Name: array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

אנו רוצים להודות לחברי המתקן EM של אוניברסיטת לוזאן על תמיכתם במהלך פיתוח זה של שלבים שונים של הליך AT. ברצוננו להודות לגארת גריפיתס, מרתה רודריגז, אורסקה רפניק, כריסטל גנוד, הלמוט גנאגי, עינת זלינגר, פאולה מורנו-רומן, לוסי אובריאן ולינדזי לוולין על הדיונים במהלך הכנת כתב היד והקריאה הביקורתית. אנחנו רוצים להכיר בקבוצות שתרמו את הדגימות ששימשו להדגמת התרחישים השונים: מתיאס לוטולף, מיכאל ניקולייב, דבנג'אלי דוטה, עד מצאט ופאני לנגלט.

הערה: שיטות הכנה לדוגמה מתוארות במקומות אחרים14,30,31ואינן מכוסות בפרסום זה. בקיצור, הדוגמאות המוצגות תוקנו כימית עם glutaraldehyde, לאחר קבוע עם 1% OsO4, ולאחר מכן טופל עם 1% אצטט אורניל מימי לפני הטבעה שרף הטמעה. לחלופין, ניתן להכין דגימות באמצעות הקפאה בלחץ גבוה, להקפיא תחליף עם 0.1% אורניל אצטט אצטון, מוטבע שרף אקרילי. בלוקים לדוגמה הוכנו בשיטת הטבעה שטוחה המאפשרת תצוגה ברורה של המדגם, מה שמקל על הכיוון שלה לחתך (איור 1B).
1. הליך יצירת מערך
<ol><li>כיוון וגיזום לדוגמה מוטבעים<ol>
<li>באמצעות המשקפת/מיקרוסקופ, זהה וסמן את ההבשלה על משטח הבלוק המוטבע על-ידי גירוד קל של פני השטח של הבלוק עם סכין גילוח. זה יעזור לכוון את המדגם בתוך ultramicrotome ויפחית את משטח החתך.</li>
		<li>מהדקים את הדגימה על מחזיק האולטרה-מיקרודום(איור 2A).</li>
		<li>חותכים את השרף סביב המדגם, תחילה עם סכין הגילוח (חיתוך גס) וממשיכים בכלי חיתוך היהלום (חיתוך עדין; איור 2א). השתמש בסכינים עם נטייה של 20° או 90° לקצה כדי להבטיח שהמשטחים העליונים והתחתוניים של הבלוק מקבילים לחוד החנית של הסכין. הערה: שלב זה הוא קריטי עבור עריכה טורית ורכישה של סרטים ישרים.</li>
		<li>מערבבים קסילן ודבק בפרופורציה של 3:1. עם ריס המחובר לקיסם, יש למרוח את התערובת על החלק העליון ועל הקצוות התחתונים של הבלוק החתוך. תן לו להתייבש ביסודיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן את התמיכה בהרכבת המערך A (כלומר, ופלים מסיליקון).<ol>
<li>חותכים את חתיכת הוופל באמצעות כלי מחשוף רקיק (EMS), התאמת גודלה ליעד הפרויקט. 2 ס"מ x 4 ס"מ נוח הן תצפיות מיקרוסקופיה אור ואלקטרון.</li>
		<li>נקו את הוופל במים מזוקקים כדי להיפטר מהפסולת.</li>
		<li>פריקה זוהרת / פלזמה לנקות את פני השטח באמצעות ציוד סטנדרטי. הפרמטרים המדויקים יהיו תלויים במכונה המשמשת. התחל עם הפרמטרים עבור הפרשות הרשתות ולהתאים אמפירית את השעה. שלב זה חיוני להפצה טובה של הסעיפים על התמיכה בזמן שהמקטעים מתייבשים ואין להשמיטם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת התמיכה בהרכבת מערכים B (כלומר, כיסוי זכוכית)<ol>
<li>אם אתם מתכננים ניסויים בסימון אימונו מולטיפלקס, העבירו את הדגימות על כיסוי כדי לזהות טוב יותר את אות הפלואורסצנטיות. כדי לשפר את דבקות כיסוי, השתמש בהליך ציפוי ג'לטין מפורט מתואר בעבר9.</li>
		<li>להגביר את המוליכות על ידי ציפוי השקופיות עם האינדום-פח תחמוצת (ITO) או זהב על ידי אידוי. שמור את כיסויי הכנה בסביבה נקייה. זוהר לפרוק את הדגימות כמתואר ב 1.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. חתך המדגם
<ol><li>הכנת סכין AT הערה: כדי ליצור את המערכים, השתמש בסכין שונה (ATS), שנועד להקל על רכישת סרטים ארוכים. סכיני היסטו-ג'מבו או סכינים דומים שהגה לדור הסעיפים על תמיכות גדולות יכולים לשמש גם לחתך AT.<ol>
<li>חברו את המחט לתחתית הסכין באמצעות הסרט הדביק הקצף ונקבו אותה(איור 2B). מניחים את סכין ה-ATS במחזיק האולטרה-מיקרודום ב-0°. כוונן את קצה הסכין במקביל למשטח הבלוק באמצעות ההליך הרגיל.</li>
		<li>מביאים את הבלוק החתוך לקצה הסכין בתנוחה מוכנה לחיתוך.</li>
		<li>מניחים את הוופל/ מכסה בתוך אגן הסכין וממלאים אותו במים לאותה רמה כמו קצה הסכין. תן לקצה היהלום של הסכין לח כראוי, ובמידת הצורך למשוך מים באמצעות המזרק המצורף(איור 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>סידור מקטעים והעברה של מערך<ol>
<li>הגדר את המיקרוטומיה לפרמטרים הרצויים לחיתוך. עם סכין ATS, טווח של 50-100 ננומטר ומהירות חיתוך של 0.6-1 מ"מ / s מומלץ. התחל חתך (איור 2Di).</li>
		<li>השג רצועת כלים באורך שתכסה אמצעי אחסון z ייעודי ותעצור את האוסף. בהתאם לגודל הבלוק, להומוגניות של הרקמה ולסוג השרף, הסרט יהיה ישר יחסית(איור 2D-ii). דגימות רבות לא ייצרו סרטים ישרים, למרות המאמץ המושקע וסוג הסכין משמש.</li>
		<li>בהתאם למטרה הסופית, הפוך סרט ארוך אחד או מספר סרטים קצרים מיושרים זה לצד זה. תמיכה של 2 ס"מ על 4 ס"מ יכולה להכיל בנוחות 100 עד 1,000 חלקים. הסידור של רצועת הכלים על שלב התמיכה הוא צעד הדורש מיומנות וידיים יציבות. עם זאת, עקומת הלמידה עבור מיומנות זו נרכשת במהירות.</li>
		<li>נתק את הסרט מקצה הסכין באמצעות קצה נקי ולא דביק של ריס המודבק עלהקיסם (איור 2Diii).</li>
		<li>בעזרת הריסים, הזז בעדינות את רצועת הכלים מעל מרכז מדיום התמיכה. בשלב זה, השתמש בכלורופורם או עט חימום למתיחת המקטעים במידת הצורך. עם זאת, זכור כי מניפולציה זו עלולה לגרום לשבירת סרט ומעיוות.</li>
		<li>התחל לנקז את המים על ידי משיכת המזרק. עבור סרטים עדינים יותר או נסיגה איטית יותר במים, תן למים לטפטף על ידי ניתוק המזרק מהצינור. כאשר מפלס המים יורד לרמת הוופל, שלוט ברצועת הכלים ומיקום מחדש במידת הצורך, על-ידי דחיפת רצועת הכלים בעדינות למרכז. לאחר יישוב הסרטים על משטח הוופל, המשיכו להתנקז עד שהמים הנותרים נסוגים לחלוטין מהאגן. הערה: אם לא משתמשים בסכין ATS של נסיגה במים התחתונים, הפחיתו בזהירות את המים מצדי סכין ה- ATS כדי לא לגרום למערבולת.</li>
		<li>השאירו את החלקים על התמיכה בתוך האמבטיה כדי לאפשר יבש לחלוטין. בהתאם להידרופוביה של רמת התמיכה והלחות הסביבתית, המים יתאדו בקצב שונה(איור 2Div). חשוב לתת לדגימה להתייבש לאט כדי להפחית או להימנע לחלוטין מכל הקפלים על המדגם.</li>
		<li>מעבירים את הדגימה היבשה לקופסה סגורה היטב כדי להגן מפני זיהום לכלוך ומניחים אותה לתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. במידת הצורך, מקטעי כתם נגדי המשתמשים במתכות כבדות כדי לשפר את הניגודיות הכוללת.</li>
		<li>בסוף ההליך, לנקות בזהירות את הסכין בעקבות הוראות היצרן הערה: העברת מקטעים מרובים או טוריים על רקיק (איור 2E) בהשוואה להעברה ברשת חריצים (איור 2F) משנה לחלוטין את חוויית ההכנה ל- EM. המקטעים והאיסוף ללא הפרעה של המקטעים בתמיכה יחידה מפחיתים את כמות הטעויות הקשורות לסעיף ואיסוף מקטעים בתדירות גבוהה בסעיפים טוריים. המקבילה של 100 קטעים של 1000 מיקרומטר x 500 מיקרומטר שנאספו על רקיק אחד תואמת ל-33 רשתות חריץ(איור 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. תצפית לדוגמה
הערה: סעיף זה מתאר את שלביזרימת העבודה כפי שהם מיושמים באמצעות תוכנה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים ). כל תוכנה לרכישת תמונות בכל SEM המצוידת בגלאים הנכונים יכולה לשמש, עם זאת, פעולות המשתמש הספציפיות יהיו שונות ולעתים קרובות יהיו ידניות יותר.
