op te nemen, waardoor vergelijkbare volumes als SBFI worden bereikt. Het opnemen van overzichtsbeelden van alle secties vereenvoudigt de ROI-lokalisatie en vermindert de tijd die aan de microscoop wordt doorgebracht. Aangezien de secties niet worden geschaad tijdens het opnemen van overzichten en previews met een hogere resolutie, staat AT/SEM toe dat het monster wordt hergebruikt om verdere gegevens van andere ROI's of met een hogere resolutie te verzamelen.
Beeldacquisitietijd is een van de belangrijkste (en duurste) aspecten van 3D EM en moet daarom worden overwogen in het experimentontwerp. Hoewel het niet verwonderlijk is dat het fotograferen van grote gebieden langer duurt dan het afbeelden van kleine gebieden, is het gemakkelijk om de impact te onderschatten: afhankelijk van de geselecteerde beeldvormingsparameters kan de acquisitietijd op elke sectie variëren van seconden tot uren. Kritieke beeldvormingsparameters omvatten de grootte van het gezichtsveld, de resolutie en de verblijftijd. Uitgaande van een doelresolutie van 10nm per pixel en 1 μs verblijftijd, duurt het fotograferen van een veld van 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm of 500 μm x500 μm 4 seconden, 100 seconden of 2.500 s om op te nemen. We kunnen deze beeldvormingstijden per sectie vermenigvuldigen met het aantal secties om de tijd te schatten die nodig is voor de volledige beeldvormingstaak. Lange beeldvormingstijden per sectie kunnen acceptabel zijn als het aantal secties klein is of als de tijd van het microscoopgereedschap geen probleem is.
Het is echter in de meeste gevallen noodzakelijk om de opnametijd te beperken tot een nachttaak of een weekendtaak. Een even kritisch aspect van 3D EM dat moet worden overwogen, is de hoeveelheid en structuur van de resulterende beeldgegevens. Het opnemen van de bovengenoemde beeldvelden in 100 secties genereert respectievelijk 400 mb, 10 gb of 250 GB aan beeldgegevens; de beelden van 500 μm x 500 μm vormen het bijkomende probleem dat ze elk groter zijn dan 2 gb. Veel van de softwareprogramma's die worden gebruikt voor gegevensevaluatie kunnen geen afbeeldingen van deze grootte openen.
Om de beeldtijd te verkorten, is het belangrijk om pixelverblijftijd te kiezen om te voldoen aan de vereisten voor signaal-ruisverhouding voor de daaropvolgende gegevensevaluatie (bijv. Reconstructie, tracering) en de opnames te beperken tot gedefinieerde ROI's. De AT-uitbreiding van de software vergemakkelijkt beeldacquisitie in kleine gebieden in seriële secties. De software ondersteunt handmatige en automatische workflows en vele semi-automatische varianten: beeldgebieden kunnen handmatig worden gepositioneerd en op elke sectie worden gericht, of de gebruiker kan de automatische sectiezoeker en positie-uitlijningsfuncties gebruiken. Afhankelijk van het automatiseringsniveau dat wordt gekozen en ondersteund door het voorbeeldtype of de beelddoelen, kan de tijd die nodig is voor het instellen van beeldacquisitie in honderden secties een hele werkdag (handmatig gedaan) of slechts enkele minuten duren. In principe maakt Array Tomography het uitdagender dan andere 3D EM-methoden om kleine ROI's te verwerven; onnauwkeurige plaatsing van regio's op opeenvolgende secties moet worden gecompenseerd door grotere gebieden te verwerven. Als de ROI bijvoorbeeld 20 μm x 20 μm groot is en de sectie-tot-sectie positievariabiliteit van beeldvormingsvelden 10μm is, moet men 40 μm x 40 μm afbeeldingen verkrijgen om er zeker van te zijn dat de ROI volledig wordt vastgelegd in elke afbeelding, op elke sectie. Real-world beeldpositievariabiliteit varieert van 100 μm tot <10 μm, afhankelijk van de beschikbaarheid of kwaliteit van softwarefuncties voor positie-uitlijning of het geduld van de gebruiker. Met deze software kan 10 μm worden bereikt zonder al te veel handmatige tussenkomst in de meeste monsters.
