Name: array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 47 s
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Vogliamo ringraziare i membri della struttura EM dell'Università di Losanna per il loro supporto durante questo sviluppo di diverse fasi della procedura AT. Vorremmo ringraziare Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O'Brien e Lindsay Lewellyn per le discussioni durante la preparazione del manoscritto e la lettura critica. Vogliamo riconoscere i gruppi che hanno contribuito con i campioni utilizzati per dimostrare i diversi scenari: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat e Fanny Langlet.

NOTA: I metodi di preparazione dei campioni sono descritti altrove14,30,31e non sono trattati in questa pubblicazione. In breve, gli esempi mostrati sono stati fissati chimicamente con glutaraldeide, post-fissati con OsO4 all'1%,quindi trattati con acetato di uranile acquoso all'1% prima di incorporarlo nella resina incorporata. In alternativa, i campioni possono essere preparati utilizzando il congelamento ad alta pressione, il congelamento sostituito con lo 0,1% di acetato di uranile nell'acetone e incorporato in resina acrilica. I blocchi campione sono stati preparati utilizzando un metodo di incorporamento piatto che consente una visione chiara del campione, facilitandone l'orientamento per il sezionamento (Figura 1B).
1. Procedura di generazione dell'array
<ol><li>Orientamento e rifilatura del campione incorporati<ol>
<li>Utilizzando il binocolo/microscopio, identificare e contrassegnare il ROI sulla superficie del blocco incorporato graffiando leggermente la superficie del blocco con una lama di rasoio. Ciò contribuirà a orientare il campione all'interno dell'ultramicrotomo e ridurrà la superficie di sezionamento.</li>
		<li>Bloccare il campione sul supporto dell'ultramicrotomo (Figura 2A).</li>
		<li>Tagliare la resina attorno al campione, prima con la lama del rasoio (rifilatura ruvida) e continuare con lo strumento di rifilatura diamantata (rifilatura fine; Figura 2A). Utilizzare coltelli con inclinazione del bordo di 20° o 90° per garantire che le superfici superiore e inferiore del blocco siano parallele al tagliente del coltello. NOTA: questo passaggio è fondamentale per il sezionamento seriale e l'acquisizione di nastri dritti.</li>
		<li>Mescolare xilene e colla in proporzione 3:1. Con una ciglia attaccata a uno stuzzicadenti, applicare questa miscela sui bordi superiore e inferiore del blocco tagliato. Lasciare asciugare accuratamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il supporto di montaggio dell'array A (ad esempio, wafer di silicio).<ol>
<li>Tagliare il pezzo di wafer utilizzando uno strumento di scissione del wafer (EMS), regolandone le dimensioni in base all'obiettivo del progetto. 2 cm x 4 cm è conveniente sia per le osservazioni al microscopio ottico che elettronico.</li>
		<li>Pulire il wafer in acqua distillata per eliminare i detriti.</li>
		<li>Glow discharge/plasma pulisce la superficie utilizzando apparecchiature standard. I parametri precisi dipenderanno dalla macchina utilizzata. Inizia con i parametri per lo scarico delle griglie e regola empiricamente il tempo. Questo passaggio è fondamentale per una buona diffusione delle sezioni sul supporto mentre le sezioni si stanno asciugando e non devono essere omesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il supporto di montaggio degli array B (ad esempio, coperchio in vetro)<ol>
<li>Se si pianificano esperimenti di immuno-etichettatura multiplex, trasferire i campioni su un coverslip per rilevare meglio il segnale di fluorescenza. Per migliorare l'adesività del coverslip, utilizzare una procedura dettagliata di rivestimento della gelatina descritta in precedenza9.</li>
		<li>Aumentare la conduttività rivestendo i vetrini con l'indio-stagno-ossido (ITO) o l'oro per evaporazione. Conservare le coperture preparate in un ambiente pulito. Glow scarica i campioni come descritto al punto 1.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sezionamento del campione
<ol><li>Preparazione del coltello AT NOTA: per generare gli array, utilizzare un coltello modificato (ATS), progettato per facilitare l'acquisizione di nastri lunghi. Coltelli Histo-Jumbo o coltelli simili concepiti per la generazione delle sezioni su supporti di grandi dimensioni possono servire anche per il sezionamento AT.<ol>
<li>Attaccare l'ago sul fondo del coltello usando il nastro adesivo schiumoso e forarlo (Figura 2B). Posizionare il coltello ATS nel supporto per ultramicrotomia a 0°. Regolare il bordo del coltello parallelamente alla superficie del blocco utilizzando la procedura standard.</li>
		<li>Portare il blocco tagliato sul bordo del coltello in una posizione pronta per il sezionamento.</li>
		<li>Posizionare il wafer/coverslip all'interno della bacinella del coltello e riempirlo con acqua allo stesso livello del bordo del coltello. Lasciare umidificare correttamente il bordo diamantato del coltello e, se necessario, prelevare l'acqua utilizzando la siringa attaccata (Figura 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Sezionamento e trasferimento di array<ol>
<li>Impostare il microtomo sui parametri di taglio desiderati. Con il coltello ATS, si consiglia la gamma di 50-100 nm e una velocità di taglio di 0,6-1 mm / s. Inizia il sezionamento (Figura 2Di).</li>
		<li>Ottenere un nastro della lunghezza che coprirà un volume z mirato e interrompere la raccolta. A seconda delle dimensioni del blocco, dell'omogeneità del tessuto e del tipo di resina, il nastro sarà relativamente dritto (Figura 2D-ii). Molti campioni non produrranno nastri dritti, nonostante lo sforzo investito e il tipo di coltello utilizzato.</li>