<ol><li>השג מפה כוללת של תמונות SEM החושפת מיקומי מקטעים על הוופל. תמונת מצלמה אופטית מוכללת מסייעת בהגדרת פסיפס תמונת SEM המכסה רצועת כלים של מקטעים או את כל המקטעים. צור את הפסיפס על-ידי לחיצה וגרירה באמצעות העכבר ישירות על תמונת המצלמה של הדוגמה והתחל את הרכישה האוטומטית. הערה: הגדרות הדמיה גסות מאוד, כלומר, גודל פיקסל 1-2 מיקרומטר וזמן השתהות של 1 מיקרו μs מספיק. תהליך זה מומחש בחומר משלים (עמודים 2-7).</li>
	<li>אתר מקטעים באמצעות הפונקציה זיהוי אוטומטי של מאתר המקטעים או אתר אותם באופן ידני. מיקומי מקטעים וקווי מתאר מאוחזרים באופן אוטומטי באמצעות תוכנה זו בהתבסס על התאמת תמונה. להמחשה של תהליך זה, ראה חומר משלים (עמודים 8 – 15).</li>
	<li>במקרה שתמונות הסקירה הכללית אינן מציגות ROIs בבירור, השג תמונות ברזולוציה גבוהה יותר של מקטעים. השתמש בפונקציה 'תצוגה מקדימה של מקטע' כדי ליצור ולרכוש תמונות באופן אוטומטי. תהליך זה מומחש בחומר משלים, עמודים 16-18. יש לבחור הגדרות הדמיה בהתאם לאופי ולגודל של ה- ROI שהמשתמש מחפש.<ol>
<li>כדי למצוא הגדרות אופטימליות, הפעל את הדמיה חיה בתוכנת בקרת המיקרוסקופ ונווט אל עלה על תנאי אחד. שנה הגדרות הדמיה עד שהתמונות יראו ROIs בבירור, אך רכישת התמונה אינה ארוכה מדי.</li>
	</ol></li>
	<li>הגדרת אזורי הדמיה הערה: מוצעות מספר אסטרטגיות שונות.<ol>
<li>אם יש להצטייר רק מקטעים ספורים, השתמש בתמונות של מקטעים שנוצרו עד כה לניווט למקטעים הרלוונטיים והשתמש במציג הניתן להגדלה המציג את כל התמונות שנרכשו במיקומים היחסיים המקוריים שלהם כדי להסתכל על כל המקטעים. לאחר שנמצא מקטע שיש לדמיין ברזולוציה גבוהה, צור אזור הדמיה בלחיצה וגרור. בחר הגדרות הדמיה ברזולוציה גבוהה ואחסן את ההגדרות בתבנית. השתמש מחדש בתבנית זו עבור מקטעים נוספים.</li>
		<li>כדי למצוא אירועים קטנים או קשים במיוחד לזיהוי אירועים נדירים, השתמש בגישה של סינון לרוחב. צור באופן ידני אזור הדמיה עם הגדרות הדמיה ברזולוציה גבוהה בכל מקטע עשירי או במקטע אחד לכל רצועת כלים ורכוש את התמונות. סקור את התמונות וסמן מקטעים המכילים את ה- ROI בתוכנה או שרשום הערה.<ol>
<li>החל מקטעים המכילים את ה- ROI, נווט קדימה ואחורה דרך ערכת המקטעים וצור אזורי הדמיה ברזולוציה גבוהה באותם מיקומים יחסיים כל עוד המבנה עדיין גלוי במקטע. ניתן לעשות זאת באופן ידני או באמצעות ההליך המתואר בשלבים הבאים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>השג תמונות ביותר מעשרה מקטעים רצופים. לחץ על התחל עידון מיקום לאחר שינוי גודל התצוגה של התמונה כדי להגביר את הדיוק של מיקומי מקטע רשומים כמתואר במדריך. פעולה זו מקטינה את השונות במיקום של סדרות תמונות. ההליך מאויר ומוסבר בעמודים חומריים משלימים 19-21.</li>
		<li>לחץ וגרור בכל מקטע כדי להגדיר אזור הדמיה תוך החזקת מקש Alt לחוץ ובחר צור מערך אריחים מהתפריט תלוי ההקשר שנפתח בעת שחרור לחצן העכבר. לאחר מכן התוכנה יוצרת אזורי הדמיה באותו מיקום יחסי בכל המקטעים שנמצאו או סומנו בעבר. ניתן להגביל את ההדמיה לטווח מסוים של מקטעים באמצעות המחוון טווח מקטע. הערה: ניתן לחזור על הליך זה עם כל מספר של אזורי הדמיה ולכן מאפשר הקלטת תמונות קטנות רבות ברזולוציה גבוהה במקום להקליט תמונה אחת גדולה יותר בכל מקטע.</li>
		<li>לאחר יצירת, הגדר ספירת פיקסלים, גודל פיקסל, פריסת אריחים, זמן השתהות פיקסלים וכו 'בכל סדרת תמונות לפי הצורך. לאחר יצירת וגדרות של סדרות הדמיה, כולן מופיעות בסימן עבודה.</li>
	</ol></li>
	<li>קביעת תצורה של פונקציות אוטומטיות והתחלת רכישת תמונות<ol>
<li>צור סדרת תמונות נפרדת עבור פונקציות אוטומטיות באותה שיטה כפי שתאר בשלב הקודם. הזז את סידרת התמונה למיקום במקטע המכיל מבנים בעלי ניגודיות גבוהה.</li>
		<li>הגדר את סדרת התמונות ל- 1024 x 884 פיקסלים ובחר גודל פיקסל המתאים לרזולוציה הגבוהה ביותר ששימשה בסדרת התמונות שהוגדרה בשלבים הקודמים. ברשימת הפונקציות האוטומטיות, סמן את המוקד האוטומטי ואת הסטיגמה האוטומטית.</li>
		<li>בחר לפי מקטע בפקדי רצף הרכישה וודא שתמונת הפונקציות האוטומטיות היא הפריט הראשון ברשימה. התחל את רכישת התמונה על-ידי לחיצה על לחצן הפעל לצד אות המשימה. הליכים אלה מודרים בחומר משלים, עמודים 22-23. הערה: אין צורך להתמקד באופן ידני מראש בכל מקטע. במהלך הפעלת ההקלטה, בכל פעם שהמיקרוסקופ מתקדם למקטע חדש, הפונקציות האוטומטיות יבוצעו לפני שכל התמונות האחרות ועלטו במקטע זה.</li>
	</ol></li>
</ol>4. יישור וניתוח נתונים
<ol><li>ייצוא נתונים<ol>
<li>ודא שהנתונים נשמרים בתבנית .tif, כך שאין צורך בפונקציית ייצוא ייעודית. מיין נתונים למבנה תיקיות המתאים ישירות לשכבות ולרכיבים בעץ השכבות.</li>
		<li>לאחר שתועדו פסיפסי תמונה, השתמש בפונקציה StitchAll כדי לתפור באופן אוטומטי את כל האריחים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יישור וחיתוך מחסנית בפיג'י הערה. ניתן להשתמש בחבילות תוכנה רבות (בחינם ובמסחריות) כדי לעבוד עם נתוני טומוגרפיה של Array. השלבים שלהלן מוצגים עם תוכנית קוד פתוח פיג'י32 כי הוא זמין באופן נרחב ומכיל את כל הפונקציות הנדרשות.<ol>
<li>יבא ערימה של תמונות (או תמונות תפורות) לפיג'י כערימה וירטואלית.</li>
		<li>אם יש לנרמל ניגודיות/בהירות, בחר ניגודיות משופרת... מתפריט תהליך. הגדר פיקסלים רוויים ל- 0.1 או פחות, ובדוק את עבד את כל הפרוסות.</li>
		<li>מתפריט תוספים, בחרו 'רישום | יישור מחסנית ליניארית עם SIFT.</li>
		<li>בחרו 'קשיח' או 'אפין' מהתפריט הנפתח 'המרה צפויה'. אחרת, שמור על הגדרות ברירת המחדל. התחל את היישור על-ידי לחיצה על אישור. הערה: טעינת הנתונים כערימה וירטואלית מאפשרת לפיג'י לטפל בערימות בכל גודל. הפלט של היישור נוצר ב- RAM; עם זאת, פעולה זו יכולה להגביל את הגודל המרבי של ערימות שניתן לעבד. במקרה זה, השתמש באפשרות רשום פרוסות מחסנית וירטואלית, שהוא יישום תיקיה לתיקיה של אותו אלגוריתם רישום. לאחר השלמת ההרשמה, טען את נתוני הפלט כערימה וירטואלית.</li>
		<li>חתוך את מחסנית התמונות על-ידי לחיצה על חתוך כך שתכיל רק את ה- ROI.</li>
