Name: array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Nous tenons à remercier les membres du service EM de l’Université de Lausanne pour leur soutien lors de ce développement des différentes étapes de la procédure AT. Nous tenons à remercier Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O’Brien et Lindsay Lewellyn pour les discussions lors de la préparation du manuscrit et de la lecture critique. Nous tenons à remercier les groupes qui ont fourni les échantillons utilisés pour démontrer les différents scénarios : Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat et Fanny Langlet.

NOTE: Les méthodes de préparation des échantillons sont décritesailleurs 14,30,31et ne sont pas couvertes dans cette publication. En bref, les exemples montrés ont été chimiquement fixés avecdu glutaraldéhyde, post-fixés avec 1% d’OsO4, puis traités avec de l’acétate d’uranyle aqueux à 1% avant d’être incorporés dans la résine incorporée. Alternativement, les échantillons peuvent être préparés en utilisant la congélation à haute pression, congeler remplacé par 0,1% d’acétate d’uranyle dans l’acétone et incorporé dans de la résine acrylique. Les blocs d’échantillons ont été préparés à l’aide d’une méthode d’intégration plate qui permet une vue claire de l’échantillon, facilitant ainsi son orientation pour la section (Figure 1B).
1. Procédure de génération de baie
<ol><li>Orientation et rognage d’échantillons incorporés<ol>
<li>À l’aide de la jumelle / microscope, identifiez et marquez le retour sur investissement sur la surface du bloc intégré en grattant légèrement la surface du bloc avec une lame de rasoir. Cela aidera à orienter l’échantillon à l’intérieur de l’ultramicrotome et réduira la surface de sectionnement.</li>
		<li>Serrez l’échantillon sur le support ultramicrotome (Figure 2A).</li>
		<li>Coupez la résine autour de l’échantillon, d’abord avec la lame de rasoir (rognage brut) et continuez avec l’outil de coupe en diamant (rognage fin; Figure 2A). Utilisez des couteaux avec une inclinaison de bord de 20 ° ou 90 ° pour vous assurer que les surfaces supérieure et inférieure du bloc sont parallèles au bord de coupe du couteau. REMARQUE : cette étape est essentielle pour la sectionnement en série et l’acquisition de rubans droits.</li>
		<li>Mélanger le xylène et la colle dans une proportion de 3:1. Avec un cil attaché à un cure-dent, appliquez ce mélange sur les bords supérieur et inférieur du bloc coupé. Laissez-le sécher à fond.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparez le support de montage de la baie A (c’est-à-dire les plaquettes de silicium).<ol>
<li>Coupez la pièce de plaquette à l’aide d’un outil de clivage de plaquette (EMS), en ajustant sa taille à l’objectif du projet. 2 cm x 4 cm est pratique pour les observations en microscopie optique et électronique.</li>
		<li>Nettoyez la plaquette dans de l’eau distillée pour vous débarrasser des débris.</li>
		<li>La décharge incandescente / plasma nettoie la surface à l’aide d’un équipement standard. Les paramètres précis dépendront de la machine utilisée. Commencez par les paramètres de décharge des grilles et ajustez empiriquement l’heure. Cette étape est cruciale pour une bonne répartition des sections sur le support pendant le séchage des sections et ne doit pas être omise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparez le support de montage B des matrices (c.-à-d. couvercle en verre)<ol>
<li>Si vous planifiez des expériences d’immuno-marquage multiplex, transférez les échantillons sur un couvercle pour mieux détecter le signal de fluorescence. Pour améliorer l’adhérence du couvercle, utilisez une procédure détaillée de revêtement à la gélatine décrite précédemment9.</li>
		<li>Augmenter la conductivité en recouvrant les lames d’oxyde d’indium-étain (ITO) ou d’or par évaporation. Conservez les couvercles préparés dans un environnement propre. Décharge incandescente des échantillons comme décrit au point 1.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sectionnement de l’échantillon
<ol><li>Préparation du couteau AT REMARQUE: Pour générer les tableaux, utilisez un couteau modifié (ATS), conçu pour faciliter l’acquisition de longs rubans. Les couteaux Histo-Jumbo ou des couteaux similaires conçus pour la génération des sections sur de grands supports peuvent également servir pour le sectionnement AT.<ol>
<li>Fixez l’aiguille au fond du couteau à l’aide du ruban adhésif mousseux et percez-la(Figure 2B). Placez le couteau ATS dans le support ultramicrotome à 0°. Ajustez le bord du couteau parallèlement à la surface du bloc à l’aide de la procédure standard.</li>
		<li>Amenez le bloc coupé sur le bord du couteau dans une position prête pour le sectionnement.</li>
		<li>Placez la plaquette / couvercle à l’intérieur du bassin du couteau et remplissez-le d’eau au même niveau que le bord du couteau. Laissez le bord en diamant du couteau humidifier correctement et, si nécessaire, retirez l’eau à l’aide de la seringue attachée (Figure 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Sectionnement et transfert de baies<ol>
<li>Réglez le microtome sur les paramètres de coupe souhaités. Avec le couteau ATS, la plage de 50-100 nm et une vitesse de coupe de 0,6-1 mm/s sont conseillées. Commencer le sectionnement (Figure 2Di).</li>
		<li>Obtenez un ruban de la longueur qui couvrira un volume z ciblé et arrêtera la collection. Selon la taille du bloc, l’homogénéité du tissu et le type de résine, le ruban sera relativement droit (Figure 2D-ii). De nombreux échantillons ne produiront pas de rubans droits, malgré l’effort investi et le type de couteau utilisé.</li>
		<li>Selon l’objectif final, faites un ou plusieurs rubans courts alignés côte à côte. Un support de 2 cm x 4 cm peut facilement contenir 100 à 1 000 sections. La disposition du ruban sur la marche de support est une étape qui nécessite de la dextérité et des mains fermes. Cependant, la courbe d’apprentissage de cette compétence est rapidement acquise.</li>
