Name: array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 47 s
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Wir danken den Mitgliedern der EM-Einrichtung der Universität Lausanne für ihre Unterstützung bei dieser Entwicklung verschiedener Schritte des AT-Verfahrens. Wir danken Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O'Brien und Lindsay Lewellyn für die Gespräche während der Vorbereitung des Manuskripts und der kritischen Lesung. Wir möchten den Gruppen danken, die die Proben zur Demonstration der verschiedenen Szenarien beigetragen haben: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat und Fanny Langlet.

ANMERKUNG: Probenvorbereitungsmethoden werden an anderer Stelle beschrieben14,30,31, und werden in dieser Veröffentlichung nicht behandelt. Kurz gesagt, die gezeigten Beispiele wurden chemisch mit Glutaraldehyd fixiert, mit 1%OsO4postfixiert und dann mit 1% wässrigem Uranylacetat behandelt, bevor sie in das Einbettharz eingebettet wurden. Alternativ können Proben durch Hochdruckgefrieren hergestellt, mit 0,1% Uranylacetat in Aceton substituiert und in Acrylharz eingebettet werden. Probenblöcke wurden mit einer flachen Einbettungsmethode hergestellt, die eine klare Sicht auf die Probe ermöglicht und ihre Orientierung für den Schnitt erleichtert (Abbildung 1B).
1. Array-Generierungsverfahren
<ol><li>Eingebettete Probenorientierung und Trimmung<ol>
<li>Identifizieren und markieren Sie mit dem Fernglas/ Mikroskop den ROI auf der eingebetteten Blockoberfläche, indem Sie die Blockoberfläche mit einer Rasierklinge leicht zerkratzen. Dies hilft, die Probe im Ultramikrotom zu orientieren und reduziert die Schnittfläche.</li>
		<li>Klemmen Sie die Probe auf den Ultramikrotomhalter (Abbildung 2A).</li>
		<li>Schneiden Sie das Harz um die Probe herum, zuerst mit der Rasierklinge (Grobbeschnitt) und fahren Sie mit dem Diamantschneidwerkzeug fort (Feinbesatz; Abbildung 2A). Verwenden Sie Messer mit 20° oder 90° Kantenneigung, um sicherzustellen, dass die Ober- und Unterseite des Blocks parallel zur Schneide des Messers verlaufen. HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für das serielle Schneiden und Erfassen von geraden Farbbändern.</li>
		<li>Mischen Sie Xylol und Kleber im Verhältnis 3:1. Tragen Sie diese Mischung mit einer Wimper, die an einem Zahnstocher befestigt ist, auf die oberen und unteren Ränder des beschnittenen Blocks auf. Lassen Sie es gründlich trocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Array-Montageunterstützung A (d. h. Siliziumwafer) vor.<ol>
<li>Schneiden Sie das Waferstück mit einem Wafer-Spaltwerkzeug (EMS) und passen Sie seine Größe an das Projektziel an. 2 cm x 4 cm ist praktisch für licht- und elektronenmikroskopische Beobachtungen.</li>
		<li>Reinigen Sie den Wafer in destilliertem Wasser, um die Ablagerungen zu entfernen.</li>
		<li>Glimmentladung/Plasma reinigen die Oberfläche mit Standardgeräten. Die genauen Parameter hängen von der verwendeten Maschine ab. Beginnen Sie mit den Parametern für die Netzentladung und passen Sie die Zeit empirisch an. Dieser Schritt ist entscheidend für eine gute Verteilung der Abschnitte auf dem Träger während der Trocknung der Abschnitte und sollte nicht weggelassen werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereiten der Arrays-Montagehalterung B (z. B. Glasabdeckungen)<ol>
<li>Wenn Sie Multiplex-Immunmarkierungsexperimente planen, übertragen Sie die Proben auf einen Deckglas, um das Fluoreszenzsignal besser zu erkennen. Um die Deckglasklebigkeit zu verbessern, verwenden Sie ein detailliertes Gelatine-Beschichtungsverfahren, das zuvor beschrieben wurde9.</li>
		<li>Erhöhen Sie die Leitfähigkeit, indem Sie die Objektträger mit dem Indium-Zinn-Oxid (ITO) oder Gold durch Verdampfung beschichten. Bewahren Sie die vorbereiteten Deckgläser in einer sauberen Umgebung auf. Glühentladung der Proben wie in 1.2.3 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Teilung der Stichprobe
<ol><li>AT Messervorbereitung HINWEIS: Um die Arrays zu generieren, verwenden Sie ein modifiziertes Messer (ATS), das die Erfassung langer Bänder erleichtern soll. Histo-Jumbo-Messer oder ähnliche Messer, die für die Erzeugung der Profile auf großen Stützen konzipiert sind, können auch für AT-Schnitte dienen.<ol>
<li>Befestigen Sie die Nadel mit dem schaumigen Klebeband an der Unterseite des Messers und stechen Sie es durch (Abbildung 2B). Legen Sie das ATS-Messer bei 0° in den Ultramikrotomhalter. Stellen Sie die Schneide des Messers parallel zur Blockoberfläche mit dem Standardverfahren ein.</li>
		<li>Bringen Sie den beschnittenen Block an den Rand des Messers in einer Position, die zum Schneiden bereit ist.</li>
		<li>Legen Sie die Waffel/den Deckglas in das Messerbecken und füllen Sie es mit Wasser auf die gleiche Höhe wie die Messerkante. Lassen Sie die Diamantkante des Messers richtig befeuchten und ziehen Sie gegebenenfalls mit der angebrachten Spritze Wasser ab (Abbildung 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Array-Schnitt und -Übertragung<ol>
<li>Stellen Sie das Mikrotom auf die gewünschten Schnittparameter ein. Beim ATS-Messer sind der Bereich von 50-100 nm und eine Schnittgeschwindigkeit von 0,6-1 mm/s ratsam. Beginnen Sie mit dem Schneiden (Abbildung 2Di).</li>
		<li>Rufen Sie ein Band mit der Länge ab, das ein Ziel-Z-Volume abdeckt, und beenden Sie die Sammlung. Abhängig von der Blockgröße, der Homogenität des Gewebes und der Art des Harzes ist das Band relativ gerade (Abbildung 2D-ii). Viele Proben erzeugen keine geraden Bänder, trotz des investierten Aufwands und der Art des Verwendeten Messers.</li>
		<li>Machen Sie je nach Endziel ein langes oder mehrere kurze Bänder nebeneinander ausgerichtet. Eine Stütze von 2 cm x 4 cm kann bequem 100 bis 1.000 Abschnitte aufnehmen. Die Anordnung des Bandes auf der Stützstufe ist ein Schritt, der Geschicklichkeit und ruhige Hände erfordert. Die Lernkurve für diese Fähigkeit wird jedoch schnell erworben.</li>
		<li>Lösen Sie das Band von der Messerkante mit einer sauberen, nicht klebrigen Wimpernspitze, die auf den Zahnstocher geklebt ist (Abbildung 2Diii).</li>
		<li>Bewegen Sie das Band mit den Wimpern vorsichtig über die Mitte des Trägermediums. Verwenden Sie an dieser Stelle Chloroform oder einen Heizstift zum Dehnen der Abschnitte, falls erforderlich. Denken Sie jedoch daran, dass diese Manipulation zu Bandbruch und Verformung führen kann.</li>
		<li>Beginnen Sie mit dem Ablassen des Wassers, indem Sie an der Spritze ziehen. Für empfindlichere Bänder oder ein langsameres Zurückziehen des Wassers lassen Sie das Wasser tropfen, indem Sie die Spritze vom Schlauch lösen. Wenn der Wasserstand auf das Waferniveau sinkt, steuern Sie das Band und positionieren Sie es bei Bedarf neu, indem Sie das Band vorsichtig in die Mitte drücken. Nachdem Sie die Bänder auf der Waferoberfläche abgesetzt haben, lassen Sie den Abfluss so lange fortsetzen, bis das restliche Wasser vollständig aus dem Becken zurückgezogen ist. HINWEIS: Wenn Sie das ATS-Messer mit Bodenwasserrückzug nicht verwenden, reduzieren Sie das Wasser vorsichtig von den Seiten des ATS-Messers, um keine Turbulenzen zu induzieren.</li>
		<li>Lassen Sie die Abschnitte auf der Stütze im Bad, um sie vollständig trocknen zu lassen. Abhängig von der Hydrophobie des Trägers und der Umgebungsfeuchtigkeit verdunstet Wasser mit einer unterschiedlichen Geschwindigkeit (Abbildung 2Div). Es ist wichtig, die Probe langsam trocknen zu lassen, um alle Falten auf der Probe zu verringern oder ganz zu vermeiden.</li>
		<li>Geben Sie die trockene Probe zum Schutz vor Schmutzverschmutzung in eine fest verschlossene Box und stellen Sie sie für mindestens 30 min in einen 60 °C großen Ofen. Bei Bedarf Gegenschnitte mit Schwermetallen, um den Gesamtkontrast zu verstärken.</li>