		<li>שמור את המחסנית כתמונה .tif בודדת או כסדרה של תמונות .tif. הערה: שלבים קריטיים של טומוגרפיה של מערך מוצגים באיור 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Luckner, M., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+light+microscopy+to+analytical+scanning+electron+microscopy+(SEM)+and+focused+ion+beam+(FIB)/SEM+in+biology:+Fixed+coordinates,+flat+embedding,+absolute+references.">From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+electron+microscopy+volume+of+the+brain+of+adult+Drosophila+melanogaster.">A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster.</a> Cell. 174 (3), 730-743 (2018).</li><li>Mulcahy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+volume+electron+microscopy+of+the+caenorhabditis+elegans+nervous+system.">A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system.</a> Frontiers in Neural Circuits. 12, 94 (2018).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+molecules+and+cells.">Electron tomography of molecules and cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).</li><li>Hoog, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+interphase+microtubules+in+fission+yeast+analyzed+by+electron+tomography.">Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography.</a> Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).</li><li>Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+studies+of+eukaryotic+cells+by+cryo-electron+tomography.">Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography.</a> Cells. 8 (1), 57 (2019).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+(S3EM)+on+silicon+wafers+for+ultra-structural+volume+imaging+of+cells+and+tissues.">Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues.</a> PLoS One. 7 (4), 35172 (2012).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).</li><li>Kubota, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+nanotube+tape+for+serial-section+electron+microscopy+of+brain+ultrastructure.">A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure.</a> Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).</li><li>Wacker, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+Hierarchical+Imaging+of+Serial+Sections+for+Finding+Specific+Cellular+Targets+within+Large+Volumes.">Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57059 (2018).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Templier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MagC,+magnetic+collection+of+ultrathin+sections+for+volumetric+correlative+light+and+electron+microscopy.">MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy.</a> Elife. 8, 45696 (2019).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).</li><li>Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+EM-based+reconstruction+of+the+interglomerular+projectome+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).</li><li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology:+Applications+and+technology.">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).</li><li>Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIB-SEM+tomography+in+biology.">FIB-SEM tomography in biology.</a> Methods in Molecular Biology. 1117, 541-558 (2014).</li><li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging.">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, 25916 (2017).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+cluster+ion+beam+SEM+for+imaging+of+large+tissue+samples+with+10+nm+isotropic+resolution.">Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution.</a> Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).</li><li>Maco, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+in+vivo+2+photon+and+focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+of+cortical+neurons.">Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons.</a> PLoS One. 8 (2), 57405 (2013).</li><li>Russell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+microscopes:+3D+correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+of+complex+biological+structures.">Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures.</a> Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).</li><li>Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+for+observing+the+three-dimensional+ultrastructure+of+membranous+cell+organelles+in+relation+to+their+molecular+components.">Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).</li><li>Peddie, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+and+integrated+light+and+electron+microscopy+of+in-resin+GFP+fluorescence,+used+to+localise+diacylglycerol+in+mammalian+cells.">Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).</li><li>Markert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+subcellular+localization+with+superresolution+array+tomography+on+ultrathin+sections+of+various+species.">3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species.</a> Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).</li><li>Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+precise+and+rapid+mapping+protocol+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+small+invertebrate+organisms.">A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms.</a> Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).</li><li>Kolotuev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+correlative+anatomy+of+invertebrate+model+organisms+increases+efficiency+of+TEM+data+production.">Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).</li><li>Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+acetylcholine+signaling+through+a+muscarinic+receptor+regulates+cell+migration.">Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster.">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li><li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis.">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+asymmetric+stem+cell+division.">Mechanisms of asymmetric stem cell division.</a> Cell. 132 (4), 583-597 (2008).</li><li>Daniel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+septate+junctions+assembly+and+completion+of+cytokinesis+in+proliferative+epithelial+tissues.">Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues.</a> Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).</li><li>Pasquettaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peculiar+protrusions+along+tanycyte+processes+face+diverse+neural+and+non-neural+cell+types+in+the+hypothalamic+parenchyma.">Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2020).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+image+browser:+A+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets.">Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li></ol>