		<li>A seconda dell'obiettivo finale, crea uno o più nastri lunghi e corti allineati fianco a fianco. Un supporto di 2 cm x 4 cm può contenere comodamente da 100 a 1.000 sezioni. La disposizione del nastro sul gradino di supporto è un passo che richiede destrezza e mani ferme. Tuttavia, la curva di apprendimento per questa abilità viene rapidamente acquisita.</li>
		<li>Staccare il nastro dal bordo del coltello usando una punta pulita e non appiccicosa di una ciglia incollata sullo stuzzicadenti (Figura 2Diii).</li>
		<li>Usando le ciglia, spostare delicatamente il nastro sopra il centro del supporto. A questo punto, utilizzare cloroformio o penna riscaldante per lo stiramento delle sezioni, se necessario. Tuttavia, ricorda che questa manipolazione può indurre la rottura e la deformazione del nastro.</li>
		<li>Iniziare a drenare l'acqua tirando la siringa. Per nastri più delicati o una retrazione dell'acqua più lenta, lasciare gocciolare l'acqua staccando la siringa dal tubo. Quando il livello dell'acqua si abbassa al livello del wafer, controllare il nastro e riposizionarlo se necessario, spingendo delicatamente il nastro al centro. Dopo aver depositato i nastri sulla superficie del wafer, continuare a drenare fino a quando l'acqua rimanente non viene completamente retratta dal bacino. NOTA: Se non si utilizza il coltello ATS di retrazione dell'acqua di fondo, ridurre attentamente l'acqua dai lati del coltello ATS per non indurre turbolenze.</li>
		<li>Lasciare asciugare completamente le sezioni sul supporto all'interno del bagno. A seconda dell'idrofobicità del supporto e del livello di umidità ambientale, l'acqua evaporerà a una velocità diversa (Figura 2Div). È importante lasciare asciugare lentamente il campione per diminuire o evitare del tutto tutte le pieghe sul campione.</li>
		<li>Trasferire il campione secco in una scatola ben chiusa per proteggerlo dalla contaminazione da sporco e metterlo in un forno a 60 °C per almeno 30 minuti. Se necessario, controbattere le sezioni utilizzando metalli pesanti per migliorare il contrasto complessivo.</li>
		<li>Alla fine della procedura, pulire con cautela il coltello seguendo le istruzioni del produttore NOTA: il trasferimento di sezioni multiple o seriali su un wafer (Figura 2E) rispetto al trasferimento su una griglia di slot (Figura 2F) modifica completamente l'esperienza di preparazione EM. Il sezionamento e la raccolta ininterrotti delle sezioni su supporto singolo riducono la quantità di errori relativi al sezionamento e alla raccolta di sezioni frequenti nel sezionamento seriale. L'equivalente di 100 sezioni di 1000 μm x 500 μm raccolte su un wafer corrisponde a 33 griglie di slot (Figura 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Osservazione del campione
NOTA: in questa sezione vengono descritti i passaggi del flusso di lavoro implementati utilizzando un software disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali). È possibile utilizzare qualsiasi software di acquisizione di immagini su qualsiasi SEM dotato dei rilevatori corretti, tuttavia, le azioni specifiche dell'utente saranno diverse e spesso saranno più manuali.
<ol><li>Acquisisci una mappa panoramica delle immagini SEM che riveli le posizioni delle sezioni sul wafer. Un'immagine della fotocamera ottica integrata aiuta a definire un mosaico di immagini SEM che copre un nastro di sezioni o tutte le sezioni. Creare il mosaico facendo clic e trascinando con il mouse a destra sull'immagine della fotocamera del campione e avviare l'acquisizione automatica. NOTA: sono sufficienti impostazioni di imaging molto grossolane, ovvero 1-2 μm di dimensione dei pixel e 1 μs di tempo di permanenza. Questo processo è illustrato in Materiale supplementare (pagine 2-7).</li>
	<li>Individua le sezioni con la funzione di rilevamento automatico di Section Finder o individuale manualmente. Le posizioni delle sezioni e i contorni vengono recuperati automaticamente con questo software in base alla corrispondenza delle immagini. Per un'illustrazione di questo processo, vedere Materiale supplementare (pagine 8 - 15).</li>
	<li>Nel caso in cui le immagini panoramiche non mostrino chiaramente i ROI, acquisire immagini a risoluzione più elevata delle sezioni. Utilizzare la funzione Anteprima sezione per creare e acquisire automaticamente le immagini. Questo processo è illustrato in Materiale supplementare,pagine 16-18. Le impostazioni di imaging devono essere scelte in base alla natura e alle dimensioni del ROI che l'utente cerca.<ol>
<li>Per trovare le impostazioni ottimali, attivare il Live Imaging nel software di controllo del microscopio e passare a un ROI. Modificare le impostazioni di imaging fino a quando le immagini non mostrano chiaramente il ROI, ma l'acquisizione delle immagini non è eccessivamente lunga.</li>
	</ol></li>
	<li>Definire le aree di imaging NOTA: vengono proposte diverse strategie.<ol>
<li>Se è necessario creare solo alcune sezioni, utilizzare le immagini delle sezioni create finora per navigare nelle sezioni pertinenti e utilizzare il Visualizzatore zoomabile che mostra tutte le immagini acquisite nelle posizioni relative originali per esaminare tutte le sezioni. Una volta trovata una sezione che dovrebbe essere ripresa ad alta risoluzione, creare un'area di imaging con click-drag. Scegli le impostazioni di imaging ad alta risoluzione e memorizza le impostazioni in un modello. Riutilizzare questo modello per ulteriori sezioni.</li>
		<li>Per trovare eventi rari particolarmente piccoli o difficili da rilevare, utilizzare l'approccio di screening laterale. Creare manualmente un'area di imaging con impostazioni di imaging ad alta risoluzione su ogni decima sezione o su una sezione per barra multifunzione e acquisire le immagini. Esamina le immagini e contrassegna le sezioni che contengono il ROI nel software o prendi nota.<ol>