Zoals elke techniek heeft de AT verschillende zwakke punten die succesvolle gegevensverzameling kunnen beïnvloeden, en veel zijn vergelijkbaar met andere op secties gebaseerde methoden. Gebrek aan homogene verdeling van lege hars versus weefsel kan resulteren in gebogen of gebroken arrays. In extreme gevallen kunnen secties loskomen van de ondersteuning(figuur 6A). Variabele compressie of uitrekking tijdens het snijproces kan plooien creëren die het monster in variabele gebieden op volgende secties kunnen verstoren(figuur 6B). Mesmarkeringen kunnen op het oppervlak van de verzamelde secties verschijnen met behulp van een beschadigd mes(figuur 6C). Verschillen in sectiecondities kunnen incidentele sectiecompressie en dikteverschillen veroorzaken. Stof- of vuildeeltjes kunnen op een sectie terechtkomen en de interessezone gedeeltelijk verduisteren(figuur 6D). Beeldacquisitie kan mislukken als gevolg van onvolmaakte autocontrast, autofocus en auto-stigmatiseringsfuncties. De positionering van automatisch gemaakte beeldgebieden kan variabel zijn en kan de ROI in alle secties niet vastleggen.
Verschillende problemen kunnen zich voordoen in het stadium van stiksel en uitlijning. Het automatisch naaien van mozaïektegels kan bijvoorbeeld mislukken vanwege de grote lege ruimte in het monster. Door een drastische verandering in vorm in 3D kunnen beeldstapels een uitdaging zijn om te registreren. Speciaal ontwikkelde programma's (bijv. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB of MAPS-AT) kunnen semi-automatische uitlijning32,38,39,40 vergemakkelijken. Meer uitdagende secties kunnen handmatig worden uitgelijnd met behulp van fotobewerkingssoftware. Helaas zijn sommige datasets mogelijk niet correct uit te lijnen.
Grote monsters zijn een uitdaging voor TEM seriële secties die op roosters passen; aan de andere kant rechtvaardigen veel projecten geen lange automatische acquisitie met behulp van FIB/SEM of SBF-SEM. De AT is een eenvoudig alternatief voor een vervelende seriële sectie TEM waar het verzamelen en manipuleren van seriële secties op een wafer eenvoudiger is dan met de slotrasters. Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld om het verzamelen van de arrays te vergemakkelijken en we delen onze methode om de bestaande toolkit uit te breiden. In gevallen waar de identificatie van de ROI een uitdaging is, biedt AT-SEM een fundamenteel voordeel, met de efficiënte screening van de monsters waarbij organelschaalresolutie over 50 tot 500 secties vereist is. Voor grotere volumes kunnen de automatische AT-strategieën voor verzameling efficiënt worden verzameld als er meer secties nodig zijn. AT-monsters kunnen meerdere keren opnieuw worden afgebeeld, waardoor gebieden met een hoge resolutie op basis van eerder verkregen overzichtsbeelden doelgericht kunnen worden afgebeeld. Wij zijn van mening dat de gerichte analyse en verminderde oversampling door AT / SEM die hier wordt voorgesteld, de arbeids- en gegevensopslagvereisten vermindert. Uiteindelijk kunnen bibliotheken van secties worden verzameld en onderhouden voor later hergebruik en raadpleging. Voor volume-acquisitie bieden FIB- of SBF-SEM-benaderingen een uitstekende oplossing wanneer de ROI gemakkelijk te identificeren is op het blokvlak of als grote 3D-volumes nodig zijn voor de analyse. FIB/SBF-SEM zijn echter minder efficiënt wanneer de stackafbeelding met hoge resolutie op een gerichte manier moet worden verzameld uit een gedefinieerde ROI. Kortom, de voorgestelde methoden voor het screenen van AT-monsters en het gebruik van overzichtsbeelden met gemiddelde resolutie maken het mogelijk om beeldacquisitie te beperken tot de relevante delen van de sectie-array. Nauwkeurig richten van beeldregio's versnelt de time-to-data en vereenvoudigt de gegevensevaluatie.
Kortom, hoewel het concept van AT/SEM niet nieuw is, is het gebruik ervan nog steeds niet zo wijdverspreid als de verdiensten ervan doen vermoeden. Over het algemeen biedt het een aanvullende procedure voor andere bestaande EM-methoden. AT/SEM is compatibel met het breedste scala aan monstervoorbereidingsprotocollen en beeldvormingsworkflows en kan als begeleidende techniek op elke FIB/SEM- of SBF-SEM-microscoop worden uitgevoerd. In dit artikel hebben we ons geconcentreerd op AT voor het vastleggen van ultrastructurele gegevens van monsters die minder snel met succes worden aangepakt door andere methoden. We hopen dat de beschreven procedure voor het gemakkelijk verzamelen van secties en aanzienlijk geautomatiseerde acquisitiestrategieën zal helpen bij de eerste pogingen voor degenen die de methode nog nooit zijn tegengekomen en zal helpen om het te perfectioneren voor degenen die al enige ervaring hebben.