		<li>Détachez le ruban du bord du couteau à l’aide d’une pointe propre et non collante d’un cil collé sur le cure-dent (Figure 2Diii).</li>
		<li>À l’aide des cils, déplacez doucement le ruban au-dessus du centre du support. À ce stade, utilisez du chloroforme ou un stylo chauffant pour étirer les sections si nécessaire. Cependant, rappelez-vous que cette manipulation peut induire une rupture et une déformation du ruban.</li>
		<li>Commencez à drainer l’eau en tirant sur la seringue. Pour des rubans plus délicats ou une rétraction de l’eau plus lente, laissez couler l’eau en détachant la seringue du tuyau. Lorsque le niveau d’eau descend au niveau de la plaquette, contrôlez le ruban et repositionnez-le si nécessaire, en poussant doucement le ruban vers le centre. Après avoir déposé les rubans sur la surface de la plaquette, continuez à drainer jusqu’à ce que l’eau restante soit complètement rétractée du bassin. REMARQUE: Si vous n’utilisez pas le couteau ATS à rétraction d’eau de fond, réduisez soigneusement l’eau des côtés du couteau ATS pour ne pas induire de turbulence.</li>
		<li>Laissez les sections sur le support à l’intérieur du bain pour laisser sécher complètement. Selon l’hydrophobicité du support et le niveau d’humidité ambiante, l’eau s’évapore à un rythme différent(Figure 2Div). Il est important de laisser l’échantillon sécher lentement pour diminuer ou éviter complètement tous les plis de l’échantillon.</li>
		<li>Transférer l’échantillon sec dans une boîte bien fermée pour le protéger de la contamination par la saleté et le placer dans un four à 60 °C pendant au moins 30 min. Si nécessaire, contre-taches en utilisant des métaux lourds pour améliorer le contraste global.</li>
		<li>À la fin de la procédure, nettoyez prudemment le couteau en suivant les instructions du fabricant. REMARQUE: Le transfert de sections multiples ou série sur une plaquette (Figure 2E) par rapport au transfert sur une grille de fentes (Figure 2F) modifie complètement l’expérience de préparation EM. La section et la collecte ininterrompues des sections sur un support unique réduisent la quantité d’erreurs liées à la section et à la collection de sections fréquemment commises dans la section série. L’équivalent de 100 sections de 1000 μm x 500 μm collectées sur une plaquette correspond à 33 grilles de fentes (Figure 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Observation de l’échantillon
REMARQUE : cette section décrit les étapes du flux de travail telles qu’implémentées à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux). Tout logiciel d’acquisition d’images sur n’importe quel SEM équipé des détecteurs appropriés peut être utilisé, cependant, les actions spécifiques de l’utilisateur seront différentes et seront souvent plus manuelles.
<ol><li>Obtenez une carte d’ensemble des images SEM qui révèle l’emplacement des sections sur la plaquette. Une image de caméra optique intégrée aide à définir une mosaïque d’images SEM qui couvre un ruban de sections ou toutes les sections. Créez la mosaïque en cliquant avec la souris à droite sur l’image de la caméra de l’échantillon et démarrez l’acquisition automatique. REMARQUE: Les paramètres d’imagerie très grossiers, c’est-à-dire une taille de pixel de 1 à 2 μm et un temps de séjour de 1 μs suffisent. Ce processus est illustré dans les documents supplémentaires (pages 2 à 7).</li>
	<li>Localisez les sections à l’aide de la fonction détection automatique du Localisateur de sections ou localisez-les manuellement. Les positions et les contours des sections sont récupérés automatiquement avec ce logiciel en fonction de la correspondance d’images. Pour une illustration de ce processus, voir Documents supplémentaires (pages 8 à 15).</li>
	<li>Dans le cas où les images d’aperçu n’affichent pas clairement les retours sur investissement, acquérez des images de sections de plus haute résolution. Utilisez la fonction Aperçu de section pour créer et acquérir automatiquement des images. Ce processus est illustré dans les documents supplémentaires,pages 16-18. Les paramètres d’imagerie doivent être choisis en fonction de la nature et de la taille du retour sur investissement recherché par l’utilisateur.<ol>
<li>Pour trouver les paramètres optimaux, activez l’imagerie en direct dans le logiciel de contrôle du microscope et accédez à un retour sur investissement. Modifiez les paramètres d’imagerie jusqu’à ce que les images affichent clairement les retours sur investissement, mais l’acquisition d’images n’est pas excessivement longue.</li>
	</ol></li>
	<li>Définir des régions d’imagerie NOTE : Plusieurs stratégies différentes sont proposées.<ol>
<li>Si seules quelques sections doivent être imagées, utilisez les images des sections créées jusqu’à présent pour accéder aux sections pertinentes et utilisez la visionneuse zoomable qui affiche toutes les images acquises dans leur emplacement relatif d’origine pour regarder toutes les sections. Une fois qu’une section doit être imagée en haute résolution est trouvée, créez une région d’imagerie en faisant glisser un clic. Choisissez les paramètres d’imagerie haute résolution et stockez-les dans un modèle. Réutilisez ce modèle pour d’autres sections.</li>
		<li>Pour trouver des événements rares particulièrement petits ou difficiles à détecter, utilisez l’approche de dépistage latéral. Créez manuellement une région d’imagerie avec des paramètres d’imagerie haute résolution sur dix sections ou sur une section par ruban et acquérez les images. Passez en revue les images et marquez les sections qui contiennent le retour sur investissement dans le logiciel ou prenez note.<ol>