		<li>Reinigen Sie das Messer am Ende des Verfahrens vorsichtig nach den Anweisungen des Herstellers HINWEIS: Die Übertragung mehrerer oder serieller Abschnitte auf einem Wafer (Abbildung 2E) im Vergleich zur Übertragung auf einem Slot-Grid (Abbildung 2F) verändert die EM-Vorbereitungserfahrung vollständig. Das ununterbrochene Schneiden und Sammeln der Abschnitte auf einem einzigen Träger reduziert die Menge an Schnitt- und Abschnittssammlungsfehlern, die bei seriellen Abschnitten häufig auftreten. Das Äquivalent von 100 Abschnitten von 1000 μm x 500 μm, die auf einem Wafer gesammelt werden, entspricht 33 Slot-Grids (Abbildung 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Stichprobenbeobachtung
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Workflow-Schritte beschrieben, die mit einer handelsüblichen Software implementiert wurden (siehe Tabelle der Materialien). Jede Bilderfassungssoftware auf jedem REM, das mit den richtigen Detektoren ausgestattet ist, kann verwendet werden, jedoch unterscheiden sich die spezifischen Benutzeraktionen und sind oft manueller.
<ol><li>Erfassen Sie eine Übersichtskarte der REM-Bilder, die die Abschnittspositionen auf dem Wafer zeigt. Ein integriertes optisches Kamerabild hilft bei der Definition eines REM-Bildmosaiks, das ein Band von Abschnitten oder allen Abschnitten abdeckt. Erstellen Sie das Mosaik per Klick-Schlepp mit der Maus rechts auf das Kamerabild der Probe und starten Sie die automatische Erfassung. HINWEIS: Sehr grobe Bildgebungseinstellungen, d.h. 1-2 μm Pixelgröße und 1 μs Verweilzeit reichen aus. Dieser Prozess wird in Supplementary Material (Seiten 2-7) veranschaulicht.</li>
	<li>Suchen Sie Abschnitte mit der automatischen Erkennungsfunktion des Abschnittsfinders oder manuell. Schnittpositionen und Umrisse werden mit dieser Software basierend auf dem Bildabgleich automatisch abgerufen. Zur Veranschaulichung dieses Prozesses siehe Ergänzendes Material (Seiten 8 - 15).</li>
	<li>Falls die Übersichtsbilder ROIs nicht deutlich zeigen, erfassen Sie Bilder von Abschnitten mit höherer Auflösung. Verwenden Sie die Funktion Abschnittsvorschau, um Bilder automatisch zu erstellen und zu erfassen. Dieser Prozess wird in Supplementary Material,Seiten 16-18, veranschaulicht. Die Imaging-Einstellungen müssen entsprechend der Art und Größe des ROI ausgewählt werden, nach dem der Benutzer sucht.<ol>
<li>Um optimale Einstellungen zu finden, aktivieren Sie das Live Imaging in der Mikroskopsteuerungssoftware und navigieren Sie zu einem ROI. Ändern Sie die Bildgebungseinstellungen, bis die Bilder ROIs deutlich zeigen, aber die Bildaufnahme ist nicht übermäßig lang.</li>
	</ol></li>
	<li>Definieren von Bildgebungsbereichen HINWEIS: Es werden verschiedene Strategien vorgeschlagen.<ol>
<li>Wenn nur wenige Abschnitte abgebildet werden müssen, verwenden Sie die Bilder der bisher erstellten Abschnitte für die Navigation zu den relevanten Abschnitten und verwenden Sie den zoombaren Viewer, der alle aufgenommenen Bilder an ihren ursprünglichen relativen Positionen anzeigt, um alle Abschnitte anzuzeigen. Sobald ein Abschnitt gefunden wurde, der mit hoher Auflösung abgebildet werden soll, erstellen Sie einen Bildbereich mit Click-Drag. Wählen Sie hochauflösende Imaging-Einstellungen und speichern Sie die Einstellungen in einer Vorlage. Verwenden Sie diese Vorlage für weitere Abschnitte wieder.</li>
		<li>Um besonders kleine oder schwer zu erkennende seltene Ereignisse zu finden, verwenden Sie den Lateral Screening-Ansatz. Erstellen Sie manuell einen Bildbereich mit hochauflösenden Bildgebungseinstellungen für jeden zehnten Abschnitt oder für einen Abschnitt pro Menüband und erfassen Sie die Bilder. Überprüfen Sie die Bilder und markieren Sie Abschnitte, die den ROI in der Software enthalten, oder machen Sie sich eine Notiz.<ol>
<li>Ausgehend von Abschnitten, die den ROI enthalten, navigieren Sie vorwärts und rückwärts durch den Abschnittssatz und erstellen Sie hochauflösende Bildgebungsbereiche an denselben relativen Positionen, solange die Struktur im Abschnitt noch sichtbar ist. Dies kann manuell oder mithilfe des in den nächsten Schritten beschriebenen Verfahrens erfolgen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Erfassen Sie Bilder in mehr als zehn aufeinanderfolgenden Abschnitten. Klicken Sie nach dem Zoomen des Bildes auf Positionsverfeinerung starten, um die Genauigkeit der registrierten Abschnittspositionen wie im Handbuch beschrieben zu erhöhen. Dadurch wird die Positionsvariabilität von Bildserien verringert. Das Verfahren wird auf den Seiten 19-21 des Ergänzenden Materials veranschaulicht und erläutert.</li>
		<li>Ziehen Sie mit einem Klick auf einen beliebigen Abschnitt, um einen Bildbereich zu definieren, während Sie die Alt-Taste gedrückt halten, und wählen Sie Im Kontextmenü, das geöffnet wird, wenn die Maustaste losgelassen wird, die Option Kachelsatz-Array erstellen aus. Die Software erstellt dann Bildbereiche an der gleichen relativen Position in allen Abschnitten, die zuvor gefunden oder markiert wurden. Es ist möglich, die Bildgebung mit dem Schieberegler Section Span auf einen bestimmten Bereich von Abschnitten zu beschränken. HINWEIS: Dieser Vorgang kann mit einer beliebigen Anzahl von Bildbereichen wiederholt werden und ermöglicht daher die Aufnahme vieler kleiner hochauflösender Bilder, anstatt ein einzelnes größeres Bild auf jedem Abschnitt aufzunehmen.</li>
		<li>Richten Sie nach der Erstellung in jeder Bildserie nach Bedarf Pixelanzahl, Pixelgröße, Kachellayout, Pixelverweildauer usw. ein. Sobald Imaging-Serien erstellt und eingerichtet sind, werden sie alle in einem Job-Cue aufgelistet.</li>
	</ol></li>
	<li>Automatische Funktionen konfigurieren und Bildaufnahme starten<ol>
<li>Erstellen Sie eine separate Bildserie für automatische Funktionen mit der gleichen Methode wie im vorherigen Schritt beschrieben. Verschieben Sie die Bildserie an eine Position in dem Abschnitt, der kontrastreiche Strukturen enthält.</li>
		<li>Stellen Sie die Bildserie auf 1024 x 884 Pixel ein und wählen Sie eine Pixelgröße, die der höchsten Auflösung entspricht, die in der in den vorherigen Schritten eingerichteten Bildserie verwendet wird. Aktivieren Sie in der Liste der Autofunktionen Autofokus und Auto Stigmator.</li>
		<li>Wählen Sie in den Steuerelementen für die Erfassungssequenz die Option Nach Abschnitt aus, und stellen Sie sicher, dass das Bild für automatische Funktionen das erste Element in der Liste ist. Starten Sie die Bilderfassung, indem Sie neben dem Auftragshinweis auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Diese Verfahren sind in Ergänzendes Material,Seiten 22-23, dargestellt. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, sich manuell auf jeden Abschnitt zu konzentrieren. Wenn das Mikroskop während der Aufnahmesitzung zu einem neuen Abschnitt vorrückt, werden die Autofunktionen ausgeführt, bevor alle anderen Bilder in diesem Abschnitt aufgezeichnet werden.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Datenausrichtung und -analyse
<ol><li>Datenexport<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass die Daten in .tif Format gespeichert werden, damit keine dedizierte Exportfunktion erforderlich ist. Sortieren Sie Daten in eine Ordnerstruktur, die direkt den Ebenen und Elementen im Ebenenbaum entspricht.</li>
		<li>Sobald Bildmosaike aufgenommen wurden, verwenden Sie die StitchAll-Funktion, um alle Kacheln automatisch zu stitchen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stapelausrichtung und Zuschneiden in Fidschi ANMERKUNG. Viele Softwarepakete (kostenlos und kommerziell) können verwendet werden, um mit Array Tomography-Daten zu arbeiten. Die folgenden Schritte werden mit dem Open-Source-Programm Fiji32 gezeigt, da es weit verbreitet ist und alle erforderlichen Funktionen enthält.<ol>
<li>Importieren Sie einen Stapel von Bildern (oder zusammengefügten Bildern) als virtuellen Stapel nach Fidschi.</li>