Ondanks het belang van EM-gerelateerde technieken, houdt de inspanning die nodig is om ze onder de knie te krijgen het hele veld beperkt tot een klein aantal specialisten. Een belangrijke moeilijkheid is het identificeren en ophalen van een regio van belang (ROI) in de monsters die voor EM zijn bewaard. Het uiterlijk van hetzelfde monster verschilt aanzienlijk bij analyse door optische microscopie en na verwerking voor EM-observatie. De veranderingen voor chemisch bereide monsters omvatten de anisotrope monsterkrimp na de uitdrogingsstappen (~ 10% in elke dimensie) en het verlies van fluorescentie bij gebruik van osmium in het fixatie- en kleuringsprotocol(figuur 1A). Voor de ultradunne sectie worden de monsters ingebed in epoxy- of acrylharsen met behulp van verschillende strategieën(figuur 1B). Voor een succesvol resultaat van dit preparaat moet het gehele monster worden gefractioneerd in stukken die niet groter zijn dan 1 mm x 1 mm. Om te voldoen aan de vereisten van de standaard Transmission Electron Microscopy (TEM) observatievoorwaarden, wordt dit kleine deel van het monster verder gesegmenteerd tot plakken van 50-150 nm dik. De resulterende grijswaardenbeelden tonen weefselorganisatie en organelstructuur van een minuscule fractie van het gehele monster met meer detail dan enige andere microscopietechniek (figuur 1C). Een typische TEM-dataset biedt 2D-informatie, theoretisch geëxtrapoleerd om de processen te begrijpen die van nature voorkomen in een 3D-ruimte in cellen en weefsels. Figuur 1D toont de uitdaging van ultrastructurele volumes acquisitie: als een kubus van zijde 1.000 μm wordt doorsneden op een dikte van 50 nm, zijn 20.000 secties nodig om het hele volume te bedekken; voor een zijkubus van 500 μm zijn het 10.000 secties. Om een volume van 50 μm x 50 μm x 50 μm te dekken, kunnen 1.000 secties "slechts" nodig zijn. Het handmatig verkrijgen van dit volume is praktisch onmogelijk en uiterst uitdagend om uit te voeren met automatisering. Als we, naast de diepte van het monster, het volledige oppervlak van dergelijke hypothetische kubussen moeten bedekken, wordt de dekking van het oppervlak van 1μm 2 met een redelijke resolutie een ernstig logistiek probleem(figuur 1E). Terwijl voor de buitengewone grootschalige projecten, zoals connectomics-benaderingen, het grote aantal secties cruciaal is, vormt voor de meerderheid van de "alledaagse" EM-projecten het genereren van meer secties die nodig zijn voor de observatie een aanzienlijk nadeel.
Er zijn verschillende methoden om 3D ultrastructurele informatie te verkrijgen: serial sectioning Transmission Electron Microscopy (TEM), TEM tomography, Array Tomography (AT), Serial Block Face Imaging Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) en Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM). Belangrijkste verschillen tussen deze methoden zijn de sectiestrategie en of de beeldacquisitie gekoppeld is aan sectiegeneratie1. Bij seriële sectie-TEM worden sequentiële secties verzameld op sleufrasters, TEM-afbeeldingen worden gegenereerd uit deze reeksen en uitgelijnd2,3,4,5. In TEM-tomografie bieden kantelseries van 150-300 nm secties op een raster, en wanneer gekoppeld aan seriële secties, een zeer hoge resolutie, hoewel relatief kleine volumes6,7,8. De AT-benadering maakt gebruik van fysieke secties met diverse handmatige en semi-automatische manieren van sectieverzameling op relatief grote ondersteuning, zoals glazen afdekplaat, siliciumwafers of een speciale tape. Voor beeldacquisitie wordt de ondersteuning geanalyseerd in SEM, met verschillende beeldacquisitiestrategieën zijn beschikbaar9,10,11,12,13,14,15. Voor SBF-SEM wordt fysieke sectie bereikt met behulp van een mini-microtoom met een diamantmes dat direct in de SEM-kamer is geplaatst, waarbij het SEM-beeld wordt gegenereerd vanaf het oppervlak van het harsblok16,17,18,19. Voor FIB-SEM verwijdert de ionenbron dunne lagen van het monster, gevolgd door automatische beeldvorming van het blootgestelde oppervlak door de SEM20,21. TEM-tomografie en de AT genereren fysieke secties, die indien nodig opnieuw in beeld kunnen worden gebracht, terwijl FSBF-SEM en FIB-SEM de sectie na beeldvorming elimineren. Een recente combinatie van fysieke secties afgebeeld door een multi-beam SEM biedt een combinatie van methoden die het "bottleneck" -probleem van de snelheid van beeldacquisitie oplost22. Elk van deze technieken heeft een revolutie teweeggebracht in de manier waarop EM-gegevens kunnen worden verkregen en geanalyseerd, en elke benadering heeft zijn praktische effecten met betrekking tot een bepaalde onderzoeksvraag.