<li>Partendo da sezioni che contengono il ROI, spostarsi avanti e indietro attraverso il set di sezioni e creare aree di imaging ad alta risoluzione nelle stesse posizioni relative per tutto il tempo in cui la struttura è ancora visibile nella sezione. Questo può essere fatto manualmente o utilizzando la procedura descritta nei passaggi successivi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Acquisisci immagini in più di dieci sezioni consecutive. Fare clic su Avvia perfezionamento posizione dopo aver ingrandito l'immagine per aumentare la precisione delle posizioni delle sezioni registrate, come descritto nel manuale. In questo modo si riduce la variabilità di posizione delle serie di immagini. La procedura è illustrata e spiegata nelle pagine 19-21 del Materiale supplementare.</li>
		<li>Fare clic e trascinare su qualsiasi sezione per definire un'area di imaging tenendo premuto il tasto Alt e selezionare Crea matrice set di riquadri dal menu di scelta rapida che si apre quando viene rilasciato il pulsante del mouse. Il software crea quindi regioni di imaging nella stessa posizione relativa in tutte le sezioni che sono state trovate o contrassegnate in precedenza. È possibile limitare l'imaging a un intervallo specifico di sezioni con il dispositivo di scorrimento Estensione sezione. NOTA: questa procedura può essere ripetuta con un numero qualsiasi di regioni di imaging e pertanto consente di registrare molte piccole immagini ad alta risoluzione anziché registrare una singola immagine più grande su ogni sezione.</li>
		<li>Una volta creato, imposta il numero di pixel, la dimensione dei pixel, il layout delle piastrelle, il tempo di permanenza dei pixel, ecc. In ogni serie di immagini secondo necessità. Una volta create e configurate le serie di immagini, vengono tutte elencate in un segnale di lavoro.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurare le funzioni automatiche e avviare l'acquisizione delle immagini<ol>
<li>Creare una serie di immagini separata per le funzioni automatiche utilizzando lo stesso metodo descritto nel passaggio precedente. Spostare la serie di immagini in una posizione sulla sezione che contiene strutture a contrasto elevato.</li>
		<li>Impostare la serie di immagini su 1024 x 884 pixel e scegliere una dimensione in pixel corrispondente alla risoluzione più alta utilizzata nella serie di immagini impostata nei passaggi precedenti. Nell'elenco delle funzioni automatiche, selezionare Messa a fuoco automatica e Auto Stigmator.</li>
		<li>Selezionare Per sezione nei controlli della sequenza di acquisizione e assicurarsi che l'immagine delle funzioni automatiche sia il primo elemento dell'elenco. Avviare l'acquisizione dell'immagine facendo clic sul pulsante Esegui accanto al segnale di processo. Queste procedure sono illustrate in Materiale supplementare,pagine 22-23. NOTA: non è necessario pre-focalizzare manualmente su ogni sezione. Durante la sessione di registrazione, ogni volta che il microscopio avanza in una nuova sezione, le funzioni automatiche verranno eseguite prima che tutte le altre immagini vengano registrate in questa sezione.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Allineamento e analisi dei dati
<ol><li>Esportazione dei dati<ol>
<li>Assicurati che i dati vengano salvati in formato .tif, quindi non è necessaria una funzione di esportazione dedicata. Ordinare i dati in una struttura di cartelle che corrisponda direttamente ai livelli e agli elementi nell'albero dei livelli.</li>
		<li>Una volta registrati i mosaici di immagini, utilizzare la funzione StitchAll per cucire automaticamente tutte le tessere.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Allineamento e ritaglio dello stack nelle Figi NOTA. Molti pacchetti software (gratuiti e commerciali) possono essere utilizzati per lavorare con i dati della tomografia array. I passaggi seguenti sono mostrati con il programma open source Fiji32 perché è ampiamente disponibile e contiene tutte le funzioni richieste.<ol>
<li>Importa una pila di immagini (o immagini cucite) nelle Figi come pila virtuale.</li>
		<li>Se il contrasto/luminosità deve essere normalizzato, scegli Contrasto avanzato... dal menu Processo. Impostate Pixel saturi su 0.1 o inferiore e selezionate Elabora tutte le sezioni.</li>
		<li>Dal menu Plugin, scegli Registrazione | Allineamento lineare dello stack con SIFT.</li>
		<li>Selezionate Rigido (Rigid) o Affine (Affine) dal menu a discesa Trasformazione prevista (Expected Transformation). In caso contrario, mantenere le impostazioni predefinite. Avviare l'allineamento facendo clic su OK. NOTA: il caricamento dei dati come Virtual Stack consente a Fiji di gestire stack di qualsiasi dimensione. L'output dell'allineamento viene creato nella RAM; tuttavia, ciò può limitare la dimensione massima degli stack che possono essere elaborati. In tal caso, utilizzare Register Virtual Stack Slices, che è un'implementazione da cartella a cartella dello stesso algoritmo di registrazione. Una volta completata la registrazione, caricare i dati di output come stack virtuale.</li>
		<li>Ritaglia lo stack di immagini facendo clic su Ritaglia in modo che contenga solo il ROI.</li>
		<li>Salvare lo stack come immagine singola .tif o serie di immagini .tif. NOTA: i passaggi critici della tomografia ad array sono illustrati nella Figura 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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L'autore Tilman Franke è un dipendente di Thermo Fisher che produce microscopi elettronici e programmi pilota utilizzati nell'articolo.