<li>En partant des sections qui contiennent le retour sur investissement, naviguez vers l’avant et vers l’arrière dans l’ensemble de sections et créez des régions d’imagerie haute résolution dans les mêmes emplacements relatifs tant que la structure est toujours visible dans la section. Cela peut être fait manuellement ou en utilisant la procédure décrite dans les étapes suivantes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Acquérir des images dans plus de dix sections consécutives. Cliquez sur Affiner la position de départ après avoir zoomé sur l’image pour augmenter la précision des emplacements de section enregistrés, comme décrit dans le manuel. Cela réduit la variabilité de position des séries d’images. La procédure est illustrée et expliquée dans les pages 19 à 21 du Matériel supplémentaire.</li>
		<li>Cliquez sur n’importe quelle section pour définir une région d’imagerie tout en maintenant la touche Alt enfoncée et sélectionnez Créer un tableau de jeux de tuiles dans le menu contextuel qui s’ouvre lorsque le bouton de la souris est relâché. Le logiciel crée ensuite des régions d’imagerie au même emplacement relatif dans toutes les sections qui ont été trouvées ou marquées précédemment. Il est possible de limiter l’imagerie à une plage spécifique de sections à l’aide du curseur Portée de section. REMARQUE: Cette procédure peut être répétée avec n’importe quel nombre de régions d’imagerie et permet donc d’enregistrer de nombreuses petites images haute résolution au lieu d’enregistrer une seule image plus grande sur chaque section.</li>
		<li>Une fois créé, configurez le nombre de pixels, la taille des pixels, la disposition du carrelage, le temps de séjour des pixels, etc. dans chaque série d’images selon vos besoins. Une fois les séries d’imagerie créées et configurées, elles sont toutes répertoriées dans un repère de travail.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurer les fonctions automatiques et démarrer l’acquisition d’images<ol>
<li>Créez une série d’images distincte pour les fonctions automatiques en utilisant la même méthode que celle décrite à l’étape précédente. Déplacez la série d’images vers une position sur la section qui contient des structures à contraste élevé.</li>
		<li>Définissez la série d’images sur 1024 x 884 pixels et choisissez une taille de pixel correspondant à la résolution la plus élevée utilisée dans la série d’images configurée dans les étapes précédentes. Dans la liste des fonctions automatiques, cochez Auto Focus et Auto Stigmator.</li>
		<li>Sélectionnez Par section dans les contrôles de séquence d’acquisition et assurez-vous que l’image des fonctions automatiques est le premier élément de la liste. Démarrez l’acquisition d’image en cliquant sur le bouton Exécuter en regard du repère de tâche. Ces procédures sont illustrées dans les documents supplémentaires,pages 22-23. REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de se pré-concentrer manuellement sur chaque section. Pendant la session d’enregistrement, chaque fois que le microscope avance vers une nouvelle section, les fonctions automatiques seront exécutées avant que toutes les autres images ne soient enregistrées dans cette section.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Alignement et analyse des données
<ol><li>Exportation de données<ol>
<li>Assurez-vous que les données sont enregistrées dans .tif format, de sorte qu’il n’y a pas besoin d’une fonction d’exportation dédiée. Triez les données dans une structure de dossiers qui correspond directement aux couches et aux éléments de l’arborescence des couches.</li>
		<li>Une fois les mosaïques d’images enregistrées, utilisez la fonction StitchAll pour assembler automatiquement toutes les tuiles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alignement et recadrage des piles aux Fidji NOTE. De nombreux progiciels (gratuits et commerciaux) peuvent être utilisés pour travailler avec les données Array Tomography. Les étapes ci-dessous sont montrées avec le programme open-source Fiji32 car il est largement disponible et contient toutes les fonctions requises.<ol>
<li>Importez une pile d’images (ou d’images assemblées) dans Fidji en tant que pile virtuelle.</li>
		<li>Si le contraste/luminosité doit être normalisé, choisissez Contraste amélioré... dans le menu Processus. Définissez Pixels saturés sur 0,1 ou moins, puis cochez Traiter toutes les tranches.</li>
		<li>Dans le menu Plugins, choisissez Enregistrement | Alignement linéaire de la pile avec SIFT.</li>
		<li>Choisissez Rigide ou Affine dans le menu déroulant Transformation attendue. Sinon, conservez les paramètres par défaut. Démarrez l’alignement en cliquant sur OK. REMARQUE: Le chargement des données en tant que pile virtuelle permet à Fidji de gérer des piles de toute taille. La sortie de l’alignement est créée en RAM ; toutefois, cela peut limiter la taille maximale des piles pouvant être traitées. Dans ce cas, utilisez Register Virtual Stack Slices, qui est une implémentation de dossier à dossier du même algorithme d’enregistrement. Une fois l’enregistrement terminé, chargez les données de sortie en tant que pile virtuelle.</li>
		<li>Recadrez la pile d’images en cliquant sur Recadrer afin qu’elle ne contienne que le retour sur investissement.</li>
		<li>Enregistrez la pile en tant qu’image .tif unique ou série d’images .tif. REMARQUE : Les étapes critiques de la tomographie en réseau sont illustrées à la figure 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Luckner, M., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+light+microscopy+to+analytical+scanning+electron+microscopy+(SEM)+and+focused+ion+beam+(FIB)/SEM+in+biology:+Fixed+coordinates,+flat+embedding,+absolute+references.">From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+and+integrated+light+and+electron+microscopy+of+in-resin+GFP+fluorescence,+used+to+localise+diacylglycerol+in+mammalian+cells.">Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).</li><li>Markert, S. 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R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+image+browser:+A+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets.">Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li></ol>

L’auteur Tilman Franke est un employé de Thermo Fisher qui fabrique des microscopes électroniques et des programmes pilotes utilisés dans l’article.