Gezien de aard van het preparaat en de schaal van de ultrastructurele dimensies, is het niet eenvoudig te voorspellen waar een specifieke doelstructuur zich in het monsterblok bevindt (Figuur 1D,E). Een oplossing voor de ROI-lokalisatie is het vastleggen van de beelden uit het hele blok met de gewenste resolutie vanaf het begin. De structuren van belang kunnen zich in het verkregen gegevensvolume bevinden wanneer ze niet van de microscoop verwijderd zijn. Acquisitietijd en gegevensverwerking in verband met deze strategie zijn problematisch. Het is wenselijk om de hoeveelheid geregistreerde gegevens te verminderen, vooral als de ROI's veel kleiner zijn dan het weefselblok, d.w.z. als de objecten van belang specifieke soorten cellen zijn (geen hele organen). Verschillende correlatieve licht- en elektronenmicroscopietechnieken (CLEM) kunnen succesvol zijn wanneer de fluorescentie wordt bewaard en gelokaliseerd voor of na de bereiding binnen hetzelfde monster23,24,25,26,27,28,29. Niettemin zijn veel cellulaire structuren herkenbaar, zelfs zonder fluorescentiecorrelatie, alleen gebaseerd op de bekende ultrastructuur. Voor deze gevallen zijn we van mening dat laterale screening Array Tomography een balansafweging biedt tussen de inspanning die is geïnvesteerd in ROI-lokalisatie en de ultrastructurele informatiekwaliteit. Met behulp van deze strategie wordt binnen regelmatige tussenpozen een subset van secties op de wafer gescreend, die kunnen worden vastgesteld op basis van de grootte en aard van de ROI. Zodra ROI's zijn gevonden, wordt gegevensverzameling opgezet in een continue reeks secties die beginnen voor en eindigen na de ankersectie, waarbij de relevante informatie op een gerichte manier wordt verzameld.
We presenteren protocollen voor AT die de acquisitie van regio's of evenementen van belang in tal van secties vereenvoudigen en versnellen en beter uitgelijnde beeldvolumes opleveren. Laterale screening en multistep acquisitie produceren gegevens met een zeer hoge resolutie in precies gerichte regio's. De procedure die we beschrijven, behandelt verschillende uitdagingen van 3D EM-gegevensverzameling, omdat deze voorziet in: compatibiliteit met een breed scala aan monsters zonder de workflow voor monstervoorbereiding fundamenteel te veranderen; gerichte lokalisatie voor sectie- en SEM-acquisities; minder tijd en moeite tijdens de installatie; beeldvorming van regio's in meerdere secties met een betere uitlijning van de resulterende volumes; en een soepele stik- en uitlijningsprocedure om verschillende afbeeldingen samen te stellen tot een gestikt mozaïekbeeld. We kozen ervoor om de kracht van onze methode aan te tonen met verschillende voorbeelden van gepubliceerde en lopende projecten. Wij zijn van mening dat deze aanpak het genereren en verwerven van gerichte EM-gegevens aanzienlijk kan vergemakkelijken, zelfs voor onderzoekers met beperkte EM-ervaring.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AT sectioning knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUATS3530</td>
			<td>Diatome Jumbo knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td>Diatome trimming 20&#176; 
			Glass knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16015</td>
			<td>Resistance: 1-30 Ohms 
			Type P: (Boron) (1 primary flat) 
			Roughness: 2 nm 
			No SiO2 top coating 
			TTV: = &#60;20 &#181;m 
			Wafer is polished on one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer cleaving kit</td>
			<td>EMS</td>
			<td>7642</td>
			<td>EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Thermo Fischer Helios</td>
			<td>1072419</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maps 3 for SEM with Correlative Workflow &#38; Array Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1135932</td>
			<td>Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira x.y</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131599</td>
			<td>Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td>IMOD, MIB (See text for refferences)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy

Elektronenmicroscopie wordt toegepast in de biologie en geneeskunde voor beeldvorming van cellulaire en structurele details met nanometerresolutie. Historisch gezien gaf Transmission Electron Microscopy (TEM) inzicht in cel ultrastructuur, maar in het afgelopen decennium heeft de ontwikkeling van moderne Scanning Electron Microscopes (SEM) de manier van kijken in de cellen veranderd. Hoewel de resolutie van TEM superieur is wanneer structurele details op eiwitniveau nodig zijn, is SEM-resolutie voldoende voor de meerderheid van de celbiologiegerelateerde vragen op organelniveau. De technologische vooruitgang maakte automatische volume-acquisitieoplossingen mogelijk, zoals Serial block-face imaging (SBF-SEM) en Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Niettemin blijven deze methoden tot op de dag van vandaag inefficiënt wanneer de identificatie en navigatie naar interessegebieden cruciaal zijn. Zonder de middelen voor nauwkeurige lokalisatie van doelgebieden vóór beeldvorming, moeten operators veel meer gegevens verzamelen dan ze nodig hebben (in SBF-SEM), of, erger nog, veel rasters voorbereiden en ze allemaal in beeld brengen (in TEM). We stellen de strategie voor van "laterale screening" met behulp van Array Tomography in SEM, die de lokalisatie van interessegebieden vergemakkelijkt, gevolgd door geautomatiseerde beeldvorming van de relevante fractie van het totale monstervolume. Arraytomografiemonsters worden bewaard tijdens het afbeelden en kunnen worden gerangschikt in sectiebibliotheken die klaar zijn voor herhaalde beeldvorming. Er worden verschillende voorbeelden getoond waarin laterale screening ons in staat stelt om structurele details te analyseren die ongelooflijk moeilijk toegankelijk zijn met een andere methode.

Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

We beschrijven de voorbereiding van linten van seriële secties en hun verzameling op grote overdrachtsondersteuning voor gebruik als Array Tomography-monsters, samen met geautomatiseerde beeldvormingsprocedures in een scanning elektronenmicroscoop. Het protocol maakt screening, retrieval en gerichte beeldvorming van lokale, zeldzame gebeurtenissen en de verwerving van grote gegevensvolumes mogelijk.

Array Tomography Workflow voor de gerichte acquisitie van volume-informatie met behulp van Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Elektronenmicroscopie-analyse is vaak complex. Wij zijn van mening dat ons protocol de verwerking en verwerving van de EM-gegevens van het grote monsteroppervlak en het tussenvolume vergemakkelijkt. Ons protocol helpt bij het vinden van doelstructuren in seriële secties.Gegevensregistratie is beperkt tot wat nodig is. In vergelijking met data-acquisitie in hele weefselblokken wordt de opnametijd verkort en data-analyse eenvoudiger. Gezien het algehele gemak van de aanpak, geloven we dat het kan worden gebruikt om niet alleen wetenschappelijke vragen aan te pakken, maar ook als een diagnostisch hulpmiddel.Om een array voor analyse te genereren, klemt u het monster eerst op een ultramicrotome houder en gebruikt u een scheermesje om de hars rond het monster ruwweg te trimmen. Gebruik een diamantsnijgereedschap om het monster fijn te snijden en gebruik snijmessen met een helling van 20 of 90 graden om ervoor te zorgen dat de boven- en onderkant van het blok evenwijdig zijn aan de snijkant van het mes. Meng xyleen en lijm in een verhouding van 3:1 en gebruik een wimper die aan een tandenstoker is bevestigd om het mengsel op de boven- en onderrand van het bijgesneden blok aan te brengen.Gebruik tijdens het drogen van het mengsel een waferklieven om een stuk wafer op de juiste grootte voor de analyse te snijden. Reinig de wafer in gedestilleerd water om vuil weg te spoelen en reinig het oppervlak met plasma nadat de wafer droog is. Om een array tomografie mes te bereiden, gebruik je schuimende plakband om een naald aan de onderkant van een histo jumbo mes te bevestigen en plaats je het mes in de ultra microtome houder op nul graden.Stel de rand van het mes evenwijdig aan het blokoppervlak aan en breng het bijgesneden blok naar de rand van het mes in een positie die klaar is voor sectie. Plaats de schone wafel in het mesbassin en vul het bassin met water tot hetzelfde niveau als de mesrand, laat vervolgens de diamantrand van het mes goed bevochtigen, gebruik de bijgevoegde spuit om water toe te voegen of op te zuigen als dat nodig is. Voor array-sectie stelt u de microtoom in op een snijbereik van 50 tot 100 nanometer en een snijsnelheid van 6 tot 1 millimeter per seconde en begint u met secties om een lint te verkrijgen dat lang genoeg is om een gericht Z-volume te bedekken.Afhankelijk van de blokgrootte, homogeniteit van het weefsel en het type hars, zal het lint ongeveer recht zijn. Gebruik een schone, niet-kleverige punt van een wimper om de linten los te maken van de mesrand. Gebruik de wimper om het lint voorzichtig naar het midden van het steunmedium te verplaatsen.Chloroform of een verwarmingspen kan worden gebruikt om de sectie indien nodig uit te rekken. Trek na het uitrekken de spuit terug om te beginnen met het aftappen van het water. Voor delicatere linten of een langzamere terugtrekking van het water, maakt u de spuit los van de slang om het water te laten druppelen.Wanneer het waterniveau het waferniveau bereikt, duwt u het lint voorzichtig naar het midden van het bassin en blijft u draineren totdat al het resterende water volledig uit het bassin is verwijderd. Laat de wafer drogen in een schone omgeving. Het drogen duurt ongeveer 30 minuten.Wanneer het monster volledig is gedroogd, brengt u de array over naar een goed gesloten doos om het te beschermen tegen vuilverontreiniging. En zet de doos minstens 30 minuten in een oven van 60 graden Celsius. Als u een overzichtskaart van SEM-afbeeldingen wilt verkrijgen die sectielocaties op de wafer onthult, gebruikt u de ingebouwde optische camera om een SEM-afbeelding te verkrijgen die een lint van secties bedekt.Als u een mozaïek wilt maken, klikt en sleept u de cameraafbeelding van het monster en start u de automatische acquisitie. Verkrijg overzichten met een hogere resolutie om doelstructuren te vinden. Als slechts een paar secties moeten worden afgebeeld, gebruikt u een zoombare viewer om verkregen afbeeldingen op hun oorspronkelijke locaties te bekijken.Zodra een sectie is geïdentificeerd die met hoge resolutie moet worden afgebeeld, klikt en sleept u om een beeldgebied te maken, selecteert u Vervolgens Beeldinstellingen met hoge resolutie en slaat u de instellingen op in een sjabloon Om bijzonder kleine of moeilijk te detecteren zeldzame gebeurtenissen te vinden, gebruikt u de beeldinstellingen met hoge resolutie op elke 10e sectie of op één sectie per lint om handmatig een beeldgebied te maken en de afbeeldingen te verkrijgen. Bekijk vervolgens de afbeeldingen en markeer secties die het interessante gebied bevatten. Als u meer dan 10 opeenvolgende secties wilt verkrijgen, gebruikt u de sectiezoeker om alle secties automatisch te vinden.Als de overzichtsafbeeldingen geen duidelijke interessegebieden weergeven, verkrijgt u afbeeldingen met een