電子顕微鏡分析は、しばしば複雑です。当社のプロトコルは、大きなサンプル表面と中間体積からのEMデータの処理と取得を容易にすると考えています。当社のプロトコルは、シリアルセクション内のターゲット構造を見つけるのに役立ちます。
データの記録は必要な情報に限られます。組織全体のブロックでのデータ取得と比較して、記録時間が短縮され、データ分析が容易になります。このアプローチの全体的な容易さを考えると、科学的な問題だけでなく、診断ツールとしても対応できると考えています。
分析用の配列を生成するには、まずサンプルをウルトラミクロトームホルダーにクランプし、カミソリの刃を使用してサンプルの周りの樹脂を大まかにトリミングします。ダイヤモンドトリミングツールを使用してサンプルを微調整し、20度または90度の傾斜のトリミングナイフを使用して、ブロックの上面と下面がナイフの最先端と平行であることを確認します。3:1の割合でキシレンと接着剤を混ぜ、爪楊枝に取り付けられたまつげを使用して、トリミングされたブロックの上端と下端に混合物を適用します。
混合物が乾燥している間、ウエハ切断ツールを使用して、分析に適したサイズにウエハを切断する。蒸留水でウエハを洗浄し、残骸を洗い流し、ウエハが乾燥した後にプラズマで表面をきれいにします。アレイ断層撮影ナイフを準備するには、泡状の粘着テープを使用してヒストジャンボナイフの底に針を取り付け、ナイフを超ミクロトームホルダーにゼロ度で入れます。
ブロック面に平行なナイフの端を調整し、切断の準備ができている位置にナイフの端にトリミングされたブロックを持って来ます。ナイフの洗面器にきれいなウエハを入れ、ナイフの端と同じレベルに水で洗面器を満たし、必要に応じて水を追加または引き出すために付属の注射器を使用して、ナイフのダイヤモンドエッジを適切に湿らせます。配列断面化の場合は、マイクロトームを50~100ナノメートルの切断範囲と、毎秒6~1ミリメートルの切断速度に設定し、断面を開始して、ターゲットとなるZ体積をカバーするのに十分な長さのリボンを得ます。
ブロックサイズ、組織の均質性、樹脂の種類に応じて、リボンはほぼまっすぐになります。まつげの清潔で粘着性のない先端を使用して、リボンをナイフの端から取り外します。まつげを使用して、リボンをサポートメディアの中央にゆっくりと移動します。
クロロホルムや加熱ペンは、必要に応じてセクションを伸ばすために使用することができます。伸縮後、注射器を引き込み、水の水を排出し始めます。より繊細なリボン、または遅い水の引き込みのために、水が滴り落ちるようにホースから注射器を取り外します。
水位がウエハーレベルに達したら、リボンを流域の中央に静かに押し込み、残りの水がすべて流域から完全に取り除かれるまで排水を続けます。ウエハーを清潔な環境で乾燥させます。乾燥時間は約30分です。
サンプルが完全に乾燥したら、アレイを密閉した箱に移して汚れから保護します。そして、少なくとも30分間、60度摂氏オーブンに箱を置きます。ウエハ上のセクション位置を明らかにするSEM画像の概観図を取得するには、内蔵の光学カメラを使用して、セクションのリボンを覆うSEM画像を取得します。
モザイクを作成するには、サンプルのカメラ画像をクリックしてドラッグし、自動取得を開始します。ターゲット構造を見つけるために、高解像度で概要を取得します。数個のセクションだけを画像化する必要がある場合は、ズーム可能なビューアを使用して、取得した画像を元の場所に表示します。
高解像度で画像化する必要のあるセクションを特定したら、クリックしてドラッグしてイメージング領域を作成し、[高解像度イメージング設定] を選択し、テンプレートに設定を保存する 特に小さいイベントや検出しにくい珍しいイベントを見つけるには、10 番目のセクションまたはリボンごとに 1 つのセクションの高解像度イメージング設定を使用して、イメージング領域を手動で作成し、画像を取得します。次に、対象地域を含む画像とマーク セクションを確認します。10 以上の連続したセクションを取得するには、セクションファインダーを使用してすべてのセクションを自動的に検索します。
概要画像が対象の明確な領域を表示しない場合は、セクションの高解像度の画像を取得し、セクションプレビュー機能を使用して画像を自動的に作成および取得します。最適なイメージング設定を決定するには、顕微鏡制御ソフトウェアでライブイメージングをアクティブにし、対象の1つの領域にナビゲートし、画像が明確な対象領域を示すまでイメージング設定を調整しますが、メーカーのガイドラインに従って、過度に長い画像取得はありません。連続したセクションでのイメージング領域の位置を最適化するには、目的の画像にズームし、[位置の絞り込みを開始]をクリックして、登録された断面の位置の精度を高めます。
イメージング領域を定義するには、Alt キーを押しながら任意のセクションをクリックしてドラッグし、ポップアップメニューから「タイルセット配列を作成」を選択します。ソフトウェアは、見つかったか以前にマークされたすべてのセクションで、同じ相対位置にイメージング領域を作成します。次に、必要に応じて、各画像系列にピクセル数、ピクセルサイズ、タイルレイアウト、およびピクセルのドウェル時間を設定します。
自動機能を設定するには、図のように自動機能用の別のイメージ シリーズを作成し、イメージ シリーズをハイ コントラスト構造を含むセクションの位置に移動します。イメージシリーズを 1024 x 884 ピクセルに設定し、画像シリーズで使用される最高解像度に対応するピクセルサイズを選択します。自動機能のリストで、オートフォーカスと自動スティグマをチェックします。
取得シーケンスコントロールの[Bisection]を選択し、自動機能の画像がリストの最初の項目であることを確認し、[すべて取得]をクリックして画像取得を開始します。すべてのイメージング シリーズが作成され、セットアップされると、そのシリーズはジョブ キューに表示されます。低解像度の取得は、単一またはモザイクイメージングを使用して、セクションの選択した部分またはセクション全体に手動または自動で直接実行することができ、その後ステッチングが行われます。
選択した領域からの画像は、高解像度のパラメータを使用してミトコンドリア、核、およびマイクロビリを視覚化して取得することができます。たとえば、解決されたモザイク マップの自動取得が選択された後、対象となる領域を切り取ったり、領域内の追加の局所イメージング領域を定義するために使用したりできます。ショウジョウバエ腸内の異なる特殊な細胞タイプはランダムに分布しているが、単一のセクションまたは連続画像のコレクションとして、高解像度パラメータを使用して画像をスクリーニングした後に視覚的に区別することができる。アライメントの後、スタックはさまざまなソフトウェア ソリューションを使用してレンダリングできます。
アレイ断層撮影解析では、単一のウェハ上に多数のシーケンシャルセクションを生成し、低解像度パラメータを使用してスクリーニングして、一般的な対象領域を局所化することができます。これらの領域は、高度な取得パラメータを使用して、さらなる解析の対象にすることができます。例えば、細胞は棄権帯に比べて比較的大きいため、記体の菌体分裂は超構造レベルで局所化することは容易ではない。
ただし、この方法を使用すると、20 ~40 セクションの飛躍の自動中解像度の概要画像を使用して、分割セルをローカライズできます。アレイ断層法は、より簡単な電子顕微鏡データ解析を提供します。私たちは、再生を習得し、地図関連のワークフローに慣れるに投資する視聴者を奨励する私たちの経験では、いくつかの研究トピックは、動物全体または臓器全体の超構造分析を必要としません。
我々の方法は、細胞とそれらの相互作用パートナーの組織における迅速な局在化に役立ちます。