La microscopie électronique donne un aperçu de l’ultrastructure des cellules et des organismes, pour laquelle il est souvent souhaitable d’imager des structures d’intérêt dans leur contexte en 3 dimensions. Malgré de nombreuses tactiques EM pour l’analyse ultrastructurale, il n’existe toujours pas de solution « de référence ». La raison principale est la grande variété d’échantillons, de nombreuses questions biologiques, qui nécessitent souvent une approche sur mesure. Le flux de travail AT proposé est conçu pour minimiser le temps nécessaire au traitement des échantillons, à l’acquisition des données, à l’évaluation et au stockage. De plus, le couteau modifié fournit un outil utile pour simplifier l’acquisition de matrices. La disposition compacte des sections sur les plaquettes est pratique, à la fois pour l’observation et le stockage ultérieur des échantillons. Cette disposition permet le « criblage latéral » des échantillons en se déplaçant horizontalement d’un ruban à l’autre et en ne scannant qu’une seule section sur chacun, ce qui réduit considérablement le temps nécessaire pour localiser un retour sur investissement. Les scénarios d’acquisition de données proposés facilitent le ciblage de zones petites et réparties de manière aléatoire. Une fois trouvé, AT/SEM limite précisément l’imagerie haute résolution au volume d’intérêt, qu’elle soit effectuée manuellement ou à l’aide d’une fonction automatique. AT pour les volumes limités peut être complété manuellement, l’opérateur naviguant dans l’échantillon et définissant les régions d’imagerie une par une. Le module automatisé du logiciel fournit une stratégie d’acquisition d’images flexible pour l’imagerie de petites zones sur de grandes sections. L’automatisation de ce logiciel permet d’enregistrer de grandes images haute résolution sur des centaines de sections, obtenant des volumes similaires à SBFI. L’enregistrement d’images de vue d’ensemble de toutes les sections simplifie la localisation du retour sur investissement et réduit le temps passé au microscope. Étant donné que les sections ne sont pas endommagées lors de l’enregistrement des aperçus et des aperçus de résolution supérieure, AT/SEM permet de réutiliser l’échantillon pour collecter d’autres données d’autres rois ou à une résolution plus élevée.
Le temps d’acquisition d’images est l’un des aspects les plus importants (et les plus coûteux) de 3D EM et doit donc être pris en compte dans la conception de l’expérience. S’il n’est pas surprenant que l’imagerie de grandes zones prenne plus de temps que l’imagerie de petites zones, il est facile de sous-estimer l’impact : selon les paramètres d’imagerie sélectionnés, le temps d’acquisition sur chaque section peut varier de quelques secondes à quelques heures. Les paramètres d’imagerie critiques incluent la taille du champ de vision, la résolution et le temps de séjour. En supposant une résolution cible de 10 nm par pixel et un temps de séjour de 1 μs, l’imagerie d’un champ de 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm ou 500 μm x500 μm prend 4 secondes, 100 secondes ou 2 500 s à enregistrer. Nous pouvons multiplier ces temps d’imagerie par section par le nombre de sections pour estimer le temps nécessaire pour le travail d’imagerie complet. De longs temps d’imagerie par section peuvent être acceptables si le nombre de sections est faible ou si le temps d’outil du microscope n’est pas préoccupant.
Cependant, il est nécessaire de limiter le temps d’enregistrement à un travail de nuit ou à un travail de week-end dans la plupart des cas. Un aspect tout aussi critique de 3D EM qui devrait être pris en compte est la quantité et la structure des données d’image résultantes. L’enregistrement des champs d’imagerie susmentionnés dans 100 sections génère respectivement 400 Mo, 10 Go ou 250 Go de données d’image; les images de 500 μm x 500 μm posent le problème supplémentaire d’être plus grandes que 2 Go chacune. De nombreux logiciels utilisés pour l’évaluation des données ne peuvent pas ouvrir des images de cette taille.
Pour réduire le temps d’imagerie, il est important de choisir le temps d’arrêt des pixels pour répondre aux exigences de rapport signal/bruit pour l’évaluation ultérieure des données (par exemple, reconstruction, traçage) et de limiter les enregistrements à des retours sur investissement définis. L’extension AT du logiciel facilite l’acquisition d’images dans de petites zones dans les sections série. Le logiciel prend en charge les flux de travail manuels et automatiques et de nombreuses variantes semi-automatiques: les zones d’imagerie peuvent être positionnées manuellement et concentrées sur chaque section, ou l’utilisateur peut utiliser les fonctions de recherche automatique de section et d’alignement de position. Selon le niveau d’automatisation choisi et pris en charge par le type d’échantillon ou les objectifs d’imagerie, le temps nécessaire à la configuration de l’acquisition d’images dans des centaines de sections peut prendre une journée de travail entière (effectuée manuellement) ou seulement quelques minutes. En principe, la tomographie par réseau rend plus difficile que les autres méthodes 3D EM d’acquérir de petits retours sur investissement; le placement imprécis d’une région sur des sections consécutives doit être compensé par l’acquisition de zones plus grandes. Par exemple, si le retour sur investissement est de 20 μm x 20 μm et que la variabilité de position section à section des champs d’imagerie est de 10 μm, il faut acquérir des images de 40 μm x 40 μm afin de s’assurer que le retour sur investissement est entièrement capturé dans chaque image, sur chaque section. La variabilité de la position de l’image dans le monde réel varie de 100 μm à < 10 μm en fonction de la disponibilité ou de la qualité des fonctionnalités logicielles pour l’alignement de position ou de la patience de l’utilisateur. Avec ce logiciel, 10 μm peuvent être atteints sans trop d’intervention manuelle dans la plupart des échantillons.
Comme toute technique, l’AT a plusieurs points faibles qui peuvent influencer l’acquisition de données réussie, et beaucoup sont similaires à d’autres méthodes basées sur le sectionnement. Le manque de distribution homogène de la résine vide par rapport au tissu peut entraîner des réseaux incurvés ou brisés. Dans les cas extrêmes, les sections peuvent se détacher du support (Figure 6A). Une compression ou un étirement variable pendant le processus de coupe peut créer des plis qui peuvent perturber l’échantillon dans des régions variables sur les sections suivantes (Figure 6B). Des marques de couteau peuvent apparaître à la surface des sections collectées à l’aide d’un couteau endommagé (Figure 6C). Les différences dans les conditions de sectionnement peuvent induire une compression occasionnelle de la section et des différences d’épaisseur. Des particules de poussière ou de saleté peuvent atterrir sur une section et obscurcir partiellement la zone d’intérêt(Figure 6D). L’acquisition d’images peut échouer en raison de fonctions imparfaites d’auto-contraste, de mise au point automatique et d’auto-stigmate. Le positionnement des zones d’imagerie créées automatiquement peut être variable et peut ne pas capturer le retour sur investissement dans toutes les sections.