המחבר טילמן פרנקה הוא עובד של תרמו פישר המייצר מיקרוסקופים אלקטרונים ותוכניות פיילוט המשמשים במאמר.

מיקרוסקופיית אלקטרונים נותנת תובנה על המבנה האולטרה-מבני של התאים והאורגניזמים, שעבורם לעתים קרובות רצוי לדמיין מבנים בעלי עניין בהקשר התלת-ממדי שלהם. למרות טקטיקות EM רבות לניתוח אולטרה-מבני, עדיין אין פתרון "תקן זהב". הסיבה העיקרית היא מגוון רחב של דגימות, שאלות ביולוגיות רבות, אשר לעתים קרובות דורשים גישה מותאמת אישית. זרימת העבודה המוצעת של AT נועדה למזער את הזמן הדרוש לעיבוד לדוגמה, רכישת נתונים, הערכה ואחסון. יתר על כן, הסכין שונה מספק כלי מועיל כדי לפשט את רכישת המערך. הפריסה הקומפקטית של מקטעים על ופלים נוחה, הן לתצפית והן לאחסון הבא של הדגימות. סידור זה מאפשר "הקרנה לרוחב" של דוגמאות על-ידי מעבר אופקי מרצועת הכלים לרצועת הכלים וסריקת מקטע אחד בלבד בכל אחת מהן, מה שמקצר באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי להתאים את ההפחתה ל- ROI. תרחישי רכישת נתונים מוצעים מקלים על פילוח אזורים קטנים ומופצים באופן אקראי. לאחר שנמצא, AT/SEM מגביל הדמיה ברזולוציה גבוהה בדיוק לנפח העניין, בין אם בוצע באופן ידני או בעזרת פונקציה אוטומטית. ניתן להשלים את AT עבור אמצעי אחסון מוגבלים באופן ידני, כאשר האופרטור מנווט בין המדגם ומגדיר אזורי הדמיה בזה אחר זה. המודול האוטומטי של התוכנה מספק אסטרטגיית רכישת תמונה גמישה להדמיה של אזורים קטנים בחלקים גדולים. האוטומציה בתוכנה זו מאפשרת הקלטת תמונות גדולות ברזולוציה גבוהה על מאות מקטעים, השגת אמצעי אחסון דומים כמו SBFI. הקלטת תמונות מבט כולל של כל המקטעים מפשטת את לוקליזציה של ROI ומפחיתה את הזמן המושקע במיקרוסקופ. מכיוון שהסעיפים אינם נפגעים במהלך ההקלטה של סקירות ותצוגות מקדימות ברזולוציה גבוהה יותר, AT/SEM מאפשרת שימוש חוזר במדגם כדי לאסוף נתונים נוספים של החזרי שוק חוץ אחרים או ברזולוציה גבוהה יותר.
זמן רכישת תמונה הוא אחד ההיבטים החשובים (והיקרים ביותר) של 3D EM ולכן יש לקחת בחשבון בעיצוב הניסוי. אמנם אין זה מפתיע כי הדמיה אזורים גדולים לוקח יותר זמן מאשר הדמיה אזורים קטנים, קל להעריך את ההשפעה: בהתאם הפרמטרים הדמיה שנבחר, זמן הרכישה על כל סעיף יכול להשתנות משניות לשעות. פרמטרי הדמיה קריטיים כוללים את גודל שדה הראייה, הרזולוציה וזמן ההשתהות. בהנחה שאורוציית יעד של 10 ננומטר לפיקסל וזמן השתהות של 1 מיקרומטר, הדמיה של שדה של 20 מיקרומטר x 20 מיקרומטר, 100 מיקרומטר x100 מיקרומטר, או 500 מיקרומטר x500 מיקרומטר לוקח 4 שניות, 100 שניות או 2,500 שניות להקליט. אנו יכולים להכפיל את זמני ההדמיה לכל מקטע במספר המקטעים כדי להעריך את הזמן הנדרש עבור משימת ההדמיה המלאה. זמני הדמיה ארוכים לכל מקטע יכולים להיות מקובלים אם מספר המקטעים קטן או אם זמן כלי המיקרוסקופ אינו מדאיג.
עם זאת, יש צורך להגביל את זמן ההקלטה לעבודה לילה או עבודה בסוף השבוע ברוב המקרים. היבט קריטי באותה מידה של 3D EM שיש לקחת בחשבון, הוא הסכום והמבנה של נתוני התמונה המתקבלים. הקלטת שדות ההדמיה הנ"ל ב- 100 מקטעים יוצרת 400 mb, 10 gb או 250 gb של נתוני תמונה, בהתאמה; תמונות 500 מיקרומטר x 500 מיקרומטר מציבות את הבעיה הנוספת של להיות גדול מ 2 gb כל אחד. רבות מהתוכנות המשמשות להערכת נתונים אינן יכולות לפתוח תמונות בגודל זה.
כדי לקצר את זמן ההדמיה, חשוב לבחור זמן השתהות פיקסלים כדי לעמוד בדרישות יחס האות לרעש עבור הערכת הנתונים הבאה (לדוגמה, שחזור, מעקב) ולהגביל את ההקלטות להחזרי ROIs מוגדרים. הרחבת AT של התוכנה מאפשרת רכישת תמונה באזורים קטנים במקטעים סדרתיים. התוכנה תומכת בזרימות עבודה ידניות ואוטומטיות ובגרסאות חצי אוטומטיות רבות: ניתן למקם באופן ידני אזורי הדמיה ולהתמקד בכל מקטע, או שהמשתמש יכול להשתמש בתכונות של איתור המקטעים האוטומטי ותכונות יישור המיקום. בהתאם לרמת האוטומציה שנבחרה ונתמכת על-ידי סוג הדגימה או יעדי ההדמיה, הזמן הנדרש להגדרת רכישת תמונה במאות מקטעים יכול להימשך יום עבודה שלם (נעשה באופן ידני) או רק כמה דקות. באופן עקרוני, טומוגרפיה מערך עושה את זה מאתגר יותר מאשר שיטות EM 3D אחרות לרכוש ROIs קטנים; מיקום אזור לא מדויק במקטעים רצופים חייב להיות מתוגמל על-ידי רכישת שטחים גדולים יותר. לדוגמה, אם ה- ROI הוא בגודל של 20 מיקרומטר x 20 מיקרומטר והשונות מיקום מקטע למקטע של שדות הדמיה היא 10μm, יש לרכוש תמונות של 40 מיקרומטר x 40 מיקרומטר כדי לוודא שה- ROI נלכד במלואו בכל תמונה, בכל מקטע. השתנות מיקום התמונה בעולם האמיתי נעה בין 100 מיקרומטר ל-<10 מיקרומטר בהתאם לזמינות או לאיכות של תכונות תוכנה ליישור מיקום או סבלנות המשתמש. עם תוכנה זו, 10 מיקרומטר ניתן להשיג ללא התערבות ידנית רבה מדי ברוב הדגימות.