La microscopia elettronica fornisce informazioni sull'ultrastruttura delle cellule e degli organismi, per i quali è spesso auspicabile visualizzare strutture di interesse nel loro contesto tridimensionale. Nonostante le numerose tattiche EM per l'analisi ultrastrutturale, non esiste ancora una soluzione "gold standard". Il motivo principale è l'ampia varietà di campioni, molte domande biologiche, che spesso richiedono un approccio su misura. Il flusso di lavoro AT proposto è progettato per ridurre al minimo il tempo necessario per l'elaborazione dei campioni, l'acquisizione dei dati, la valutazione e l'archiviazione. Inoltre, il coltello modificato fornisce uno strumento utile per semplificare l'acquisizione dell'array. Il layout compatto delle sezioni sui wafer è conveniente, sia per l'osservazione che per la successiva conservazione dei campioni. Questa disposizione consente lo "screening laterale" dei campioni spostandosi orizzontalmente da un nastro all'altro e scansionando solo una sezione su ciascuno, riducendo significativamente il tempo necessario per localizzare un ROI. Gli scenari di acquisizione dati proposti facilitano il targeting di aree piccole e distribuite in modo casuale. Una volta trovato, AT/SEM limita l'imaging ad alta risoluzione esattamente al volume di interesse, sia che venga eseguito manualmente o con l'aiuto della funzione automatica. L'AT per volumi limitati può essere completato manualmente, con l'operatore che naviga attraverso il campione e definisce le regioni di imaging una per una. Il modulo automatizzato del software fornisce una strategia flessibile di acquisizione delle immagini per l'imaging di piccole aree su sezioni di grandi dimensioni. L'automazione in questo software consente di registrare immagini ad alta risoluzione di grandi dimensioni su centinaia di sezioni, raggiungendo volumi simili a SBFI. La registrazione delle immagini panoramiche di tutte le sezioni semplifica la localizzazione del ROI e riduce il tempo trascorso al microscopio. Poiché le sezioni non vengono danneggiate durante la registrazione di panoramiche e anteprime ad alta risoluzione, AT/SEM consente di riutilizzare il campione per raccogliere ulteriori dati di altri ROI o a una risoluzione più elevata.
Il tempo di acquisizione delle immagini è uno degli aspetti più importanti (e più costosi) dell'EM 3D e dovrebbe quindi essere considerato nella progettazione dell'esperimento. Sebbene non sia sorprendente che l'imaging di grandi aree richieda più tempo rispetto all'imaging di piccole aree, è facile sottovalutare l'impatto: a seconda dei parametri di imaging selezionati, il tempo di acquisizione su ciascuna sezione può variare da secondi a ore. I parametri di imaging critici includono la dimensione del campo visivo, la risoluzione e il tempo di permanenza. Supponendo una risoluzione target di 10 nm per pixel e un tempo di permanenza di 1 μs, l'imaging di un campo di 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm o 500 μm x500 μm richiede 4 secondi, 100 secondi o 2.500 s per registrare. Possiamo moltiplicare questi tempi di imaging per sezione per il numero di sezioni per stimare il tempo necessario per il lavoro di imaging completo. Lunghi tempi di imaging per sezione possono essere accettabili se il numero di sezioni è piccolo o se il tempo dello strumento del microscopio non è preoccupante.
Tuttavia, è necessario limitare il tempo di registrazione a un lavoro notturno o a un lavoro nel fine settimana nella maggior parte dei casi. Un aspetto altrettanto critico dell'EM 3D che dovrebbe essere considerato, è la quantità e la struttura dei dati di immagine risultanti. La registrazione dei campi di imaging sopra menzionati in 100 sezioni genera rispettivamente 400 MB, 10 GB o 250 GB di dati immagine; le immagini da 500 μm x 500 μm pongono il problema aggiuntivo di essere più grandi di 2 gb ciascuna. Molti dei programmi software utilizzati per la valutazione dei dati non possono aprire immagini di queste dimensioni.
Per ridurre il tempo di imaging, è importante scegliere il tempo di permanenza dei pixel per soddisfare i requisiti del rapporto segnale-rumore per la successiva valutazione dei dati (ad esempio, ricostruzione, tracciamento) e limitare le registrazioni a ROI definiti. L'estensione AT del software facilita l'acquisizione di immagini in piccole aree in sezioni seriali. Il software supporta flussi di lavoro manuali e automatici e molte varianti semi-automatiche: le aree di imaging possono essere posizionate manualmente e focalizzate su ciascuna sezione, oppure l'utente può utilizzare il cercatore automatico di sezioni e le funzioni di allineamento della posizione. A seconda del livello di automazione scelto e supportato dal tipo di campione o dagli obiettivi di imaging, il tempo necessario per impostare l'acquisizione delle immagini in centinaia di sezioni può richiedere un'intera giornata lavorativa (eseguita manualmente) o solo pochi minuti. In linea di principio, la tomografia array rende più difficile rispetto ad altri metodi EM 3D acquisire piccoli ROI; il posizionamento impreciso della regione su sezioni consecutive deve essere compensato acquisendo aree più ampie. Ad esempio, se il ROI è di 20 μm x 20 μm e la variabilità di posizione da sezione a sezione dei campi di imaging è di 10 μm, è necessario acquisire immagini da 40 μm x 40 μm per essere sicuri che il ROI sia completamente catturato in ogni immagine, su ogni sezione. La variabilità della posizione dell'immagine nel mondo reale varia da 100 μm a < 10 μm a seconda della disponibilità o della qualità delle funzionalità software per l'allineamento della posizione o della pazienza dell'utente. Con questo software, è possibile ottenere 10 μm senza troppi interventi manuali nella maggior parte dei campioni.
Come ogni tecnica, l'AT ha diversi punti deboli che possono influenzare l'acquisizione dei dati di successo e molti sono simili ad altri metodi basati sul sezionamento. La mancanza di una distribuzione omogenea della resina vuota rispetto al tessuto può causare matrici curve o rotte. In casi estremi, le sezioni possono staccarsi dal supporto (Figura 6A). La compressione variabile o lo stiramento durante il processo di taglio possono creare pieghe che possono interrompere il campione in regioni variabili nelle sezioni successive (Figura 6B). I segni dei coltelli possono apparire sulla superficie delle sezioni raccolte utilizzando un coltello danneggiato (Figura 6C). Le differenze nelle condizioni di sezionamento possono indurre occasionali compressioni di sezione e differenze di spessore. Particelle di polvere o sporco possono atterrare su una sezione e oscurare parzialmente la zona di interesse (Figura 6D). L'acquisizione delle immagini può fallire a causa delle funzioni imperfette di contrasto automatico, messa a fuoco automatica e auto-stigmatizzazione. Il posizionamento delle aree di imaging create automaticamente può essere variabile e potrebbe non riuscire a catturare il ROI in tutte le sezioni.