Plusieurs problèmes peuvent survenir au stade de la couture et de l’alignement. L’assemblage automatique des acquisitions de carreaux de mosaïque peut échouer, par exemple, en raison du grand espace vide à l’intérieur de l’échantillon. En raison d’un changement radical de forme en 3D, les piles d’images peuvent être difficiles à enregistrer. Des programmes spécialement développés (par exemple, IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB ou MAPS-AT) peuvent faciliter l’alignement semi-automatique32,38,39,40. Les sections les plus difficiles peuvent être alignées manuellement à l’aide d’un logiciel de retouche photo. Malheureusement, certains jeux de données peuvent être impossibles à aligner correctement.
Les grands échantillons sont difficiles pour les sections série TEM qui s’adaptent aux grilles; d’autre part, de nombreux projets ne justifient pas une acquisition automatique longue en utilisant FIB/SEM ou SBF-SEM. L’AT est une alternative simple à une section série fastidieuse TEM où la collecte et la manipulation de sections série sur une plaquette sont plus simples qu’avec les grilles de fentes. Plusieurs stratégies ont été développées pour faciliter la collecte des tableaux, et nous partageons notre méthode pour élargir la boîte à outils existante. Dans les cas où l’identification du retour sur investissement est difficile, AT-SEM offre un avantage fondamental, avec le criblage efficace des échantillons où une résolution à l’échelle de l’organite sur 50 à 500 sections est requise. Pour les volumes plus importants, les stratégies AT de collecte automatique peuvent être collectées efficacement si davantage de sections sont nécessaires. Les échantillons AT peuvent être ré-imagés plusieurs fois, ce qui facilite l’imagerie ciblée des zones haute résolution sur la base d’images de synthèse précédemment acquises. Nous pensons que l’analyse ciblée et le suréchantillonnage réduit par AT/SEM proposés ici diminuent les besoins en main-d’œuvre et en stockage de données. En fin de compte, les bibliothèques de sections peuvent être collectées et entretenues pour une réutilisation et une consultation ultérieures. Pour l’acquisition de volume, les approches FIB ou SBF-SEM offrent une excellente solution chaque fois que le retour sur investissement est facile à identifier sur la face du bloc ou si de grands volumes 3D sont nécessaires pour l’analyse. Cependant, les FIB/SBF-SEM sont moins efficaces lorsque l’image de pile haute résolution doit être collectée à partir d’un retour sur investissement défini de manière ciblée. Pour conclure, les méthodes proposées pour le criblage des échantillons AT et l’utilisation d’images de synthèse à moyenne résolution permettent de limiter l’acquisition d’images aux parties pertinentes du tableau de sections. La visée précise des régions d’imagerie accélère le délai de génération des données et simplifie l’évaluation des données.
En résumé, bien que le concept d’AT/SEM ne soit pas nouveau, son utilisation n’est toujours pas aussi répandue que ses mérites le suggèrent. Dans l’ensemble, il fournit une procédure complémentaire aux autres méthodes EM existantes. AT/SEM est compatible avec la plus large gamme de protocoles de préparation d’échantillons et de flux de travail d’imagerie et peut être effectué sur n’importe quel microscope FIB/SEM ou SBF-SEM comme technique d’accompagnement. Dans cet article, nous nous sommes concentrés sur l’AT pour enregistrer des données ultrastructurales à partir d’échantillons qui sont moins susceptibles d’être traités avec succès par d’autres méthodes. Nous espérons que la procédure décrite pour une collecte pratique des sections et des stratégies d’acquisition considérablement automatisées aidera dans les premières tentatives pour ceux qui n’ont jamais rencontré la méthode et aidera à la perfectionner pour ceux qui ont déjà une certaine expérience.

Malgré l’importance des techniques liées aux EM, l’effort requis pour les maîtriser limite l’ensemble du domaine à un petit nombre de spécialistes. Une difficulté importante est l’identification et la récupération d’une région d’intérêt (ROI) dans les échantillons conservés pour EM. L’apparence d’un même échantillon diffère considérablement lorsqu’il est analysé par microscopie optique et après traitement pour l’observation EM. Les changements pour les échantillons préparés chimiquement comprennent le retrait anisotrope de l’échantillon après les étapes de déshydratation (~ 10% dans chaque dimension) et la perte de fluorescence lors de l’utilisation de l’osmium dans le protocole de fixation et de coloration(Figure 1A). Pour la section ultramince, les échantillons sont incorporés dans des résines époxy ou acryliques en utilisant différentes stratégies(Figure 1B). Pour que cette préparation soit efficace, l’échantillon entier doit être fractionné en morceaux ne dépassant pas 1 mm x 1 mm. Pour répondre aux exigences des conditions d’observation standard de la microscopie électronique à transmission (TEM), cette minuscule partie de l’échantillon est en outre découpée en tranches de 50 à 150 nm d’épaisseur. Les images en niveaux de gris qui en résultent montrent l’organisation tissulaire et la structure des organites d’une fraction infime de l’échantillon entier avec plus de détails que toute autre technique de microscopie(Figure 1C). Un ensemble de données TEM typique fournit des informations 2D, théoriquement extrapolées pour comprendre les processus qui se produisent naturellement dans un espace 3D dans les cellules et les tissus. La figure 1D présente le défi de l’acquisition de volumes ultrastructuraux : si un cube de côté de 1 000 μm est sectionné à 50 nm d’épaisseur, 20 000 sections seront nécessaires pour couvrir tout le volume ; pour un cube latéral de 500 μm, il s’agira de 10 000 sections. Pour couvrir un volume de 50 μm x 50 μm x 50 μm, 1 000 sections « seulement » peuvent être nécessaires. Obtenir ce volume manuellement est pratiquement impossible et extrêmement difficile à effectuer avec l’automatisation. Si, en plus de la profondeur de l’échantillon, nous devons couvrir toute la surface de ces cubes hypothétiques, la couverture de 1 μm2 de surface à une résolution raisonnable devient un problème logistique grave(Figure 1E). Alors que pour les projets extraordinaires à grande échelle, tels que les approches connectomiques, le grand nombre de sections est crucial, pour la majorité des projets EM « banals », générer plus de sections nécessaires à l’observation présente un inconvénient important.