		<li>Wenn Kontrast/Helligkeit normalisiert werden muss, wählen Sie Erweiterter Kontrast... aus dem Menü Prozess. Legen Sie Gesättigte Pixel auf 0,1 oder weniger fest und aktivieren Sie Alle Slices verarbeiten.</li>
		<li>Wählen Sie im Menü Plugins die Option Registrierung | Linear Stack Alignment mit SIFT.</li>
		<li>Wählen Sie im Dropdown-Menü Erwartete Transformation die Option Starr oder Affin aus. Andernfalls behalten Sie die Standardeinstellungen bei. Starten Sie die Ausrichtung, indem Sie auf OKklicken. HINWEIS: Das Laden der Daten als Virtual Stack ermöglicht es Fidschi, Stacks beliebiger Größe zu verarbeiten. Die Ausgabe der Ausrichtung wird im RAM erstellt. Dies kann jedoch die maximale Größe der Stapel begrenzen, die verarbeitet werden können. Verwenden Sie in diesem Fall Register Virtual Stack Slices, bei dem es sich um eine Ordner-zu-Ordner-Implementierung desselben Registrierungsalgorithmus handelt. Sobald die Registrierung abgeschlossen ist, laden Sie die Ausgabedaten als virtuellen Stack.</li>
		<li>Schneiden Sie den Bildstapel zu, indem Sie auf Zuschneiden klicken, sodass er nur den ROI enthält.</li>
		<li>Speichern Sie den Stapel als einzelnes .tif Bild oder eine Reihe von .tif Bildern. HINWEIS: Kritische Schritte der Array-Tomographie sind in Abbildung 3 dargestellt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Luckner, M., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+light+microscopy+to+analytical+scanning+electron+microscopy+(SEM)+and+focused+ion+beam+(FIB)/SEM+in+biology:+Fixed+coordinates,+flat+embedding,+absolute+references.">From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+electron+microscopy+volume+of+the+brain+of+adult+Drosophila+melanogaster.">A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster.</a> Cell. 174 (3), 730-743 (2018).</li><li>Mulcahy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+volume+electron+microscopy+of+the+caenorhabditis+elegans+nervous+system.">A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system.</a> Frontiers in Neural Circuits. 12, 94 (2018).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+molecules+and+cells.">Electron tomography of molecules and cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).</li><li>Hoog, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+interphase+microtubules+in+fission+yeast+analyzed+by+electron+tomography.">Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography.</a> Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).</li><li>Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+studies+of+eukaryotic+cells+by+cryo-electron+tomography.">Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography.</a> Cells. 8 (1), 57 (2019).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+(S3EM)+on+silicon+wafers+for+ultra-structural+volume+imaging+of+cells+and+tissues.">Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues.</a> PLoS One. 7 (4), 35172 (2012).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).</li><li>Kubota, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+nanotube+tape+for+serial-section+electron+microscopy+of+brain+ultrastructure.">A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure.</a> Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).</li><li>Wacker, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+Hierarchical+Imaging+of+Serial+Sections+for+Finding+Specific+Cellular+Targets+within+Large+Volumes.">Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57059 (2018).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Templier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MagC,+magnetic+collection+of+ultrathin+sections+for+volumetric+correlative+light+and+electron+microscopy.">MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy.</a> Elife. 8, 45696 (2019).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).</li><li>Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+EM-based+reconstruction+of+the+interglomerular+projectome+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).</li><li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology:+Applications+and+technology.">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).</li><li>Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIB-SEM+tomography+in+biology.">FIB-SEM tomography in biology.</a> Methods in Molecular Biology. 1117, 541-558 (2014).</li><li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging.">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, 25916 (2017).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+cluster+ion+beam+SEM+for+imaging+of+large+tissue+samples+with+10+nm+isotropic+resolution.">Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution.</a> Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).</li><li>Maco, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+in+vivo+2+photon+and+focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+of+cortical+neurons.">Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons.</a> PLoS One. 8 (2), 57405 (2013).</li><li>Russell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+microscopes:+3D+correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+of+complex+biological+structures.">Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures.</a> Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).</li><li>Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+for+observing+the+three-dimensional+ultrastructure+of+membranous+cell+organelles+in+relation+to+their+molecular+components.">Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).</li><li>Peddie, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+and+integrated+light+and+electron+microscopy+of+in-resin+GFP+fluorescence,+used+to+localise+diacylglycerol+in+mammalian+cells.">Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).</li><li>Markert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+subcellular+localization+with+superresolution+array+tomography+on+ultrathin+sections+of+various+species.">3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species.</a> Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).</li><li>Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+precise+and+rapid+mapping+protocol+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+small+invertebrate+organisms.">A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms.</a> Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).</li><li>Kolotuev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+correlative+anatomy+of+invertebrate+model+organisms+increases+efficiency+of+TEM+data+production.">Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).</li><li>Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+acetylcholine+signaling+through+a+muscarinic+receptor+regulates+cell+migration.">Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster.">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li><li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis.">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+asymmetric+stem+cell+division.">Mechanisms of asymmetric stem cell division.</a> Cell. 132 (4), 583-597 (2008).</li><li>Daniel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+septate+junctions+assembly+and+completion+of+cytokinesis+in+proliferative+epithelial+tissues.">Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues.</a> Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).</li><li>Pasquettaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peculiar+protrusions+along+tanycyte+processes+face+diverse+neural+and+non-neural+cell+types+in+the+hypothalamic+parenchyma.">Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2020).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+image+browser:+A+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets.">Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li></ol>