Diversi problemi possono sorgere nella fase di cucitura e allineamento. La cucitura automatica delle acquisizioni di tessere di mosaico può fallire, ad esempio, a causa del grande spazio vuoto all'interno del campione. A causa di un drastico cambiamento di forma in 3D, le pile di immagini possono essere difficili da registrare. Programmi appositamente sviluppati (ad esempio, IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB o MAPS-AT) possono facilitare l'allineamento semi-automatico32,38,39,40. Le sezioni più impegnative possono essere allineate manualmente utilizzando un software di fotoritocco. Sfortunatamente, alcuni set di dati potrebbero essere impossibili da allineare correttamente.
Campioni di grandi dimensioni sono difficili per le sezioni seriali TEM che si adattano alle griglie; d'altra parte, molti progetti non giustificano lunghe acquisizioni automatiche utilizzando FIB/SEM o SBF-SEM. L'AT è un'alternativa semplice a una noiosa sezione seriale TEM in cui la raccolta e la manipolazione di sezioni seriali su un wafer sono più semplici rispetto alle griglie di slot. Sono state sviluppate diverse strategie per facilitare la raccolta degli array e condividiamo il nostro metodo per espandere il toolkit esistente. Nei casi in cui l'identificazione del ROI è impegnativa, AT-SEM fornisce un vantaggio fondamentale, con lo screening efficiente dei campioni in cui è richiesta una risoluzione su scala organello su 50-500 sezioni. Per volumi maggiori, le strategie AT di raccolta automatica possono essere raccolte in modo efficiente se sono necessarie più sezioni. I campioni AT possono essere ripresi più volte, facilitando l'imaging mirato di aree ad alta risoluzione basate su immagini panoramiche acquisite in precedenza. Riteniamo che l'analisi mirata e il sovracampionamento ridotto da parte di AT / SEM qui proposti riducano i requisiti di manodopera e archiviazione dei dati. In definitiva, le biblioteche di sezioni possono essere raccolte e mantenute per un successivo riutilizzo e consultazione. Per l'acquisizione di volumi, gli approcci FIB o SBF-SEM offrono una soluzione eccellente ogni volta che il ROI è facile da identificare sulla faccia del blocco o se sono necessari grandi volumi 3D per l'analisi. Tuttavia, FIB/SBF-SEM sono meno efficienti quando l'immagine dello stack ad alta risoluzione deve essere raccolta da un ROI definito in modo mirato. Per concludere, i metodi proposti per lo screening dei campioni AT e l'uso di immagini panoramiche a media risoluzione consentono di limitare l'acquisizione delle immagini alle parti rilevanti dell'array di sezioni. La mira precisa delle regioni di imaging accelera il time-to-data e semplifica la valutazione dei dati.
In sintesi, sebbene il concetto di AT/SEM non sia nuovo, il suo uso non è ancora così diffuso come suggerirebbero i suoi meriti. Nel complesso, fornisce una procedura complementare ad altri metodi EM esistenti. AT/SEM è compatibile con la più ampia gamma di protocolli di preparazione dei campioni e flussi di lavoro di imaging e può essere eseguita su qualsiasi microscopio FIB/SEM o SBF-SEM come tecnica di accompagnamento. In questo articolo, ci siamo concentrati sull'AT per la registrazione di dati ultrastrutturali da campioni che hanno meno probabilità di essere affrontati con successo con altri metodi. Ci auguriamo che la procedura descritta per una comoda raccolta di sezioni e strategie di acquisizione notevolmente automatizzate aiuti nei primi tentativi per coloro che non hanno mai incontrato il metodo e aiuti a perfezionarlo per coloro che hanno già una certa esperienza.

Nonostante l'importanza delle tecniche relative ai ME, lo sforzo richiesto per padroneggiarle mantiene l'intero campo limitato a un piccolo numero di specialisti. Una difficoltà significativa è l'identificazione e il recupero di una regione di interesse (ROI) nei campioni conservati per EM. L'aspetto dello stesso campione differisce considerevolmente quando analizzato al microscopio ottico e dopo l'elaborazione per l'osservazione EM. Le modifiche per i campioni preparati chimicamente includono il restringimento del campione anisotropico dopo le fasi di disidratazione (~ 10% in ciascuna dimensione) e la perdita di fluorescenza quando si utilizza l'osmio nel protocollo di fissazione e colorazione (Figura 1A). Per il sezionamento ultrasottile, i campioni sono incorporati in resine epossidiche o acriliche utilizzando diverse strategie (Figura 1B). Per ottenere risultati positivi di questa preparazione, l'intero campione deve essere frazionato in pezzi che non superino 1 mm x 1 mm. Per soddisfare i requisiti standard delle condizioni di osservazione della microscopia elettronica a trasmissione (TEM), questa piccola porzione del campione viene ulteriormente sezionata a fette spesse 50-150 nm. Le immagini in scala di grigi risultanti mostrano l'organizzazione tissutale e la struttura degli organelli di una frazione minuscola dell'intero campione con maggiori dettagli rispetto a qualsiasi altra tecnica di microscopia (Figura 1C). Un tipico set di dati TEM fornisce informazioni 2D, teoricamente estrapolate per comprendere i processi che si verificano naturalmente in uno spazio 3D in cellule e tessuti. La figura 1D presenta la sfida dell'acquisizione di volumi ultrastrutturali: se un cubo di lato 1.000 μm è sezionato a 50 nm di spessore, saranno necessarie 20.000 sezioni per coprire l'intero volume; per un cubo laterale da 500 μm, sarà di 10.000 sezioni. Per coprire un volume di 50 μm x 50 μm x 50 μm, potrebbero essere necessarie "solo" 1.000 sezioni. Ottenere questo volume manualmente è praticamente impossibile ed estremamente impegnativo da eseguire con l'automazione. Se, oltre alla profondità del campione, abbiamo bisogno di coprire l'intera superficie di tali ipotetici cubi, la copertura di 1μm 2 di superficie a risoluzione ragionevole diventa un serio problema logistico (Figura 1E). Mentre per i progetti straordinari su larga scala, come gli approcci di connettomica, il gran numero di sezioni è cruciale, per la maggior parte dei progetti EM "banali", generare più sezioni necessarie per l'osservazione presenta uno svantaggio significativo.