Il existe plusieurs méthodes pour acquérir des informations ultrastructurales 3D : la microscopie électronique à transmission à sectionnement en série (TEM), la tomographie TEM, la tomographie en réseau (AT), la microscopie électronique à balayage à balayage par imagerie de bloc de bloc série (SBF-SEM) et la microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM). Les principales différences entre ces méthodes sont la stratégie de sectionnement et si l’acquisition d’image est couplée à la génération de section1. Dans la section série TEM, les sections séquentielles sont collectées sur des grilles de fentes, les images TEM sont générées à partir de ces séquences et alignées2,3,4,5. En tomographie TEM, les séries d’inclinaison à partir de sections de 150 à 300 nm sur une grille et, lorsqu’elles sont couplées à une section en série, fournissent une très haute résolution, bien que relativement petits volumes6,7,8. L’approche AT utilise le sectionnement physique avec diverses manières manuelles et semi-automatiques de collecte de sections sur un support relativement grand, tel qu’un couvercle en verre, des plaquettes de silicium ou un ruban spécial. Pour l’acquisition d’images, le support est analysé en SEM, avec diverses stratégies d’acquisition d’images sont disponibles9,10,11,12,13,14,15 . Pour SBF-SEM, le sectionnement physique est réalisé à l’aide d’un mini-microtome avec un couteau diamanté serti directement à l’intérieur de la chambre SEM, l’image SEM étant générée à partir de la surface du bloc de résine16,17,18,19. Pour FIB-SEM, la source d’ions élimine les couches minces de l’échantillon, suivie de l’imagerie automatique de la surface exposée par le SEM20,21. La tomographie TEM et l’AT génèrent des sections physiques, qui peuvent être ré-imagées si nécessaire, tandis que FSBF-SEM et FIB-SEM éliminent la section après imagerie. Une combinaison récente de sections physiques imagées par un SEM multifaisceaux fournit une combinaison de méthodes qui résout le problème du « goulot d’étranglement » de la vitesse d’acquisition d’image22. Chacune de ces techniques a révolutionné la façon dont les données EM peuvent être obtenues et analysées, et chaque approche a ses impacts pratiques liés à une question de recherche donnée.
Compte tenu de la nature de la préparation et de l’échelle des dimensions ultrastructurales, il n’est pas facile de prédire où se trouve une structure cible spécifique dans le bloc d’échantillon (Figure1D, E). Une solution pour la localisation du retour sur investissement consiste à enregistrer les images de l’ensemble du bloc à la résolution souhaitée dès le début. Les structures d’intérêt peuvent être dans le volume de données acquises lorsqu’elles sont éloignées du microscope. Le temps d’acquisition et le traitement des données associés à cette stratégie sont problématiques. Il est souhaitable de réduire la quantité de données enregistrées, en particulier si les ROI sont beaucoup plus petits que le bloc tissulaire, c’est-à-dire si les objets d’intérêt sont des types spécifiques de cellules (et non des organes entiers). Différentes techniques corrélatives de microscopie optique et électronique (CLEM) peuvent être couronnées de succès lorsque la fluorescence est préservée et localisée avant ou après préparation dans le même échantillon23,24,25,26,27,28,29. Néanmoins, de nombreuses structures cellulaires sont reconnaissables même sans corrélation de fluorescence, uniquement sur la base de l’ultrastructure connue. Pour ces cas, nous pensons que la tomographie par réseau de criblage latéral fournit un compromis entre l’effort investi dans la localisation du retour sur investissement et la qualité de l’information ultrastructurale. En utilisant cette stratégie, un sous-ensemble de sections sur la plaquette est passé au crible à intervalles réguliers, qui peut être établi en fonction de la taille et de la nature du retour sur investissement. Une fois les retours sur investissement trouvés, l’acquisition de données est mise en place dans une série continue de sections commençant avant et se terminant après la section d’ancrage, recueillant les informations pertinentes de manière ciblée.