Der Autor Tilman Franke ist ein Mitarbeiter von Thermo Fisher, der Elektronenmikroskope und Pilotprogramme herstellt, die in dem Artikel verwendet werden.

Die Elektronenmikroskopie gibt Einblick in die Ultrastruktur der Zellen und Organismen, für die es oft wünschenswert ist, interessierende Strukturen in ihrem 3-dimensionalen Kontext abzubilden. Trotz zahlreicher EM-Taktiken für die ultrastrukturelle Analyse gibt es immer noch keine "Goldstandard"-Lösung. Der Hauptgrund ist die große Vielfalt an Proben, viele biologische Fragestellungen, die häufig einen maßgeschneiderten Ansatz erfordern. Der vorgeschlagene AT-Workflow wurde entwickelt, um den Zeitaufwand für die Probenverarbeitung, Datenerfassung, -auswertung und -speicherung zu minimieren. Darüber hinaus bietet das modifizierte Messer ein hilfreiches Werkzeug, um die Array-Erfassung zu vereinfachen. Die kompakte Anordnung der Schnitte auf Wafern ist sowohl für die Beobachtung als auch für die anschließende Lagerung der Proben komfortabel. Diese Anordnung ermöglicht ein "laterales Screening" von Proben, indem horizontal von Band zu Band bewegt wird und jeweils nur ein Abschnitt gescannt wird, wodurch der Zeitaufwand für die Lokalisierung eines ROI erheblich reduziert wird. Vorgeschlagene Datenerfassungsszenarien erleichtern die gezielte Ausrichtung auf kleine und zufällig verteilte Bereiche. Einmal gefunden, beschränkt AT/REM die hochauflösende Bildgebung genau auf das gewünschte Volumen, egal ob manuell oder mit Hilfe der Automatikfunktion. AT für begrenzte Volumina kann manuell ausgefüllt werden, wobei der Bediener durch die Probe navigiert und bildgebende Bereiche nacheinander definiert. Das automatisierte Modul der Software bietet eine flexible Bilderfassungsstrategie für die Abbildung kleiner Flächen auf großen Schnitten. Die Automatisierung in dieser Software ermöglicht die Aufnahme großer hochauflösender Bilder auf Hunderten von Abschnitten und erreicht ähnliche Volumina wie SBFI. Die Aufzeichnung von Übersichtsbildern aller Schnitte vereinfacht die ROI-Lokalisierung und reduziert den Zeitaufwand am Mikroskop. Da die Abschnitte bei der Aufzeichnung von Übersichten und höher aufgelösten Vorschauen nicht beschädigt werden, erlaubt AT/SEM die Wiederverwendung der Probe, um weitere Daten anderer ROIs oder mit einer höheren Auflösung zu sammeln.
Die Bildaufnahmezeit ist einer der wichtigsten (und teuersten) Aspekte der 3D-EM und sollte daher bei der Versuchsplanung berücksichtigt werden. Während es nicht verwunderlich ist, dass die Bildgebung großer Bereiche länger dauert als die Abbildung kleiner Bereiche, ist es leicht, die Auswirkungen zu unterschätzen: Abhängig von den ausgewählten Bildgebungsparametern kann die Erfassungszeit für jeden Abschnitt von Sekunden bis Stunden variieren. Zu den kritischen Bildgebungsparametern gehören die Größe des Sichtfelds, die Auflösung und die Verweildauer. Unter der Annahme einer Zielauflösung von 10 nm pro Pixel und einer Verweilzeit von 1 μs dauert die Aufnahme eines Feldes von 20 μm x 20 μm, 100 μm x 100 μm oder 500 μm x500 μm 4 Sekunden, 100 Sekunden oder 2.500 s. Wir können diese Bildgebungszeiten pro Abschnitt mit der Anzahl der Abschnitte multiplizieren, um die zeitliche Zeit zu schätzen, die für den gesamten Bildgebungsauftrag benötigt wird. Lange Bildgebungszeiten pro Schnitt können akzeptabel sein, wenn die Anzahl der Schnitte klein ist oder wenn die Mikroskopwerkzeugzeit nicht von Belang ist.
Es ist jedoch notwendig, die Aufnahmezeit in den meisten Fällen auf einen Übernachtjob oder einen Wochenendjob zu beschränken. Ein ebenso kritischer Aspekt der 3D-EM, der berücksichtigt werden sollte, ist die Menge und Struktur der resultierenden Bilddaten. Die Aufzeichnung der oben genannten Abbildungsfelder in 100 Abschnitten erzeugt 400 MB, 10 GB bzw. 250 GB Bilddaten; Die 500 μm x 500 μm großen Bilder werfen das zusätzliche Problem auf, dass sie jeweils größer als 2 GB sind. Viele der Softwareprogramme, die für die Datenauswertung verwendet werden, können Bilder dieser Größe nicht öffnen.
Um die Bildgebungszeit zu verkürzen, ist es wichtig, die Pixelverweilzeit zu wählen, um die Anforderungen an das Signal-Rausch-Verhältnis für die anschließende Datenauswertung (z. B. Rekonstruktion, Tracing) zu erfüllen und die Aufzeichnungen auf definierte ROIs zu beschränken. Die AT-Erweiterung der Software erleichtert die Bildaufnahme in kleinen Bereichen in seriellen Abschnitten. Die Software unterstützt manuelle und automatische Arbeitsabläufe und viele halbautomatische Varianten: Bildbereiche können manuell positioniert und auf jeden Abschnitt fokussiert werden, oder der Benutzer kann den automatischen Schnittfinder und die Positionsausrichtungsfunktionen verwenden. Abhängig von der gewählten und unterstützten Automatisierungsstufe durch den Probentyp oder die Bildgebungsziele kann die Zeit, die für die Einrichtung der Bildaufnahme in Hunderten von Abschnitten erforderlich ist, einen ganzen Arbeitstag (manuell) oder nur wenige Minuten dauern. Im Prinzip macht es die Array-Tomographie schwieriger als andere 3D-EM-Methoden, kleine ROIs zu erfassen. ungenaue Regionsplatzierungen auf aufeinanderfolgenden Abschnitten müssen durch den Erwerb größerer Flächen kompensiert werden. Wenn der ROI beispielsweise 20 μm x 20 μm groß ist und die Positionsvariabilität der Bildgebungsfelder von Abschnitt zu Schnitt 10 μm beträgt, muss man 40 μm x 40 μm Bilder aufnehmen, um sicherzustellen, dass der ROI in jedem Bild und in jedem Abschnitt vollständig erfasst wird. Die reale Bildpositionsvariabilität reicht von 100 μm bis <10 μm, abhängig von der Verfügbarkeit oder Qualität der Softwarefunktionen für die Positionsausrichtung oder der Geduld des Benutzers. Mit dieser Software können 10 μm ohne zu viel manuellen Eingriff in den meisten Proben erreicht werden.