Esistono diversi metodi per acquisire informazioni ultrastrutturali 3D: microscopia elettronica a trasmissione a sezione seriale (TEM), tomografia TEM, tomografia array (AT), microscopia elettronica a scansione a blocchi facciali seriali (SBF-SEM) e microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM). Le principali differenze tra questi metodi sono la strategia di sezionamento e se l'acquisizione dell'immagine è accoppiata alla generazione di sezione1. Nel TEM di sezionamento seriale, le sezioni sequenziali vengono raccolte su griglie di slot, le immagini TEM vengono generate da queste sequenze e allineate2,3,4,5. Nella tomografia TEM, le serie di inclinazione da sezioni da 150-300 nm su una griglia e, quando accoppiate al sezionamento seriale, forniscono una risoluzione molto elevata, anche se volumi relativamente piccoli6,7,8. L'approccio AT utilizza il sezionamento fisico con diversi modi manuali e semi-automatici di raccolta di sezioni su supporti relativamente grandi, come coperchi di vetro, wafer di silicio o un nastro speciale. Per l'acquisizione di immagini, il supporto viene analizzato in SEM, con diverse strategie di acquisizione delle immagini sono disponibili9,10,11,12,13,14,15. Per SBF-SEM, il sezionamento fisico è ottenuto utilizzando un mini-microtomo con un coltello diamantato incastonato direttamente all'interno della camera SEM, con l'immagine SEM generata dalla superficie del blocco di resina16,17,18,19. Per FIB-SEM, la sorgente ionica rimuove gli strati sottili del campione, seguita dall'imaging automatico della superficie esposta da parte del SEM20,21. La tomografia TEM e l'AT generano sezioni fisiche, che possono essere ripresentate se necessario, mentre FSBF-SEM e FIB-SEM eliminano la sezione dopo l'imaging. Una recente combinazione di sezioni fisiche riprese da un SEM multi-fascio fornisce una combinazione di metodi che risolve il problema del "collo di bottiglia" della velocità di acquisizione delle immagini22. Ognuna di queste tecniche ha rivoluzionato il modo in cui i dati EM possono essere ottenuti e analizzati, e ogni approccio ha i suoi impatti pratici relativi a una determinata domanda di ricerca.
Data la natura della preparazione e la scala delle dimensioni ultrastrutturali, non è semplice prevedere dove si trova una specifica struttura target nel blocco campione (Figura 1D,E). Una soluzione per la localizzazione del ROI è la registrazione delle immagini dall'intero blocco alla risoluzione desiderata fin dall'inizio. Le strutture di interesse possono essere nel volume di dati acquisito quando si è lontani dal microscopio. I tempi di acquisizione e la gestione dei dati associati a questa strategia sono problematici. È auspicabile ridurre la quantità di dati registrati, specialmente se i ROI sono molto più piccoli del blocco tissutale, cioè se gli oggetti di interesse sono tipi specifici di cellule (non organi interi). Diverse tecniche di microscopia elettronica e alla luce correlativa (CLEM) possono avere successo quando la fluorescenza viene conservata e localizzata prima o dopo la preparazione all'interno dello stesso campione23,24,25,26,27,28,29. Tuttavia, molte strutture cellulari sono riconoscibili anche senza correlazione di fluorescenza, solo in base all'ultrastruttura nota. Per questi casi, riteniamo che lo screening laterale Array Tomography fornisca un compromesso di equilibrio tra lo sforzo investito nella localizzazione del ROI e la qualità delle informazioni ultrastrutturali. Utilizzando questa strategia, un sottoinsieme di sezioni sul wafer viene sottoposto a screening a intervalli regolari, che possono essere stabiliti in base alle dimensioni e alla natura del ROI. Una volta trovati i ROI, l'acquisizione dei dati viene impostata in una serie continua di sezioni che iniziano prima e terminano dopo la sezione di ancoraggio, raccogliendo le informazioni pertinenti in modo mirato.