Nous présentons des protocoles pour AT qui simplifient et accélèrent l’acquisition de régions ou d’événements d’intérêt dans de nombreuses sections et produisent des volumes d’images mieux alignés. Le criblage latéral et l’acquisition en plusieurs étapes produisent des données à très haute résolution dans des régions ciblées avec précision. La procédure que nous décrivons répond à plusieurs défis de l’acquisition de données EM 3D, car elle prévoit: la compatibilité avec un large éventail d’échantillons sans modifier fondamentalement le flux de travail de préparation des échantillons; localisation ciblée pour le sectionnement et les acquisitions SEM; réduction du temps et des efforts lors de l’installation; imagerie de régions en plusieurs sections avec un meilleur alignement des volumes résultants; et une procédure d’assemblage et d’alignement lisse pour compiler différentes images dans une image en mosaïque cousue. Nous avons choisi de démontrer la force de notre méthode avec plusieurs échantillons de projets publiés et en cours. Nous croyons que cette approche peut faciliter considérablement la production et l’acquisition de données ciblées sur la GU, même pour les chercheurs ayant une expérience limitée en matière de GU.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AT sectioning knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUATS3530</td>
			<td>Diatome Jumbo knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td>Diatome trimming 20&#176; 
			Glass knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16015</td>
			<td>Resistance: 1-30 Ohms 
			Type P: (Boron) (1 primary flat) 
			Roughness: 2 nm 
			No SiO2 top coating 
			TTV: = &#60;20 &#181;m 
			Wafer is polished on one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer cleaving kit</td>
			<td>EMS</td>
			<td>7642</td>
			<td>EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Thermo Fischer Helios</td>
			<td>1072419</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maps 3 for SEM with Correlative Workflow &#38; Array Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1135932</td>
			<td>Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira x.y</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131599</td>
			<td>Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td>IMOD, MIB (See text for refferences)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy

La microscopie électronique est appliquée en biologie et en médecine pour l’imagerie des détails cellulaires et structurels à une résolution nanométrique. Historiquement, la microscopie électronique à transmission (TEM) a fourni un aperçu de l’ultrastructure cellulaire, mais au cours de la dernière décennie, le développement des microscopes électroniques à balayage (MEB) modernes a changé la façon de regarder à l’intérieur des cellules. Même si la résolution de la TEM est supérieure lorsque des détails structurels au niveau de la protéine sont nécessaires, la résolution SEM est suffisante pour la majorité des questions liées à la biologie cellulaire au niveau de l’organite. Les progrès technologiques ont permis des solutions d’acquisition automatique de volume telles que l’imagerie série de la face de bloc (SBF-SEM) et le SEM à faisceau d’ions focalisé (FIB-SEM). Néanmoins, à ce jour, ces méthodes restent inefficaces lorsque l’identification et la navigation vers les zones d’intérêt sont cruciales. Sans les moyens de localisation précise des zones cibles avant l’imagerie, les opérateurs doivent acquérir beaucoup plus de données qu’ils n’en ont besoin (en SBF-SEM), ou, pire encore, préparer de nombreuses grilles et les imager toutes (en TEM). Nous proposons la stratégie de « criblage latéral » à l’aide de la tomographie par réseau en SEM, qui facilite la localisation des zones d’intérêt, suivie d’une imagerie automatisée de la fraction pertinente du volume total de l’échantillon. Les échantillons de tomographie en réseau sont conservés pendant l’imagerie et peuvent être organisés en bibliothèques de sections prêtes pour l’imagerie répétée. Plusieurs exemples sont montrés dans lesquels le criblage latéral nous permet d’analyser des détails structurels incroyablement difficiles d’accès avec toute autre méthode.

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Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Nous décrivons la préparation de rubans de sections série et leur collecte sur un grand support de transfert pour une utilisation en tant qu’échantillons de tomographie en réseau, ainsi que des procédures d’imagerie automatisées dans un microscope électronique à balayage. Le protocole permet le dépistage, la récupération et l’imagerie ciblée d’événements locaux rares, ainsi que l’acquisition de grands volumes de données.

Flux de travail de tomographie en réseau pour l’acquisition ciblée d’informations de volume à l’aide de la microscopie électronique à balayage

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

L’analyse par microscopie électronique est souvent complexe. Nous pensons que notre protocole facilite le traitement et l’acquisition des données EM à partir de la grande surface de l’échantillon et du volume intermédiaire. Notre protocole aide à trouver des structures cibles dans des sections série.L’enregistrement des données est limité à ce qui est nécessaire. Par rapport à l’acquisition de données dans des blocs de tissus entiers, le temps d’enregistrement est réduit et l’analyse des données plus facile. Compte tenu de la facilité globale de l’approche, nous pensons qu’elle peut être utilisée non seulement pour répondre à des questions scientifiques, mais aussi comme outil de diagnostic.Pour générer un réseau à analyser, serrez d’abord l’échantillon sur un support ultramicrotome et utilisez une lame de rasoir pour couper grossièrement la résine autour de l’échantillon. Utilisez un outil de coupe en diamant pour couper finement l’échantillon et utilisez des couteaux de coupe d’inclinaison de 20 ou 90 degrés pour vous assurer que les surfaces supérieure et inférieure du bloc sont parallèles au tranchant du couteau. Mélangez le xylène et la colle dans une proportion de 3:1 et utilisez un cil attaché à un cure-dent pour appliquer le mélange sur les bords supérieur et inférieur du bloc coupé.Pendant que le mélange sèche, utilisez un outil de clivage de plaquette pour couper un morceau de plaquette à la taille appropriée pour l’analyse. Nettoyez la plaquette à l’eau distillée pour rincer les débris et nettoyez la surface avec du plasma une fois la plaquette sèche. Pour préparer un couteau de tomographie à matrice, utilisez du ruban adhésif mousseux pour attacher une aiguille au fond d’un couteau jumbo histo et placez le couteau dans le support ultra microtome à zéro degré.Ajustez le bord du couteau parallèlement à la surface du bloc et amenez le bloc coupé sur le bord du couteau dans une position prête pour le sectionnement. Placez la plaquette propre dans le bassin du couteau et remplissez le bassin avec de l’eau au même niveau que le bord du couteau, puis laissez le bord en diamant du couteau s’humidifier correctement, en utilisant la seringue attachée pour ajouter ou retirer de l’eau si nécessaire. Pour la section de réseau, réglez