Wie jede Technik hat der AT mehrere Schwachstellen, die die erfolgreiche Datenerfassung beeinflussen können, und viele ähneln anderen abschnittsbasierten Methoden. Das Fehlen einer homogenen Verteilung von leerem Harz im Vergleich zu Gewebe kann zu gekrümmten oder gebrochenen Arrays führen. Im Extremfall können sich Abschnitte von der Stütze lösen (Abbildung 6A). Variable Kompression oder Dehnung während des Schneidprozesses kann Falten erzeugen, die die Probe in variablen Bereichen auf nachfolgenden Abschnitten stören können (Abbildung 6B). Messerspuren können auf der Oberfläche der gesammelten Abschnitte mit einem beschädigten Messer erscheinen (Abbildung 6C). Unterschiede in den Schnittbedingungen können gelegentliche Querschnittskompression und Dickenunterschiede verursachen. Staub- oder Schmutzpartikel können auf einem Abschnitt landen und die interessierende Zone teilweise verdecken (Abbildung 6D). Die Bildaufnahme kann aufgrund unvollkommener Autokontrast-, Autofokus- und Auto-Stigmator-Funktionen fehlschlagen. Die Positionierung von automatisch erstellten Bildgebungsbereichen kann variabel sein und den ROI möglicherweise nicht in allen Abschnitten erfassen.
Mehrere Probleme können in der Phase des Nähens und Ausrichtens auftreten. Das automatische Nähen von Mosaikfliesenakquisitionen kann beispielsweise aufgrund des großen leeren Raums in der Probe fehlschlagen. Aufgrund einer drastischen Formänderung in 3D können Bildstapel schwierig zu registrieren sein. Speziell entwickelte Programme (z.B. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB oder MAPS-AT) können die halbautomatische Ausrichtung32,38,39,40ermöglichen. Anspruchsvollere Abschnitte können manuell mit einer Fotobearbeitungssoftware ausgerichtet werden. Leider können einige Datensätze möglicherweise nicht korrekt ausgerichtet werden.
Große Proben sind eine Herausforderung für TEM-Serienschnitte, die auf Gitter passen; Auf der anderen Seite rechtfertigen viele Projekte keine lange automatische Erfassung mit FIB/SEM oder SBF-SEM. Der AT ist eine einfache Alternative zu einem mühsamen seriellen Schnitt-TEM, bei dem das Sammeln und Manipulieren von seriellen Abschnitten auf einem Wafer einfacher ist als bei den Slot-Grids. Mehrere Strategien wurden entwickelt, um die Sammlung der Arrays zu erleichtern, und wir teilen unsere Methode, um das bestehende Toolkit zu erweitern. In Fällen, in denen die Identifizierung des ROI eine Herausforderung darstellt, bietet AT-SEM einen grundlegenden Vorteil, nämlich das effiziente Screening der Proben, bei denen eine Auflösung im Organellenmaßstab über 50 bis 500 Abschnitte erforderlich ist. Für größere Volumina können die automatischen Erfassungsstrategien AT effizient gesammelt werden, wenn mehr Abschnitte benötigt werden. AT-Proben können mehrfach neu abgebildet werden, was eine gezielte Abbildung von hochauflösenden Bereichen auf der Grundlage zuvor aufgenommener Übersichtsbilder ermöglicht. Wir glauben, dass die hier vorgeschlagene gezielte Analyse und reduziertes Oversampling durch AT/SEM die Anforderungen an Arbeit und Datenspeicherung verringert. Letztendlich können Sektionsbibliotheken gesammelt und für die spätere Wiederverwendung und Konsultation gepflegt werden. Für die Volumenerfassung bieten FIB- oder SBF-SEM-Ansätze eine hervorragende Lösung, wenn der ROI auf der Blockfläche leicht zu identifizieren ist oder wenn große 3D-Volumina für die Analyse benötigt werden. WENIGER effizient sind FIB/SBF-SEM jedoch, wenn das hochauflösende Stack-Bild aus einem definierten ROI gezielt erhoben werden muss. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgeschlagenen Methoden für das Screening von AT-Proben und die Verwendung von Übersichtsbildern mit mittlerer Auflösung es ermöglichen, die Bildaufnahme auf die relevanten Teile des Abschnittsarrays zu beschränken. Die präzise Ausrichtung von Abbildungsbereichen beschleunigt die Zeit bis zur Dateneingabe und vereinfacht die Datenauswertung.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Konzept des AT/SEM zwar nicht neu ist, seine Verwendung jedoch immer noch nicht so weit verbreitet ist, wie seine Vorzüge vermuten lassen. Insgesamt bietet es ein ergänzendes Verfahren zu anderen bestehenden EM-Methoden. AT/REM ist mit den unterschiedlichsten Probenvorbereitungsprotokollen und Bildgebungs-Workflows kompatibel und kann auf jedem FIB/REM- oder SBF-REM-Mikroskop als begleitende Technik durchgeführt werden. In diesem Artikel haben wir uns auf AT konzentriert, um ultrastrukturelle Daten von Proben aufzuzeichnen, die mit anderen Methoden weniger wahrscheinlich erfolgreich behandelt werden. Wir hoffen, dass das beschriebene Verfahren zur bequemen Erfassung von Abschnitten und erheblich automatisierten Akquisitionsstrategien bei den ersten Versuchen für diejenigen, die der Methode noch nie begegnet sind, helfen und dazu beitragen wird, sie für diejenigen, die bereits etwas Erfahrung haben, zu perfektionieren.