hogere resolutie van de secties en gebruikt u de sectievoorbeeldfunctie om de afbeeldingen automatisch te maken en te verkrijgen. Om de optimale beeldvormingsinstellingen te bepalen, activeert u de live beeldvorming in de microscoopbesturingssoftware en navigeert u naar één interessegebied en past u vervolgens de beeldinstellingen aan totdat de afbeeldingen duidelijke interessegebieden laten zien, maar zonder een te lange beeldacquisitie, volgens de richtlijnen van de fabrikant. Als u de positionering van de afbeeldingsgebieden op opeenvolgende secties wilt optimaliseren, zoomt u in op de gewenste afbeelding en klikt u op Verfijning van positie starten om de precisie van geregistreerde sectielocaties te vergroten.Als u een afbeeldingsgebied wilt definiëren, klikt en sleept u op een sectie terwijl u de Alt-toets ingedrukt houdt en selecteert u Array voor tegelset maken in het pop-upcontextmenu. De software maakt beeldgebieden op dezelfde relatieve locatie in alle secties die zijn gevonden of eerder zijn gemarkeerd. Stel vervolgens het aantal pixels, de pixelgrootte, de tegellay-out en de pixelverblijftijd in elke afbeeldingsreeks in als dat nodig is.Als u de automatische functie wilt configureren, maakt u een afzonderlijke afbeeldingsreeks voor automatische functies zoals gedemonstreerd en verplaatst u de afbeeldingsreeks naar een positie op de sectie die structuren met hoog contrast bevat. Stel de afbeeldingsreeks in op 1024 x 884 pixels en selecteer een pixelgrootte die overeenkomt met de hoogste resolutie die in de afbeeldingsreeks wordt gebruikt. Vink in de lijst met automatische functies Auto focus en Auto stigmator aan.Selecteer Bisection in de besturingselementen voor acquisitiereeksen en controleer of de afbeelding van de automatische functie het eerste item in de lijst is en klik vervolgens op Alles aanschaffen om de afbeeldingsacquisitie te starten. Wanneer alle imaging-series zijn gemaakt en ingesteld, wordt de serie weergegeven in een taakwachtrij. Acquisitie met lage resolutie kan handmatig of automatisch rechtstreeks op geselecteerde delen van de sectie of een hele sectie worden uitgevoerd met behulp van enkele of mozaïekafbeeldingen, gevolgd door stiksels.Afbeeldingen uit het geselecteerde gebied kunnen vervolgens worden verkregen met behulp van parameters met hoge resolutie om mitochondriën, kernen en microvilli te visualiseren, bijvoorbeeld Nadat de automatische verwerving van opgeloste mozaïekkaarten is geselecteerd, kunnen verschillende interessante regio's worden bijgesneden of worden gebruikt om extra lokale beeldvormingsgebieden binnen de regio's te definiëren. Hoewel verschillende gespecialiseerde celtypen in de Drosophila-darm willekeurig worden verdeeld, kunnen ze visueel worden onderscheiden na het screenen van de beelden met behulp van parameters met hoge resolutie, hetzij uit afzonderlijke secties of als een verzameling seriële afbeeldingen. Na de uitlijning kunnen de stacks worden gerenderd met behulp van verschillende softwareoplossingen.Arraytomografie-analyse maakt het mogelijk om veel opeenvolgende secties te genereren op de enkele wafer en te worden gescreend met behulp van parameters met een lage resolutie om de algemene interessegebieden te lokaliseren. Deze gebieden kunnen worden gericht voor verdere analyse met behulp van geavanceerde acquisitieparameters. Mytotische delingen in het notum zijn bijvoorbeeld niet gemakkelijk te lokaliseren op het ultrastructurele niveau, omdat de cellen relatief groot zijn in vergelijking met de abscissiezone.Met behulp van deze methode kunnen echter de automatische overzichtsbeelden met gemiddelde resolutie van de sprongen van 20 tot 40 secties worden gebruikt om de delende cellen te lokaliseren. De arraytomografieprocedure biedt een meer eenvoudige elektronenmicroscopiegegevensanalyse. We moedigen de kijkers aan om te investeren in het beheersen van de regeneratie en zich vertrouwd te maken met de kaartgerelateerde workflow In onze ervaring vereisen weinig onderzoeksonderwerpen de ultrastructurele analyse van hele dieren of hele organen.Onze methode helpt bij een snelle lokalisatie van cellen en hun interactiepartners in weefsels.

Research

JoVE Journal

Biology

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Een gestandaardiseerde methode voor de analyse van lever sinusoïdale endotheelcellen en hun fenestraties van Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Scanning Electron Microscopy van Gemacereerde Tissue te visualiseren de extracellulaire matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocollen voor Problematisch Plant, oömyceet en Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Voorbereiding en observatie van Thick biologische monsters door Scanning Transmission Electron Tomografie

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Onderzoek naar de nadelige effecten van lage druk Plasma sterilisatie op het voortbestaan van Bacillus subtilis sporen met behulp van Live cel microscopie

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van Scanning elektronen microscopie (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

Gerichte studies met behulp van seriële blokkering en gerichte ionen straal scan elektronenmicroscopie

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopie (SBF-SEM) van biologische weefselmonsters

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...