כמו כל טכניקה, ל- AT יש מספר נקודות תורפה שיכולות להשפיע על רכישת נתונים מוצלחת, ורבות מהן דומות לשיטות אחרות המבוססות על חתך. חוסר התפלגות הומוגנית של שרף ריק לעומת רקמה יכול לגרום מערכים מעוקלים או שבורים. במקרים קיצוניים, מקטעים יכולים להתנתק מהתמיכה (איור 6A). דחיסה משתנה או מתיחות במהלך תהליך החיתוך יכולות ליצור קפלים שיכולים לשבש את המדגם באזורים משתנים במקטעים הבאים(איור 6B). סימני סכין יכולים להופיע על פני השטח של החלקים שנאספו באמצעות סכין פגומה(איור 6C). הבדלים בתנאי החתך עלולים לגרום מדי פעם לדחיסת מקטעים ולהבדלי עובי. חלקיקי אבק או לכלוך יכולים לנחות על קטע ולטשטש חלקית את אזורהעניין (איור 6D). רכישת תמונה עלולה להיכשל עקב ניגודיות אוטומטית לא מושלמת, מיקוד אוטומטי ופונקציות סטיגמה אוטומטיות. המיקום של אזורי הדמיה שנוצרו באופן אוטומטי יכול להיות משתנה ועלול להיכשל בלכידת החזר על ההשתתפות בכל המקטעים.
מספר בעיות יכולות להתעורר בשלב של תפירה ויישור. התפירה האוטומטית של רכישות אריחי פסיפס עלולה להיכשל, למשל, בגלל השטח הריק הגדול בתוך המדגם. עקב שינוי דרסטי בצורת 3D, ערימות תמונה יכול להיות מאתגר להירשם. תוכניות שפותחו במיוחד (למשל, IMOD, פיג'י, TrackEM2, MIB או MAPS-AT) יכולות להקל על יישור חצי אוטומטי32,38,39,40. ניתן ליישר באופן ידני מקטעים מאתגרים יותר באמצעות תוכנת עריכת תמונות. למרבה הצער, ערכות נתונים מסוימות עשויות להיות בלתי אפשריות ליישר כראוי.
דוגמאות גדולות מאתגרות עבור מקטעים טוריים של TEM המתאימים לרשתות; מצד שני, פרויקטים רבים אינם מצדיקים רכישה אוטומטית ארוכה באמצעות FIB / SEM או SBF-SEM. ה- AT הוא חלופה פשוטה למקטע סידורי מייגע TEM שבו איסוף ומניפולציה של מקטעים סדרתיים על רקיק הם פשוטים יותר מאשר עם רשתות חריץ. פותחו מספר אסטרטגיות כדי להקל על איסוף המערכים, ואנו חולקים את השיטה שלנו להרחבת ארגז הכלים הקיים. במקרים שבהם זיהוי ההשקעה הוא מאתגר, AT-SEM מספק יתרון בסיסי, עם סינון יעיל של הדגימות שבהן נדרשת רזולוציה בקנה מידה של אברונים על פני 50 עד 500 מקטעים. עבור אמצעי אחסון גדולים יותר, ניתן לאסוף ביעילות את אסטרטגיות AT של האיסוף האוטומטי אם נדרשים מקטעים נוספים. ניתן לדמיין מחדש דגימות AT מספר פעמים, מה שמקל על הדמיה ממוקדת של אזורים ברזולוציה גבוהה בהתבסס על תמונות מבט כולל שנרכשו בעבר. אנו מאמינים כי ניתוח ממוקד ודגימה יתר מופחתת על ידי AT / SEM המוצע כאן מקטין את דרישות העבודה ואחסון הנתונים. בסופו של דבר, ניתן לאסוף ולתחזק ספריות של חלקים לשימוש חוזר מאוחר יותר וייעוץ. לרכישת נפח, גישות FIB או SBF-SEM מציעות פתרון מצוין בכל פעם שקל לזהות את ה- ROI על פני הבלוק או אם יש צורך באמצעי אחסון תלת-ממדיים גדולים לניתוח. עם זאת, FIB/SBF-SEM יעילים פחות כאשר יש לאסוף את תמונת המחסנית ברזולוציה גבוהה מהפחתה מוגדרת באופן ממוקד. לסיכום, השיטות המוצעות לסינון דגימות AT והשימוש בתמונות מבט כוללות ברזולוציה בינונית מאפשרים הגבלת רכישת תמונה לחלקים הרלוונטיים של מערך המקטעים. כוונה מדויקת של אזורי הדמיה מאיצה את הזמן לנתונים ומפשטת את הערכת הנתונים.
לסיכום, למרות הרעיון של AT / SEM אינו חדשני, השימוש בו עדיין אינו נפוץ כמו היתרונות שלה היה מציע. בסך הכל, הוא מספק הליך משלים לשיטות EM קיימות אחרות. AT/SEM תואם למגוון הרחב ביותר של פרוטוקולי הכנת מדגם וזרימות עבודה של הדמיה וניתן לבצע זאת בכל מיקרוסקופ FIB/SEM או SBF-SEM כאכניקה נלווית. במאמר זה, התרכזנו AT להקלטת נתונים אולטרה-מבניים מדגימות שפחות סביר שיטופלו בהצלחה בשיטות אחרות. אנו מקווים כי ההליך המתואר לאיסוף נוח של סעיפים ואסטרטגיות רכישה אוטומטיות במידה ניכרת יסייעו בניסיונות הראשונים עבור אלה שמעולם לא נתקלו בשיטה ויסייעו לשכלל אותה עבור אלה שכבר יש להם ניסיון כלשהו.