Trotz der Bedeutung von EM-bezogenen Techniken beschränkt sich der Aufwand, um sie zu beherrschen, das gesamte Feld auf eine kleine Anzahl von Spezialisten. Eine wesentliche Schwierigkeit ist die Identifizierung und der Abruf einer Region of Interest (ROI) in den für EM aufbewahrten Proben. Das Aussehen derselben Probe unterscheidet sich erheblich, wenn sie durch optische Mikroskopie und nach der Verarbeitung für die EM-Beobachtung analysiert wird. Die Änderungen für chemisch präparierte Proben umfassen die anisotrope Probenschrumpfung nach den Dehydratisierungsschritten (~ 10% in jeder Dimension) und den Verlust der Fluoreszenz bei Verwendung von Osmium im Fixations- und Färbeprotokoll (Abbildung 1A). Für den ultradünnen Schnitt werden die Proben mit unterschiedlichen Strategien in Epoxid- oder Acrylharze eingebettet (Abbildung 1B). Für erfolgreiche Ergebnisse dieser Vorbereitung muss die gesamte Probe in Stücke fraktioniert werden, die 1 mm x 1 mm nicht überschreiten. Um die Anforderungen der Standardmäßigen Beobachtungsbedingungen der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zu erfüllen, wird dieser winzige Teil der Probe weiter in 50-150 nm dicke Scheiben geschnitten. Die resultierenden Graustufenbilder zeigen Gewebeorganisation und Organellenstruktur eines winzigen Bruchteils der gesamten Probe detaillierter als jede andere Mikroskopietechnik (Abbildung 1C). Ein typischer TEM-Datensatz liefert 2D-Informationen, die theoretisch extrapoliert werden, um die Prozesse zu verstehen, die in einem 3D-Raum in Zellen und Geweben natürlich vorkommen. Abbildung 1D stellt die Herausforderung der erfassung ultrastruktureller Volumina dar: Wenn ein Würfel mit einer Seite von 1.000 μm bei einer Dicke von 50 nm geschnitten wird, werden 20.000 Abschnitte benötigt, um das gesamte Volumen abzudecken; für einen 500 μm Seitenwürfel sind es 10.000 Abschnitte. Um ein Volumen von 50 μm x 50 μm x 50 μm abzudecken, können "nur" 1.000 Schnitte notwendig sein. Dieses Volumen manuell zu erhalten, ist praktisch unmöglich und mit der Automatisierung äußerst schwierig durchzuführen. Wenn wir zusätzlich zur Probentiefe die gesamte Oberfläche solcher hypothetischen Würfel abdecken müssen, wird die Abdeckung von 1 μm2 Oberfläche bei vernünftiger Auflösung zu einem ernsthaften logistischen Problem (Abbildung 1E). Während für die außergewöhnlichen Großprojekte, wie z.B. Connectomics-Ansätze, die große Anzahl von Sektionen entscheidend ist, stellt für die Mehrheit der "profanen" EM-Projekte die Generierung von mehr Für die Beobachtung benötigten Abschnitten einen erheblichen Nachteil dar.
Es gibt mehrere Methoden, um 3D-Ultrastrukturinformationen zu erfassen: serielle Schnitt-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), TEM-Tomographie, Array-Tomographie (AT), Serial Block Face Imaging Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) und Fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-REM). Hauptunterschiede zwischen diesen Methoden sind die Schnittstrategie und ob die Bildaufnahme mit der Schnittgeneration1gekoppelt ist. Beim seriellen Schneiden von TEM werden sequentielle Schnitte auf Slotrastern gesammelt, aus diesen Sequenzen TEM-Bilder generiert und 2,3,4,5ausgerichtet. In der TEM-Tomographie liefern Neigungsreihen von 150-300 nm Schnitten auf einem Gitter und wenn sie an serielle Schnitte gekoppelt sind, eine sehr hohe Auflösung, wenn auch relativ kleineVolumina 6,7,8. Der AT-Ansatz verwendet physische Schnitte mit verschiedenen manuellen und halbautomatischen Arten der Abschnittssammlung auf relativ großen Trägern, wie Glasdeckglas, Siliziumwafern oder einem speziellen Band. Für die Bildaufnahme wird die Unterstützung im REM analysiert, mit diversen Bildaufnahmestrategien stehen9,10,11,12,13,14,15 zur Verfügung . Für SBF-REM wird die physikalische Schnitte unter Verwendung eines Mini-Mikrotoms mit einem Diamantmesser erreicht, das direkt in die REM-Kammer gesetzt ist, wobei das REM-Bild von der Oberfläche des Harzblocks16,17,18,19erzeugt wird . Für FIB-REM entfernt die Ionenquelle dünne Schichten der Probe, gefolgt von einer automatischen Abbildung der belichteten Oberfläche durch das REM20,21. Die TEM-Tomographie und der AT erzeugen physikalische Schnitte, die bei Bedarf neu abgebildet werden können, während FSBF-REM und FIB-REM den Schnitt nach der Bildgebung eliminieren. Eine kürzlich von einem Multi-Beam-REM abgebildete Kombination physikalischer Schnitte bietet eine Kombination von Methoden, die das "Engpassproblem" der Bildaufnahmegeschwindigkeitlösen 22. Jede dieser Techniken hat die Art und Weise revolutioniert, wie EM-Daten gewonnen und analysiert werden können, und jeder Ansatz hat seine praktischen Auswirkungen im Zusammenhang mit einer bestimmten Forschungsfrage.
Angesichts der Art der Herstellung und der Skala der ultrastrukturellen Dimensionen ist es nicht einfach vorherzusagen, wo sich eine bestimmte Zielstruktur im Probenblock befindet (Abbildung1D, E). Eine Lösung für die ROI-Lokalisierung ist die Aufzeichnung der Bilder aus dem gesamten Block in der gewünschten Auflösung von Anfang an. Die interessierenden Strukturen können sich im erfassten Datenvolumen befinden, wenn sie nicht vom Mikroskop entfernt sind. Die mit dieser Strategie verbundene Erfassungszeit und Datenverarbeitung sind problematisch. Es ist wünschenswert, die Menge der aufgezeichneten Daten zu reduzieren, insbesondere wenn die ROIs viel kleiner als der Gewebeblock sind, d.h. wenn die Objekte von Interesse bestimmte Arten von Zellen (nicht ganze Organe) sind. Verschiedene korrelative Licht- und Elektronenmikroskopietechniken (CLEM) können erfolgreich sein, wenn die Fluoreszenz vor oder nach der Vorbereitung innerhalb derselben Probe erhalten und lokalisiert wird23,24,25,26,27,28,29. Dennoch sind viele zelluläre Strukturen auch ohne Fluoreszenzkorrelation erkennbar, nur anhand der bekannten Ultrastruktur. Für diese Fälle glauben wir, dass die laterale Screening-Array-Tomographie einen ausgewogenen Kompromiss zwischen dem aufwand für die ROI-Lokalisierung und der ultrastrukturellen Informationsqualität darstellt. Mit dieser Strategie wird in regelmäßigen Abständen eine Teilmenge von Abschnitten auf dem Wafer gescreent, die anhand der Größe und Art des ROI ermittelt werden kann. Sobald ROIs gefunden sind, wird die Datenerfassung in einer kontinuierlichen Reihe von Abschnitten aufgebaut, die vor und nach dem Ankerabschnitt beginnen und enden, um die relevanten Informationen gezielt zu sammeln.
Wir stellen Protokolle für AT vor, die die Erfassung von Regionen oder Ereignissen von Interesse in zahlreichen Abschnitten vereinfachen und beschleunigen und besser aufeinander abgestimmte Bildvolumina liefern. Laterales Screening und mehrstufige Erfassung erzeugen Daten mit sehr hoher Auflösung in genau anvisierten Regionen. Das von uns beschriebene Verfahren adressiert mehrere Herausforderungen der 3D-EM-Datenerfassung, da es Folgendes vorsieht: Kompatibilität mit einer breiten Palette von Proben, ohne den Probenvorbereitungsablauf grundlegend zu verändern; gezielte Lokalisierung für Sektionen und SEM-Akquisitionen; reduzierter Zeit- und Arbeitsaufwand während der Einrichtung; Abbildung von Regionen in mehreren Abschnitten mit besserer Ausrichtung der resultierenden Volumina; und ein glattes Stitching- und Ausrichtungsverfahren, um verschiedene Bilder zu einem zusammengefügten Mosaikbild zusammenzustellen. Wir haben uns entschieden, die Stärke unserer Methode mit mehreren Proben aus veröffentlichten und laufenden Projekten zu demonstrieren. Wir glauben, dass dieser Ansatz die Generierung und Erfassung gezielter EM-Daten erheblich erleichtern kann, selbst für Forscher mit begrenzter EM-Erfahrung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AT sectioning knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUATS3530</td>
			<td>Diatome Jumbo knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td>Diatome trimming 20&#176; 
			Glass knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16015</td>
			<td>Resistance: 1-30 Ohms 
			Type P: (Boron) (1 primary flat) 
			Roughness: 2 nm 
			No SiO2 top coating 
			TTV: = &#60;20 &#181;m 
			Wafer is polished on one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer cleaving kit</td>
			<td>EMS</td>
			<td>7642</td>
			<td>EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Thermo Fischer Helios</td>
			<td>1072419</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maps 3 for SEM with Correlative Workflow &#38; Array Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1135932</td>
			<td>Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira x.y</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131599</td>
			<td>Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td>IMOD, MIB (See text for refferences)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy

Die Elektronenmikroskopie wird in der Biologie und Medizin zur Abbildung zellulärer und struktureller Details mit Nanometerauflösung eingesetzt. Historisch gesehen lieferte die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Einen Einblick in die Zellsuperstruktur, aber in den letzten zehn Jahren hat die Entwicklung moderner Rasterelektronenmikroskope (REM) die Art und Weise, wie in die Zellen geschaut wird, verändert. Obwohl die Auflösung von TEM überlegen ist, wenn strukturelle Details auf Proteinebene benötigt werden, ist die REM-Auflösung für die Mehrheit der zellbiologischen Fragen auf Organellenebene ausreichend. Der technologische Fortschritt ermöglichte automatische Volumenerfassungslösungen wie Serial Block-Face Imaging (SBF-SEM) und Focused Ion Beam SEM (FIB-SEM). Dennoch sind diese Methoden bis heute ineffizient, wenn es auf die Identifizierung und Navigation zu Interessengebieten ankommt. Ohne die Mittel zur präzisen Lokalisierung von Zielbereichen vor der Bildgebung müssen Bediener viel mehr Daten erfassen, als sie benötigen (in SBF-REM), oder, noch schlimmer, viele Gitter vorbereiten und sie alle abbilden (in TEM). Wir schlagen die Strategie des "lateralen Screenings" unter Verwendung der Array-Tomographie im REM vor, die die Lokalisierung von Interessengebieten erleichtert, gefolgt von einer automatisierten Bildgebung des relevanten Anteils des gesamten Probenvolumens. Array-Tomographie-Proben werden während der Bildgebung konserviert und können in Schnittbibliotheken angeordnet werden, die für wiederholte Bildgebung geeignet sind. Es werden mehrere Beispiele gezeigt, in denen das laterale Screening es uns ermöglicht, strukturelle Details zu analysieren, die mit jeder anderen Methode unglaublich schwierig zu erreichen sind.