Presentiamo protocolli per AT che semplificano e accelerano l'acquisizione di regioni o eventi di interesse in numerose sezioni e producono volumi di immagini meglio allineati. Lo screening laterale e l'acquisizione multistep producono dati ad altissima risoluzione in regioni mirate con precisione. La procedura che descriviamo affronta diverse sfide dell'acquisizione dati EM 3D, in quanto prevede: compatibilità con un'ampia gamma di campioni senza modificare radicalmente il flusso di lavoro di preparazione del campione; localizzazione mirata per acquisizioni di sezionamento e SEM; riduzione di tempo e fatica durante l'installazione; imaging di regioni in più sezioni con un migliore allineamento dei volumi risultanti; e una procedura di cucitura e allineamento liscia per compilare diverse immagini in un'immagine a mosaico cucita. Abbiamo scelto di dimostrare la forza del nostro metodo con diversi campioni di progetti pubblicati e in corso. Riteniamo che questo approccio possa facilitare in modo significativo la generazione e l'acquisizione di dati EM mirati, anche per gli investigatori con limitata esperienza EM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AT sectioning knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUATS3530</td>
			<td>Diatome Jumbo knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td>Diatome trimming 20&#176; 
			Glass knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16015</td>
			<td>Resistance: 1-30 Ohms 
			Type P: (Boron) (1 primary flat) 
			Roughness: 2 nm 
			No SiO2 top coating 
			TTV: = &#60;20 &#181;m 
			Wafer is polished on one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer cleaving kit</td>
			<td>EMS</td>
			<td>7642</td>
			<td>EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Thermo Fischer Helios</td>
			<td>1072419</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maps 3 for SEM with Correlative Workflow &#38; Array Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1135932</td>
			<td>Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira x.y</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131599</td>
			<td>Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td>IMOD, MIB (See text for refferences)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy

La microscopia elettronica è applicata in biologia e medicina per l'imaging di dettagli cellulari e strutturali a risoluzione nanometrica. Storicamente, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha fornito informazioni sull'ultrastruttura cellulare, ma nell'ultimo decennio, lo sviluppo dei moderni microscopi elettronici a scansione (SEM) ha cambiato il modo di guardare all'interno delle cellule. Anche se la risoluzione del TEM è superiore quando sono necessari dettagli strutturali a livello proteico, la risoluzione SEM è sufficiente per la maggior parte delle domande relative alla biologia cellulare a livello di organello. Il progresso tecnologico ha consentito soluzioni di acquisizione automatica del volume come l'imaging seriale a blocchi (SBF-SEM) e il fascio ionico focalizzato SEM (FIB-SEM). Tuttavia, fino ad oggi, questi metodi rimangono inefficienti quando l'identificazione e la navigazione verso le aree di interesse sono cruciali. Senza i mezzi per la localizzazione precisa delle aree target prima dell'imaging, gli operatori devono acquisire molti più dati di quelli di cui hanno bisogno (in SBF-SEM) o, peggio ancora, preparare molte griglie e immaginarle tutte (in TEM). Proponiamo la strategia di "screening laterale" utilizzando la Tomografia Array in SEM, che facilita la localizzazione delle aree di interesse, seguita dall'imaging automatizzato della frazione rilevante del volume totale del campione. I campioni di tomografia array vengono conservati durante l'imaging e possono essere organizzati in librerie di sezioni pronte per l'imaging ripetuto. Vengono mostrati diversi esempi in cui lo screening laterale ci consente di analizzare dettagli strutturali a cui è incredibilmente difficile accedere con qualsiasi altro metodo.

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Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Descriviamo la preparazione di nastri di sezioni seriali e la loro raccolta su un ampio supporto di trasferimento per l'uso come campioni di tomografia array, insieme a procedure di imaging automatizzate in un microscopio elettronico a scansione. Il protocollo consente lo screening, il recupero e l'imaging mirato di eventi locali rari e l'acquisizione di grandi volumi di dati.

Flusso di lavoro di tomografia ad array per l'acquisizione mirata di informazioni sul volume utilizzando la microscopia elettronica a scansione

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

L'analisi al microscopio elettronico è spesso complessa. Riteniamo che il nostro protocollo faciliti l'elaborazione e l'acquisizione dei dati EM dall'ampia superficie del campione e dal volume intermedio. Il nostro protocollo aiuta a trovare le strutture target nelle sezioni seriali.La registrazione dei dati è limitata a ciò che è necessario. Rispetto all'acquisizione dei dati in blocchi di tessuto intero, il tempo di registrazione è ridotto e l'analisi dei dati più semplice. Data la generale facilità dell'approccio, riteniamo che possa essere utilizzato per affrontare non solo questioni scientifiche, ma anche come strumento diagnostico.Per generare un array per l'analisi, prima bloccare il campione su un supporto per ultramicrotomia e utilizzare una lama di rasoio per tagliare approssimativamente la resina attorno al campione. Utilizzare uno strumento di taglio diamantato per tagliare finemente il campione e utilizzare coltelli di taglio con inclinazione di 20 o 90 gradi per garantire che le superfici superiore e inferiore del blocco siano parallele al tagliente del coltello. Mescolare xilene e colla in proporzione 3:1 e utilizzare una ciglia attaccata a uno stuzzicadenti per applicare la miscela sui bordi superiore e inferiore del blocco tagliato.Mentre la miscela si sta asciugando, utilizzare uno strumento di chiusura del wafer per tagliare un pezzo di wafer alla dimensione appropriata per l'analisi. Pulire il wafer in acqua distillata per risciacquare via eventuali detriti e pulire la superficie con plasma dopo che il wafer è asciutto. Per preparare un coltello da tomografia array, utilizzare nastro adesivo schiumoso per attaccare un ago sul fondo di un coltello histo jumbo e posizionare il coltello nel supporto ultra microtome a zero gradi.Regolare il bordo del coltello parallelamente alla superficie del blocco e portare il blocco tagliato sul bordo del coltello in una posizione pronta per il sezionamento. Posizionare il wafer pulito nella bacinella del coltello e riempire la bacinella con acqua allo stesso livello del bordo del coltello, quindi lasciare che il bordo diamantato del coltello umidifichi correttamente, usando la siringa attaccata per aggiungere o prelevare l'acqua secondo necessità. Per il sezionamento dell'array, impostare il