למרות החשיבות של טכניקות הקשורות ל- EM, המאמץ הנדרש כדי לשלוט בהם שומר על התחום כולו מוגבל למספר קטן של מומחים. קושי משמעותי אחד הוא זיהוי ואחזור של אזור עניין (ROI) בדגימות שנשמרו עבור EM. המראה של אותה מדגם שונה במידה ניכרת כאשר מנותח על ידי מיקרוסקופיה אופטית ולאחר עיבוד לתצפית EM. השינויים עבור דגימות מוכנות כימית כוללים התכווצות מדגם אניזוטרופי לאחר שלבי התייבשות (~ 10% בכל ממד) ואובדן פלואורסצנטיות בעת שימוש אוסמיום בפרוטוקול הקיבעון והכתמת (איור 1A). עבור החלק האולטרה-דק, הדגימות מוטבעות בשרף אפוקסי או אקרילי באמצעות אסטרטגיות שונות(איור 1B). לקבלת תוצאות מוצלחות של הכנה זו, המדגם כולו חייב להיות מחולק לחתיכות שאינן עולות על 1 מ"מ x 1 מ"מ. כדי לעמוד בדרישות התצפית הסטנדרטיות של מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM), חלק זעיר זה של המדגם מחולק עוד יותר לפרוסות בעובי 50-150 ננומטר. התמונות המתקבלות בגווני אפור מציגות ארגון רקמות ומבנה אברונים של שבריר דקה של המדגם כולו בפירוט רב יותר מכל טכניקת מיקרוסקופיה אחרת (איור 1C). ערכת נתונים טיפוסית של TEM מספקת מידע 2D, תיאורטית המוערך כדי להבין את התהליכים המתרחשים באופן טבעי בחלל תלת-ממדי בתאים וברקמות. איור 1D מציג את האתגר של רכישת כרכים אולטרה-מבניים: אם קובייה של צד 1,000 מיקרומטר נקטעת בעובי של 50 ננומטר, יידרשו 20,000 מקטעים כדי לכסות את כל הנפח; עבור קוביה צדדית של 500 מיקרומטר, זה יהיה 10,000 חלקים. כדי לכסות נפח של 50 מיקרומטר x 50 מיקרומטר, ייתכן שיהיה צורך בנפח של 1,000 מקטעים "בלבד". השגת נפח זה באופן ידני היא כמעט בלתי אפשרית ומאתגרת ביותר לביצוע עם אוטומציה. אם בנוסף לעומק המדגם, עלינו לכסות את כל פני השטח של קוביות היפותטיות כאלה, הכיסוי של משטח 1 מיקרומטר2 ברזולוציה סבירה הופך לבעיה לוגיסטית חמורה (איור 1E). בעוד שעבור פרויקטים בקנה מידה גדול יוצא דופן, כגון גישות קונטימיקה, מספר גדול של סעיפים הוא קריטי, עבור רוב הפרויקטים EM "שגרתי", יצירת חלקים נוספים הנדרשים לתצפית מהווה חיסרון משמעותי.
ישנן מספר שיטות לרכישת מידע אולטרה-מבני תלת-ממדי: חתך סדרתי של מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM), טומוגרפיה של TEM, טומוגרפיה של מערך (AT), הדמיית פנים בלוק טורית סורקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SBF-SEM) ומיקרוסקופיית אלקטרונים סריקת קרן יון ממוקדת (FIB-SEM). ההבדלים העיקריים בין שיטות אלה הם אסטרטגיית החלוקה והאם רכישת התמונה מצמידה לדור1סעיף . בחתך טורי TEM, מקטעים רציפים נאספים ברשתות חריץ, תמונות TEM נוצרות מרצפים אלה ומיושרות2,3,4,5. בטומוגרפיה של TEM, הטיית סדרות מקטעים של 150-300 ננומטר ברשת, וכאשר הם מצדים לחתך סדרתי, ספקו רזולוציה גבוהה מאוד, אם כי כרכים קטנים יחסית6,7,8. גישת AT משתמשת בחתך פיזי עם נימוסים ידניים וחצי אוטומטיים מגוונים של אוסף מקטעים על תמיכה גדולה יחסית, כגון כיסוי זכוכית, ופלים מסיליקון או קלטת מיוחדת. לרכישת תמונה, התמיכה מנותחת ב- SEM, עם אסטרטגיות רכישת תמונה מגוונות זמינות9,10,11,12,13,14,15 . עבור SBF-SEM, חתך פיזי מושג באמצעות מיני מיקרוטום עם סכין יהלום היישר בתוך תא SEM, עם תמונת SEM שנוצרה מפני השטח של בלוק השרף16,17,18,19. עבור FIB-SEM, מקור היונים מסיר שכבות דקות של המדגם, ואחריו הדמיה אוטומטית של המשטח החשוף על ידי SEM20,21. TEM-טומוגרפיה ו- AT יוצרים מקטעים פיזיים, שניתן לדמיין מחדש במידת הצורך, בעוד FSBF-SEM ו- FIB-SEM מבטלים את המקטע לאחר ההדמיה. שילוב עדכני של מקטעים פיזיים שצוטטו על ידי SEM מרובה קורות מספק שילוב של שיטות שפותרות את בעיית "צוואר הבקבוק" של מהירות רכישתהתמונה 22. כל אחת מהטכניקות הללו חוללה מהפכה באופן שבו ניתן להשיג ולנתח נתוני EM, ולכל גישה יש השפעות מעשיות הקשורות לשאלת מחקר נתונה.
בהתחשב באופי ההכנה ובהיקף הממדים האולטרה-מבניים, אין זה פשוט לחזות היכן ממוקם מבנה יעד ספציפי בבלוק המדגם (איור 1D,E). פתרון אחד עבור לוקליזציה ROI הוא הקלטת התמונות מכל הבלוק ברזולוציה הרצויה מההתחלה. המבנים מעניינים יכולים להיות בנפח הנתונים שנרכש כאשר הם רחוקים מהמיקרוסקופ. זמן הרכישה וטיפול בנתונים המשויכים לאסטרטגיה זו הם בעייתיים. רצוי להפחית את כמות הנתונים המתועדים, במיוחד אם החזר על שוק ההון הם הרבה יותר קטנים מאשר בלוק הרקמה, כלומר, אם האובייקטים של עניין הם סוגים ספציפיים של תאים (לא איברים שלמים). טכניקות מיקרוסקופיות שונות של אור ואלקטרון (CLEM) יכולות להצליח כאשר הפלואורסצנטיות נשמרת ומקומת לפני או אחרי ההכנה באותה מדגם23,24,25,26,27,28,29. עם זאת, מבנים תאיים רבים ניתנים לזיהוי גם ללא מתאם פלואורסצנטיות, רק על סמך המבנה האולטרה ידוע. במקרים אלה, אנו מאמינים כי טומוגרפיה של מערך ההקרנה לרוחב מספקת החלפה מאוזנת בין המאמץ שהושקע בוקליזציה של ROI לבין איכות המידע האולטרה-מבנית. באמצעות אסטרטגיה זו, תת-קבוצה של מקטעים על הוופל נבדקים במרווחי זמן קבועים, אשר ניתן לקבוע בהתבסס על גודלו ואופיו של ROI. לאחר שנמצאים החזרי השקעה, רכישת נתונים מוגדרת בסדרה רציפה של מקטעים שמתחילים לפני ומסתיימות לאחר סעיף העוגן, ואוספים את המידע הרלוונטי באופן ממוקד.
אנו מציגים פרוטוקולים עבור AT המפשטים ומאיצים את רכישת אזורים או אירועים בעלי עניין במקטעים רבים ומניבים נפחי תמונה מיושרים יותר. סינון רוחבי ורכישה מרובתstep מייצרים נתונים ברזולוציה גבוהה מאוד באזורים ממוקדים בדיוק. ההליך שאנו מתארים מטפל במספר אתגרים של רכישת נתונים EM תלת-ממדיים, כפי שהוא מספק: תאימות למגוון רחב של דגימות מבלי לשנות מהיסוד את זרימת העבודה של הכנת המדגם; לוקליזציה ממוקדת עבור רכישות חתך ו- SEM; זמן ומאמץ מופחתים במהלך ההתקנה; הדמיה של אזורים במקטעים מרובים עם יישור טוב יותר של אמצעי האחסון המתקבלים; והליך תפירה ויישור חלק כדי להדר תמונות שונות לתמונת פסיפס תפורה. בחרנו להפגין את עוצמת השיטה שלנו עם מספר דוגמאות מפרויקטים שפורסמו ומתמשכים. אנו מאמינים כי גישה זו יכולה להקל באופן משמעותי על ייצור ורכישה של נתוני EM ממוקדים, גם עבור חוקרים עם ניסיון EM מוגבל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AT sectioning knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUATS3530</td>
			<td>Diatome Jumbo knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td>Diatome trimming 20&#176; 
			Glass knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16015</td>
			<td>Resistance: 1-30 Ohms 
			Type P: (Boron) (1 primary flat) 
			Roughness: 2 nm 
			No SiO2 top coating 
			TTV: = &#60;20 &#181;m 
			Wafer is polished on one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer cleaving kit</td>
			<td>EMS</td>
			<td>7642</td>
			<td>EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Thermo Fischer Helios</td>
			<td>1072419</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maps 3 for SEM with Correlative Workflow &#38; Array Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1135932</td>
			<td>Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira x.y</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131599</td>
			<td>Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td>IMOD, MIB (See text for refferences)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy