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Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Wir beschreiben die Vorbereitung von Bändern serieller Schnitte und deren Sammlung auf großen Transferträgern für den Einsatz als Array-Tomographie-Proben sowie automatisierte Bildgebungsverfahren in einem Rasterelektronenmikroskop. Das Protokoll ermöglicht das Screening, den Abruf und die gezielte Bildgebung lokaler, seltener Ereignisse und die Erfassung großer Datenmengen.

Array-Tomographie-Workflow zur gezielten Erfassung von Volumeninformationen mittels Rasterelektronenmikroskopie

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Elektronenmikroskopische Analysen sind häufig komplex. Wir glauben, dass unser Protokoll die Verarbeitung und Erfassung der EM-Daten von der großen Probenoberfläche und dem Zwischenvolumen erleichtert. Unser Protokoll hilft, Zielstrukturen in seriellen Abschnitten zu finden.Die Datenaufzeichnung beschränkt sich auf das Notwendige. Im Vergleich zur Datenerfassung in ganzgewebten Blöcken wird die Aufnahmezeit reduziert und die Datenanalyse erleichtert. Angesichts der allgemeinen Leichtigkeit des Ansatzes glauben wir, dass er nicht nur für wissenschaftliche Fragen, sondern auch als diagnostisches Instrument verwendet werden kann.Um ein Array für die Analyse zu erzeugen, klemmen Sie zuerst die Probe auf einen Ultramikrotomhalter und verwenden Sie eine Rasierklinge, um das Harz um die Probe herum grob zu trimmen. Verwenden Sie ein Diamantschneidwerkzeug, um die Probe fein zu trimmen, und verwenden Sie Trimmmesser mit einer Neigung von 20 oder 90 Grad, um sicherzustellen, dass die Ober- und Unterseite des Blocks parallel zur Schneide des Messers verlaufen. Mischen Sie Xylol und Kleben in einem Verhältnis von 3: 1 und verwenden Sie eine Wimper, die an einem Zahnstocher befestigt ist, um die Mischung auf die Ober- und Unterkante des zugeschnittenen Blocks aufzutragen.Während die Mischung trocknet, verwenden Sie ein Wafer-Spaltwerkzeug, um ein Stück Wafer auf die für die Analyse geeignete Größe zu schneiden. Reinigen Sie den Wafer in destilliertem Wasser, um alle Ablagerungen wegzuspülen, und reinigen Sie die Oberfläche mit Plasma, nachdem der Wafer getrocknet ist. Um ein Array-Tomographiemesser vorzubereiten, verwenden Sie schaumiges Klebeband, um eine Nadel am Boden eines Histo-Jumbo-Messers zu befestigen, und legen Sie das Messer bei null Grad in den Ultramikrotomhalter.Stellen Sie die Schneide des Messers parallel zur Blockoberfläche ein und bringen Sie den beschnittenen Block in einer schnittbereiten Position an den Rand des Messers. Legen Sie die saubere Waffel in das Messerbecken und füllen Sie das Becken mit Wasser auf die gleiche Höhe wie die Messerkante, dann lassen Sie die Diamantkante des Messers richtig befeuchten, indem Sie die angebrachte Spritze verwenden, um wasser nach Bedarf hinzuzufügen oder zu entnehmen. Stellen Sie für das Array-Schneiden das Mikrotom auf einen Schnittbereich von 50 bis 100 Nanometern und eine Schnittgeschwindigkeit von 6 bis 1 Millimeter pro Sekunde ein und beginnen Sie mit dem Schneiden, um ein Band zu erhalten, das lang genug ist, um ein zielgerichtetes Z-Volumen abzudecken.Abhängig von der Blockgröße, der Homogenität des Gewebes und der Art des Harzes ist das Band ungefähr gerade. Verwenden Sie eine saubere, nicht klebrige Wimpernspitze, um die Bänder von der Messerkante zu lösen. Verwenden Sie die Wimpern, um das Band vorsichtig in die Mitte des Trägermediums zu bewegen.Chloroform oder ein Heizstift kann verwendet werden, um den Abschnitt bei Bedarf zu dehnen. Ziehen Sie nach dem Dehnen die Spritze ein, um das Wasser abzulassen. Für empfindlichere Bänder oder ein langsameres Zurückziehen des Wassers lösen Sie die Spritze vom Schlauch, damit das Wasser tropfen kann.Wenn der Wasserstand den Waferstand erreicht hat, drücken Sie das Band vorsichtig in die Mitte des Beckens und lassen Sie weiter abtropfen, bis das gesamte verbleibende Wasser vollständig aus dem Becken entfernt ist. Lassen Sie den Wafer in einer sauberen Umgebung trocknen. Die Trocknung dauert ca. 30 Minuten.Wenn die Probe vollständig getrocknet ist, bringen Sie das Array in eine fest verschlossene Box, um sie vor Schmutzkontamination zu schützen. Und stellen Sie die Box für mindestens 30 Minuten in einen 60 Grad Celsius warmen Ofen. Um eine Übersichtskarte von REM-Bildern zu erhalten, die Schnittpositionen auf dem Wafer zeigt, verwenden Sie die integrierte optische Kamera, um ein SEM-Bild zu erfassen, das ein Band von Abschnitten abdeckt.Um ein Mosaik zu erstellen, klicken und ziehen Sie das Kamerabild des Beispiels und starten Sie die automatische Erfassung. Verschaffen Sie sich Übersichten mit höherer Auflösung, um Zielstrukturen zu finden. Wenn nur wenige Abschnitte abgebildet werden müssen, verwenden Sie den zoombaren Viewer, um die aufgenommenen Bilder an ihren ursprünglichen Positionen anzuzeigen.Sobald ein Abschnitt identifiziert wurde, der mit hoher Auflösung abgebildet werden soll, klicken und ziehen Sie, um einen Bildbereich zu erstellen, wählen Sie dann Einstellungen für die hochauflösende Bildgebung aus und speichern Sie die Einstellungen in einer Vorlage Um besonders kleine oder schwer zu erkennende seltene Ereignisse zu finden, verwenden Sie die Einstellungen für die hochauflösende Bildgebung in jedem 10. Abschnitt oder in einem Abschnitt pro Menüband, um manuell einen Bildbereich zu erstellen und die Bilder zu erfassen. Überprüfen Sie dann die Bilder und markieren Sie Abschnitte, die die Region von Interesse enthalten. Um mehr als 10 aufeinanderfolgende Abschnitte zu erfassen, verwenden Sie den Abschnittsfinder, um alle Abschnitte automatisch zu finden.Wenn die Übersichtsbilder keine klaren Interessensgebiete zeigen, erfassen Sie Bilder mit höherer Auflösung der Abschnitte und verwenden Sie die Abschnittsvorschaufunktion, um die Bilder automatisch zu erstellen und zu erfassen. Um die optimalen Bildgebungseinstellungen zu bestimmen, aktivieren Sie die Live-Bildgebung in der Mikroskopsteuerungssoftware und navigieren Sie zu einer Region von Interesse, dann passen Sie die Bildgebungseinstellungen an, bis die Bilder klare Bereiche von Interesse zeigen, jedoch ohne eine übermäßig lange Bildaufnahme gemäß den Richtlinien des Herstellers. Um die Positionierung der Bildbereiche in aufeinanderfolgenden Abschnitten zu optimieren, zoomen Sie auf das gewünschte Bild und klicken Sie auf Positionsbestimmung starten, um die Genauigkeit der registrierten Schnittpositionen zu erhöhen.Um einen Imaging-Bereich zu definieren, klicken und ziehen Sie auf einen beliebigen Abschnitt, während Sie die Alt-Taste gedrückt halten, und wählen Sie im Popup-Kontextmenü die Option "Kachelsatz-Array erstellen". Die Software erstellt Bildbereiche an derselben relativen Position in allen Abschnitten, die gefunden oder zuvor markiert wurden. Richten Sie dann die Pixelanzahl, die Pixelgröße, das Kachellayout und die Pixelverweildauer in jeder Bildserie nach Bedarf ein.Um die Auto-Funktion zu konfigurieren, erstellen Sie eine separate Bildreihe für auto-Funktionen wie demonstriert, und verschieben Sie die Bildserie an eine Position auf dem Abschnitt, der kontrastreiche Strukturen enthält. Stellen Sie die Bildserie auf 1024 x 884 Pixel ein und wählen Sie eine Pixelgröße aus, die der höchsten in der Bildserie verwendeten Auflösung entspricht. Aktivieren Sie in der Liste der Autofunktionen Autofokus und Auto Stigmator.Wählen Sie in den Steuerelementen für die Aufnahmesequenz die Option Bisection aus, und vergewissern Sie sich, dass das Bild der automatischen Funktion das erste Element in der Liste ist, und klicken Sie dann auf Alle erfassen, um die Bildaufnahme zu starten. Wenn alle Imaging-Serien erstellt und eingerichtet wurden, wird die Serie in einer Auftragswarteschlange aufgelistet. Die Erfassung mit niedriger Auflösung kann manuell oder automatisch direkt für ausgewählte Teile des Abschnitts oder eines ganzen Abschnitts mit Einzel- oder Mosaikbildgebung durchgeführt werden, gefolgt von Stitching.Bilder aus dem ausgewählten Bereich können dann mit hochauflösenden Parametern aufgenommen werden, um Beispielsweise Mitochondrien, Kerne und Mikrovilli zu visualisieren. Nachdem die automatische Erfassung aufgelöster Mosaikkarten ausgewählt wurde, können mehrere Regionen von Interesse ausgeschnitten oder verwendet werden, um zusätzliche lokale Bildgebungsbereiche innerhalb der Regionen zu definieren. Obwohl verschiedene spezialisierte Zelltypen im Drosophila-Darm zufällig verteilt sind, können sie nach dem Screening der Bilder anhand hochauflösender Parameter visuell unterschieden werden, entweder aus einzelnen Abschnitten oder als Sammlung von Seriellen Bildern. Nach der Ausrichtung können die Stacks mit verschiedenen Softwarelösungen gerendert werden.Die Array-Tomographie-Analyse ermöglicht es, viele sequenzielle Abschnitte auf dem einzelnen Wafer zu erzeugen und mit Niedrigauflösungsparametern zu screenen, um die allgemeinen Interessengebiete zu lokalisieren. Diese Bereiche können mithilfe fortschrittlicher Erfassungsparameter für die weitere Analyse anvisiert werden. Zum Beispiel sind mytotische Unterteilungen im Notum auf der ultrastrukturellen Ebene nicht leicht zu lokalisieren, da die Zellen im Vergleich zur Abszischzone relativ groß sind.Mit dieser Methode können jedoch die automatischen mittelauflösenden Übersichtsbilder der Sprünge von 20 bis 40 Abschnitten zur Lokalisierung der sich teilenden Zellen verwendet werden. Das Array-Tomographie-Verfahren ermöglicht eine einfachere elektronenmikroskopische Datenanalyse. Wir ermutigen die Zuschauer, in die Beherrschung der Regeneration zu investieren und sich mit dem kartenbezogenen Workflow vertraut zu machen Unserer Erfahrung nach erfordern nur wenige Forschungsthemen die ultrastrukturelle Analyse ganzer Tiere oder ganzer Organe.Unsere Methode hilft bei der schnellen Lokalisierung von Zellen und ihren Interaktionspartnern in Geweben.

Research

JoVE Journal

Biology

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Eine standardisierte Methode für die Analyse von Leber sinusoidalen Endothelzellen und ihre Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie

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Forschung

Biologie

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Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

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Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

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