microtomo su un intervallo di taglio da 50 a 100 nanometri e una velocità di taglio da 6 a 1 millimetro al secondo e iniziare il sezionamento per ottenere un nastro abbastanza lungo da coprire un volume Z mirato.A seconda delle dimensioni del blocco, dell'omogeneità del tessuto e del tipo di resina, il nastro sarà approssimativamente dritto. Usa una punta pulita e non appiccicosa di una ciglia per staccare i nastri dal bordo del coltello. Usa le ciglia per spostare delicatamente il nastro al centro del supporto.Il cloroformio o una penna riscaldante possono essere utilizzati per allungare la sezione, se necessario. Dopo lo stretching, ritrarre la siringa per iniziare a drenare l'acqua. Per nastri più delicati o una retrazione dell'acqua più lenta, staccare la siringa dal tubo per far gocciolare l'acqua.Quando il livello dell'acqua raggiunge il livello del wafer, spingere delicatamente il nastro al centro del bacino e continuare a drenare fino a quando tutta l'acqua rimanente non viene completamente rimossa dal bacino. Lasciare asciugare il wafer in un ambiente pulito. L'essiccazione richiede circa 30 minuti.Quando il campione è completamente asciutto, trasferire l'array in una scatola ben chiusa per proteggerlo dalla contaminazione da sporco. E metti la scatola in un forno a 60 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Per acquisire una mappa panoramica delle immagini SEM che rivela le posizioni delle sezioni sul wafer, utilizzare la telecamera ottica integrata per acquisire un'immagine SEM che copre un nastro di sezioni.Per creare un mosaico, fare clic e trascinare l'immagine della fotocamera del campione e avviare l'acquisizione automatica. Acquisisci panoramiche a risoluzione più elevata per trovare le strutture di destinazione. Se è necessario creare solo poche sezioni, utilizzare il visualizzatore zoomabile per visualizzare le immagini acquisite nelle posizioni originali.Una volta identificata una sezione che deve essere ripresa ad alta risoluzione, fare clic e trascinare per creare un'area di imaging, quindi selezionare Impostazioni di imaging ad alta risoluzione e memorizzare le impostazioni in un modello Per trovare eventi rari particolarmente piccoli o difficili da rilevare, utilizzare le impostazioni di imaging ad alta risoluzione su ogni 10a sezione o su una sezione per barra multifunzione per creare manualmente un'area di imaging e acquisire le immagini. Quindi rivedere le immagini e contrassegnare le sezioni che contengono la regione di interesse. Per acquisire più di 10 sezioni consecutive, utilizza il cercatore di sezioni per individuare automaticamente tutte le sezioni.Se le immagini di panoramica non mostrano chiare regioni di interesse, acquisire immagini ad alta risoluzione delle sezioni e utilizzare la funzione di anteprima della sezione per creare e acquisire automaticamente le immagini. Per determinare le impostazioni di imaging ottimali, attivare l'imaging dal vivo nel software di controllo del microscopio e passare a una regione di interesse, quindi regolare le impostazioni di imaging fino a quando le immagini non mostrano chiare regioni di interesse, ma senza un'acquisizione di immagini eccessivamente lunga, secondo le linee guida del produttore. Per ottimizzare il posizionamento delle regioni di imaging su sezioni consecutive, ingrandire l'immagine di interesse e fare clic su Avvia perfezionamento posizione per aumentare la precisione delle posizioni delle sezioni registrate.Per definire un'area di imaging, fare clic e trascinare su qualsiasi sezione tenendo premuto il tasto Alt e selezionare Crea matrice set di riquadri dal menu di scelta rapida a comparsa. Il software creerà regioni di imaging nella stessa posizione relativa in tutte le sezioni che sono state trovate o precedentemente contrassegnate. Quindi imposta il numero di pixel, le dimensioni dei pixel, il layout delle piastrelle e il tempo di permanenza dei pixel in ogni serie di immagini in base alle esigenze.Per configurare la funzione automatica, creare una serie di immagini separata per le funzioni automatiche, come illustrato, e spostare la serie di immagini in una posizione sulla sezione che contiene strutture a contrasto elevato. Impostare la serie di immagini su 1024 x 884 pixel e selezionare una dimensione in pixel corrispondente alla risoluzione più alta utilizzata nella serie di immagini. Nell'elenco delle funzioni automatiche, selezionare Messa a fuoco automatica e Auto stigmator.Selezionare Bisezione nei controlli della sequenza di acquisizione e verificare che l'immagine della funzione automatica sia il primo elemento dell'elenco, quindi fare clic su Acquisisci tutto per avviare l'acquisizione dell'immagine. Quando tutte le serie di immagini sono state create e configurate, la serie verrà elencata in una coda di lavoro. L'acquisizione a bassa risoluzione può essere eseguita manualmente o automaticamente direttamente su parti selezionate della sezione o su un'intera sezione utilizzando immagini singole o a mosaico, seguite da cuciture.Le immagini dell'area selezionata possono quindi essere acquisite utilizzando parametri ad alta risoluzione per visualizzare mitocondri, nuclei e microvilli, ad esempio, Dopo aver selezionato l'acquisizione automatica delle mappe di mosaico risolte, diverse regioni di interesse possono essere ritagliate o utilizzate per definire ulteriori aree di imaging locale all'interno delle regioni. Sebbene diversi tipi di cellule specializzate nell'intestino di Drosophila siano distribuiti in modo casuale, possono essere distinti visivamente dopo lo screening delle immagini utilizzando parametri ad alta risoluzione, sia da singole sezioni che come raccolta di immagini seriali. Dopo l'allineamento, gli stack possono essere renderizzati utilizzando diverse soluzioni software.L'analisi della tomografia ad array consente di generare molte sezioni sequenziali sul singolo wafer e di essere schermate utilizzando parametri a bassa risoluzione per localizzare le aree generali di interesse. Queste aree possono essere mirate per ulteriori analisi utilizzando parametri di acquisizione avanzati. Ad esempio, le divisioni mitotiche nel notum non sono facili da localizzare a livello ultra-strutturale, poiché le cellule sono relativamente grandi rispetto alla zona di abscissione.Utilizzando questo metodo, tuttavia, le immagini di panoramica automatiche a media risoluzione dei salti da 20 a 40 sezioni possono essere utilizzate per localizzare le celle divisorie. La procedura di tomografia ad array fornisce un'analisi dei dati al microscopio elettronico più semplice. Incoraggiamo gli spettatori a investire nella padronanza della rigenerazione e familiarizzare con il flusso di lavoro relativo alle mappe Nella nostra esperienza, pochi argomenti di ricerca richiedono l'analisi ultra-strutturale di interi animali o interi organi.Il nostro metodo aiuta con la rapida localizzazione delle cellule e dei loro partner di interazione nei tessuti.

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