מיקרוסקופיית אלקטרונים מיושמת בביולוגיה וברפואה להדמיה של פרטים תאיים ומבניים ברזולוציית ננומטר. מבחינה היסטורית, מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM) סיפקה תובנה על מבנה תאים, אך בעשור האחרון, הפיתוח של מיקרוסקופים אלקטרונים סריקה מודרניים (SEM) שינה את הדרך להסתכל בתוך התאים. למרות שהרזולוציה של TEM עדיפה כאשר יש צורך בפרטים מבניים ברמת החלבון, רזולוציית SEM מספיקה לרוב השאלות הקשורות לביולוגיה של התא ברמת האברונים. ההתקדמות בטכנולוגיה אפשרה פתרונות אוטומטיים לרכישת נפח כגון הדמיית פנים בלוק טוריות (SBF-SEM) וקרן יון ממוקדת SEM (FIB-SEM). עם זאת, עד היום, שיטות אלה נשארות לא יעילות כאשר הזיהוי וניווט לתחומי עניין הם קריטיים. ללא האמצעים לוקליזציה מדויקת של אזורי יעד לפני ההדמיה, המפעילים צריכים לרכוש הרבה יותר נתונים ממה שהם צריכים (ב- SBF-SEM), או גרוע מכך, להכין רשתות רבות ולצלם את כולם (ב- TEM). אנו מציעים את האסטרטגיה של "סינון לרוחב" באמצעות טומוגרפיה מערך ב- SEM, המאפשרת לוקליזציה של תחומי עניין, ואחריו הדמיה אוטומטית של החלק הרלוונטי של נפח המדגם הכולל. דגימות טומוגרפיה של מערך נשמרות במהלך ההדמיה, וניתן לסדרן בספריות מקטעים המוכנות להדמיה חוזרת. מספר דוגמאות מוצגות שבהן סינון רוחבי מאפשר לנו לנתח פרטים מבניים מאתגרים להפליא לגשת אליהם בכל שיטה אחרת.

Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

אנו מתארים את הכנת רצועות של מקטעים טוריים ואת האוסף שלהם על תמיכה בהעברה גדולה לשימוש כדגימות טומוגרפיה של מערך, יחד עם הליכי הדמיה אוטומטיים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. הפרוטוקול מאפשר סינון, אחזור והדמיה ממוקדת של אירועים מקומיים ונדירים ורכישת אמצעי אחסון גדולים של נתונים.

זרימת עבודה טומוגרפיה של מערך לרכישה ממוקדת של מידע אודות אמצעי אחסון באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

ניתוח מיקרוסקופיה אלקטרונית הוא לעתים קרובות מורכב. אנו מאמינים כי הפרוטוקול שלנו מאפשר עיבוד ורכישה של נתוני EM מפני השטח הדגימה הגדולה ונפח הביניים. הפרוטוקול שלנו עוזר למצוא מבני יעד במקטעים סידוריים.הקלטת נתונים מוגבלת למה שנחוץ. בהשוואה לרכישת נתונים בלוקים של רקמות שלמות, זמן ההקלטה מצטמצם וניתוח נתונים קל יותר. בהתחשב בקלות הכוללת של הגישה, אנו מאמינים כי ניתן להשתמש בה כדי לטפל לא רק בשאלות מדעיות, אלא גם ככלי אבחון.כדי ליצור מערך לניתוח, תחילה להדק את המדגם על מחזיק ultramicrotome ולהשתמש סכין גילוח כדי לקצץ בערך את השרף סביב המדגם. השתמש בכלי חיתוך יהלום כדי לקצץ דק את הדגימה ולהשתמש בסכיני חיתוך של נטייה של 20 או 90 מעלות כדי להבטיח שהמשטחים העליונים והתחתוניים של הבלוק מקבילים לחוד החנית של הסכין. מערבבים קסילן ודבק בפרופורציה של 3:1 ומשתמשים בריס המחובר לקיסם כדי להחיל את התערובת על הקצוות העליונים והתחתונים של הבלוק החתוך.בזמן שהתערובת מתייבשת, השתמשו בכלי מחשוף רקיק כדי לחתוך חתיכת רקיק לגודל המתאים לניתוח. נקו את הוופל במים מזוקקים כדי לשטוף את כל הפסולת ולנקות את פני השטח עם פלזמה לאחר שהוופל יבש. להכנת סכין טומוגרפיה מערך, השתמשו בסרט דביק מוקצף כדי לחבר מחט לתחתית סכין היסטו ג'מבו ומניחים את הסכין במחזיק המיקרוטומי האולטרה באפס מעלות.התאימו את קצה הסכין במקביל למשטח הבלוק והבנו את הבלוק החתוך לקצה הסכין בתנוחה המוכנה לחיתוך. מניחים את הוופל הנקי לתוך אגן הסכין וממלאים את האגן במים באותה רמה כמו קצה הסכין, ולאחר מכן, תן לקצה היהלום של הסכין לח כראוי, תוך שימוש במזרק המצורף כדי להוסיף או למשוך מים לפי הצורך. עבור חתך מערך, להגדיר את microtome לטווח חיתוך של 50 עד 100 ננומטר ומהירות חיתוך של 6 עד 1 מילימטרים לשנייה, ולהתחיל לחתוך כדי לקבל סרט ארוך מספיק כדי לכסות נפח Z ממוקד.בהתאם לגודל הבלוק, הומוגניות של הרקמה, וסוג של שרף, הסרט יהיה ישר בקירוב. השתמש בקצה נקי ולא דביק של ריס כדי לנתק את הסרטים מקצה הסכין. השתמש בריסים כדי להזיז בעדינות את רצועת הכלים למרכז מדיום התמיכה.כלורופורם או עט חימום ניתן להשתמש כדי למתוח את החלק במידת הצורך. לאחר מתיחה, לחזור המזרק כדי להתחיל לנקז את המים. עבור סרטים עדינים יותר, או נסיגה איטית יותר במים, לנתק את המזרק מן הצינור כדי לתת למים לטפטף.כאשר מפלס המים מגיע לרמת הוופל, דוחפים בעדינות את הסרט למרכז האגן וממשיכים להתנקז עד שכל המים הנותרים מוסרים לחלוטין מהכיור. תן לוופל להתייבש בסביבה נקייה. הייבוש אורך כ-30 דקות.כאשר המדגם מיובש לחלוטין, להעביר את המערך לתיבה סגורה היטב כדי להגן עליו מפני זיהום לכלוך. ומניחים את הקופסה בתנור 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. כדי לקבל מפת מבט כולל של תמונות SEM החושפת מיקומי מקטעים על הוופל, השתמש במצלמה האופטית המובנית כדי להשיג תמונת SEM המכסה רצועת כלים של מקטעים.ליצירת פסיפס, לחץ וגרור את תמונת המצלמה של הדוגמה והתחל את הרכישה האוטומטית. קבל סקירות כלליות ברזולוציה גבוהה יותר כדי למצוא מבני יעד. אם יש להצטייר רק מקטעים ספורים, השתמש במציג הניתן להגדלה כדי להציג תמונות שנרכשו במיקומים המקוריים שלהם.לאחר שזוהה מקטע שיש לדמיין ברזולוציה גבוהה, לחץ וגרור כדי ליצור אזור הדמיה ולאחר מכן בחר הגדרות הדמיה ברזולוציה גבוהה ואחסן את ההגדרות בתבנית כדי למצוא אירועים נדירים קטנים במיוחד או קשים לזיהוי, השתמש בהגדרות ההדמיה ברזולוציה גבוהה בכל מקטע עשירי או במקטע אחד לכל רצועת כלים כדי ליצור באופן ידני אזור הדמיה ולהשיג את התמונות. לאחר מכן סקור את התמונות וסמן מקטעים המכילים את אזור העניין. כדי להשיג יותר מ- 10 מקטעים רצופים, השתמש ב מאתר המקטעים כדי לאתר את כל המקטעים באופן אוטומטי.אם תמונות הסקירה הכללית אינן מציגות אזורים מעניינים ברורים, רכשו תמונות ברזולוציה גבוהה יותר של המקטעים והשתמשו בפונקציית התצוגה המקדימה של המקטע כדי ליצור ולרכוש את התמונות באופן אוטומטי. כדי לקבוע את הגדרות ההדמיה האופטימליות, הפעל את ההדמיה החיה בתוכנת בקרת המיקרוסקופ ונווט לאזור אחד של עניין, ולאחר מכן התאם את הגדרות ההדמיה עד שהתמונות יראו אזורים ברורים של עניין, אך ללא רכישת תמונה ארוכה מדי, בהתאם להנחיות היצרן. כדי למטב את המיקום של אזורי ההדמיה במקטעים רצופים, שנה גודל תצוגה לתמונה של עניין ולחץ על התחל עידון מיקום כדי להגביר את הדיוק של מיקומי מקטעים רשומים.להגדרת אזור הדמיה, לחץ וגרור מקטע כלשהו תוך החזקת מקש Alt לחוץ ובחר צור מערך אריחים מהתפריט הנפתח תלוי ההקשר. התוכנה תיצור אזורי הדמיה באותו מיקום יחסי בכל המקטעים שנמצאו או סומנו בעבר. לאחר מכן קבעו את ספירת הפיקסלים, גודל הפיקסלים, פריסת הריוח וזמן השתהות הפיקסלים בכל סדרת תמונות לפי הצורך.כדי לקבוע את תצורת הפונקציה האוטומטית, צור סידרת תמונות נפרדת עבור פונקציות אוטומטיות כפי שהודגם, והעבר את סידרת התמונות למיקום במקטע המכיל מבנים בעלי ניגודיות גבוהה. הגדר את סדרת התמונות ל- 1024 x 884 פיקסלים ובחר גודל פיקסל המתאים לרזולוציה הגבוהה ביותר המשמשת בסדרת התמונות. ברשימת הפונקציות האוטומטיות, סמן את המוקד האוטומטי ואת הסטיגמה האוטומטית.בחר Bisection בפקדי רצף הרכישה ואשר שתמונת הפונקציה האוטומטית היא הפריט הראשון ברשימה ולאחר מכן לחץ על השג הכל כדי להתחיל ברכישת התמונה. כאשר כל סדרות ההדמיה נוצרו והוקמו, הסידרה תופיע בתור משימות. רכישה ברזולוציה נמוכה יכולה להתבצע באופן ידני או אוטומטי ישירות בחלקים נבחרים של המקטע או במקטע שלם באמצעות הדמיית פסיפס יחיד או פסיפס, ואחריו תפירה.לאחר מכן ניתן לרכוש תמונות מהאזור שנבחר באמצעות פרמטרים ברזולוציה גבוהה כדי לדמיין מיטוכונדריה, גרעינים ומיקרובילי, לדוגמה, לאחר הרכישה האוטומטית של מפות פסיפס שנפתרו, ניתן לחתוך או להשתמש בכמה אזורים מעניינים כדי להגדיר אזורי הדמיה מקומיים נוספים בתוך האזורים. למרות סוגי תאים מיוחדים שונים במעי Drosophila מופצים באופן אקראי, הם יכולים להיות מובחנים חזותית לאחר הקרנת התמונות באמצעות פרמטרים ברזולוציה גבוהה, או מקטעים בודדים או כאוסף של תמונות סדרתיות. לאחר היישור, ניתן לעבד את הערימות באמצעות פתרונות תוכנה שונים.ניתוח טומוגרפיה של מערך מאפשר ליצור מקטעים רציפים רבים על הוופל היחיד, ולהיבדק באמצעות פרמטרים ברזולוציה נמוכה כדי להתאים את תחומי העניין הכלליים. ניתן למקד אזורים אלה לניתוח נוסף באמצעות פרמטרי רכישה מתקדמים. לדוגמה, חלוקות מיטוטיות ב notum אינם קלים לוקליזציה ברמה האולטרה מבנית, שכן התאים גדולים יחסית לעומת אזור ההימנעות.עם זאת, באמצעות שיטה זו, ניתן להשתמש בתמונות הסקירה האוטומטיות ברזולוציה בינונית של הקפיצות של 20 עד 40 מקטעים כדי להתאים את התאים המפרידים לשפות שונות. הליך טומוגרפיה של המערך מספק ניתוח נתוני מיקרוסקופיה אלקטרונים פשוט יותר. אנו מעודדים את הצופים להשקיע בשליטה על ההתחדשות ובהיכרות עם זרימת העבודה הקשורה למפות מניסיוננו, מעטים נושאי המחקר הדורשים ניתוח אולטרה מבני של בעלי חיים שלמים או איברים שלמים.השיטה שלנו מסייעת עם לוקליזציה מהירה של תאים ושותפי אינטראקציה שלהם ברקמות.

Research

JoVE Journal

Biology

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

סטנדרטי שיטה לניתוח של תאי הכבד סינוסי האנדותל וFenestrations על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק הפרוטוקולים (SEM) עבור בעייתי הצמח, Oomycete, וכן דוגמאות פטרייתיים

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

חוקרים את מזיקה אפקטים של נמוך לחץ פלזמה עיקור על ההישרדות של Bacillus subtilis הנבגים באמצעות Live התא מיקרוסקופ

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

הכנה של אורגניזמים Prokaryotic ו האיקריוטים באמצעות ייבוש כימיים עבור ניתוח מורפולוגי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

לימודי ממוקדות באמצעות פנים בלוק טורי וקרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

סריקת בלוק-פנים טורית מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) של דגימות רקמה ביולוגית

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...