le microtome sur une plage de coupe de 50 à 100 nanomètres et une vitesse de coupe de 6 à 1 millimètre par seconde, et commencez à sectionner pour obtenir un ruban assez long pour couvrir un volume Z ciblé.Selon la taille du bloc, l’homogénéité du tissu et le type de résine, le ruban sera approximativement droit. Utilisez une pointe de cil propre et non collante pour détacher les rubans du bord du couteau. Utilisez les cils pour déplacer doucement le ruban vers le centre du support.Du chloroforme ou un stylo chauffant peut être utilisé pour étirer la section si nécessaire. Après l’étirement, rétractez la seringue pour commencer à drainer l’eau. Pour des rubans plus délicats ou une rétraction plus lente de l’eau, détachez la seringue du tuyau pour laisser couler l’eau.Lorsque le niveau d’eau atteint le niveau de la plaquette, poussez doucement le ruban au centre du bassin et continuez à s’écouler jusqu’à ce que toute l’eau restante soit complètement retirée du bassin. Laissez sécher la plaquette dans un environnement propre. Le séchage prend environ 30 minutes.Lorsque l’échantillon est complètement séché, transférez le réseau dans une boîte bien fermée pour le protéger de la contamination par la saleté. Et placez la boîte dans un four à 60 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Pour acquérir une carte d’ensemble des images SEM qui révèle l’emplacement des sections sur la plaquette, utilisez la caméra optique intégrée pour acquérir une image SEM qui couvre un ruban de sections.Pour créer une mosaïque, cliquez et faites glisser l’image de la caméra de l’échantillon et démarrez l’acquisition automatique. Acquérir des vues d’ensemble à une résolution plus élevée pour trouver des structures cibles. Si seules quelques sections doivent être imagées, utilisez une visionneuse zoomable pour afficher les images acquises à leur emplacement d’origine.Une fois qu’une section qui doit être imagée en haute résolution a été identifiée, cliquez et faites glisser pour créer une région d’imagerie, puis sélectionnez Paramètres d’imagerie haute résolution et stockez les paramètres dans un modèle Pour rechercher des événements rares particulièrement petits ou difficiles à détecter, utilisez les paramètres d’imagerie haute résolution sur chaque 10e section ou sur une section par ruban pour créer manuellement une région d’imagerie et acquérir les images. Ensuite, passez en revue les images et marquez les sections qui contiennent la région d’intérêt. Pour acquérir plus de 10 sections consécutives, utilisez l’outil de recherche de sections pour localiser automatiquement toutes les sections.Si les images d’aperçu ne montrent pas de régions d’intérêt claires, acquérez des images de plus haute résolution des sections et utilisez la fonction d’aperçu des sections pour créer et acquérir automatiquement les images. Pour déterminer les paramètres d’imagerie optimaux, activez l’imagerie en direct dans le logiciel de contrôle du microscope et accédez à une région d’intérêt, puis ajustez les paramètres d’imagerie jusqu’à ce que les images montrent des régions d’intérêt claires, mais sans acquisition d’image excessivement longue, conformément aux directives du fabricant. Pour optimiser le positionnement des régions d’imagerie sur des sections consécutives, effectuez un zoom sur l’image d’intérêt et cliquez sur Affiner la position de départ pour augmenter la précision des emplacements de section enregistrés.Pour définir une région d’imagerie, cliquez et faites glisser sur n’importe quelle section tout en maintenant la touche Alt enfoncée et sélectionnez Créer un tableau de jeux de tuiles dans le menu contextuel contextuel. Le logiciel créera des régions d’imagerie au même emplacement relatif dans toutes les sections qui ont été trouvées ou précédemment marquées. Configurez ensuite le nombre de pixels, la taille des pixels, la disposition des mosaïques et le temps de séjour des pixels dans chaque série d’images, selon vos besoins.Pour configurer la fonction automatique, créez une série d’images distincte pour les fonctions automatiques, comme illustré, et déplacez la série d’images vers une position sur la section qui contient des structures à contraste élevé. Définissez la série d’images sur 1024 x 884 pixels et sélectionnez une taille de pixel correspondant à la résolution la plus élevée utilisée dans la série d’images. Dans la liste des fonctions automatiques, cochez Mise au point automatique et Stigmate automatique.Sélectionnez Bisection dans les contrôles de séquence d’acquisition et confirmez que l’image de la fonction automatique est le premier élément de la liste, puis cliquez sur Acquérir tout pour démarrer l’acquisition d’image. Lorsque toutes les séries d’imagerie ont été créées et configurées, les séries sont répertoriées dans une file d’attente de tâches. L’acquisition basse résolution peut être effectuée manuellement ou automatiquement directement sur des parties sélectionnées de la section ou une section entière à l’aide d’une imagerie simple ou mosaïque, suivie d’une couture.Les images de la zone sélectionnée peuvent ensuite être acquises à l’aide de paramètres à haute résolution pour visualiser les mitochondries, les noyaux et les microvillosités, par exemple, une fois l’acquisition automatique des cartes mosaïques résolues sélectionnée, plusieurs régions d’intérêt peuvent être recadrées ou utilisées pour définir des zones d’imagerie locales supplémentaires dans les régions. Bien que différents types de cellules spécialisées dans l’intestin de la drosophile soient distribués de manière aléatoire, ils peuvent être distingués visuellement après avoir examiné les images à l’aide de paramètres à haute résolution, soit à partir de sections individuelles, soit sous la forme d’une collection d’images en série. Après l’alignement, les piles peuvent être rendues à l’aide de différentes solutions logicielles.L’analyse par tomographie en réseau permet de générer de nombreuses sections séquentielles sur la plaquette unique et de les filtrer à l’aide de paramètres à basse résolution pour localiser les zones d’intérêt générales. Ces zones peuvent être ciblées pour une analyse plus approfondie à l’aide de paramètres d’acquisition avancés. Par exemple, les divisions mytotiques dans le notum ne sont pas faciles à localiser au niveau ultra-structurel, car les cellules sont relativement grandes par rapport à la zone d’abscission.En utilisant cette méthode, cependant, les images de vue d’ensemble automatiques à moyenne résolution des sauts de 20 à 40 sections peuvent être utilisées pour localiser les cellules en division. La procédure de tomographie en réseau fournit une analyse plus simple des données de microscopie électronique. Nous encourageons les téléspectateurs à investir dans la maîtrise de la régénération et à se familiariser avec le flux de travail lié aux cartes D’après notre expérience, peu de sujets de recherche nécessitent l’analyse ultra-structurelle d’animaux entiers ou d’organes entiers.Notre méthode aide à localiser rapidement les cellules et leurs partenaires d’interaction dans les tissus.

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Biology

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