Name: array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

우리는 AT 절차의 다른 단계의 이 발달 도중 그들의 지원에 대한 로잔 대학의 EM 시설의 회원들에게 감사드립니다. 우리는 가레스 그리피스, 마르타 로드리게스, 우르스카 렙니크, 크리스텔 제노드, 헬무트 그네기, 에이나트 젤링거, 파올라 모레노 로마, 루시 오브라이언과 린지 르웰린에게 원고와 비판적 독서를 준비하는 동안 토론을 하고 싶습니다. 마티아스 루솔프, 미하일 니콜라예프, 데반잘리 두타, 틸 마자트, 패니 랭글렛 등 다양한 시나리오를 시연하는 데 사용된 샘플을 인정하고 싶습니다.

참고: 샘플 준비 방법은14,30,31의다른 곳에서 설명되며 이 출판물에서는 다루지 않습니다. 요컨대, 표시된 예는 글루타랄데히드로 화학적으로 고정되었고, 1% OsO4로고정된 다음, 포함된 수지에 포함되기 전에 1% 수성 우라일 아세테이트로 처리하였다. 또는, 시료는 고압 동결, 아세톤에 0.1% 우라일 아세테이트로 대체된 동결, 아크릴 수지에 내장된 동결을 사용하여 제조될 수 있다. 샘플 블록은 시료의 명확한 뷰를 허용하는 플랫 임베딩 방법을 사용하여 제조되었으며, 단면에 대한 방향을 용이하게하였다(도 1B).
1. 어레이 생성 절차
<ol><li>임베디드 샘플 방향 및 트리밍<ol>
<li>쌍안경/현미경을 사용하여 면도날로 블록 표면을 가볍게 긁음으로써 임베디드 블록 표면에 ROI를 식별하고 표시합니다. 이것은 초미세토메 내부의 샘플을 방향을 지정하는 데 도움이되며 단면 표면을 줄일 수 있습니다.</li>
		<li>초미세토메홀더(그림 2A)에샘플을 고정합니다.</li>
		<li>시료 주위의 수지(수지 트리밍)를 먼저 면도날(거친 트리밍)으로 자르고 다이아몬드 트리밍 도구(미세 트리밍)를 계속합니다. 그림 2A). 블록의 상단 및 하단 표면이 칼의 절삭날과 평행하도록 20° 또는 90° 가장자리 경사가 있는 칼을 사용합니다. 참고: 이 단계는 직렬 리본의 직렬 단면 화 및 획득에 매우 중요합니다.</li>
		<li>자일렌과 접착제를 3:1 비율로 섞습니다. 이쑤시개에 속눈썹이 부착되어 이 혼합물을 트리밍 된 블록의 상단과 아래쪽 가장자리에 바하십시오. 건조하게 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배열 장착 지지대 A(예: 실리콘 웨이퍼)를 준비합니다.<ol>
<li>웨이퍼 클리빙 도구(EMS)를 사용하여 웨이퍼 조각을 잘라 프로젝트 목표에 맞게 크기를 조정합니다. 2cm x 4cm는 빛과 전자 현미경 관찰 모두에 편리합니다.</li>
		<li>잔해를 제거하기 위해 증류수로 웨이퍼를 청소하십시오.</li>
		<li>표준 장비를 사용하여 표면을 청소하는 글로우 방전/플라즈마. 정확한 매개 변수는 사용된 컴퓨터에 따라 달라집니다. 그리드 방전의 매개 변수로 시작하여 시간을 경험적으로 조정합니다. 이 단계는 섹션이 건조하고 생략되어서는 안되는 동안 지지층의 섹션을 잘 확산시키는 데 중요합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배열 장착 지지대 B(예: 유리 커버슬립)를 준비합니다.<ol>
<li>멀티플렉스 면역 라벨링 실험을 계획하는 경우 커버슬립에 샘플을 전송하여 형광 신호를 더 잘 감지합니다. 커버슬립 접착제를 개선하기 위해, 상세한 젤라틴 코팅 절차를 사용하여 이전에 설명된9.</li>
		<li>증발에 의한 인듐 주석 산화물(ITO) 또는 금으로 슬라이드를 코팅하여 전도도를 증가시다. 준비된 커버립을 깨끗한 환경에서 유지합니다. 글로우는 1.2.3에 설명된 바와 같이 샘플을 배출한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 샘플의 절제
<ol><li>칼 준비시 참고: 배열을 생성하려면 긴 리본을 쉽게 수집할 수 있도록 설계된 수정된 칼(ATS)을 사용합니다. 히스토 점보 나이프 또는 대형 지지대의 섹션 생성을 위해 고안된 이와 유사한 칼은 AT 단면에도 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>거품이 끈적 끈적한 테이프를 사용하여 칼의 바닥에 바늘을 부착하고 관통(도 2B). ATS 나이프를 초미세토메 홀더에 0°로 놓습니다. 표준 절차를 사용하여 칼의 가장자리를 블록 표면에 평행하게 조정합니다.</li>
		<li>트리밍된 블록을 칼 가장자리에 놓고 단면에 대비한 위치에 놓습니다.</li>
		<li>웨이퍼/커버슬립을 칼 분지 내부에 놓고 칼로 가장자리를 같은 수준으로 채웁니다. 칼의 다이아몬드 가장자리가 제대로 가습하고 필요한 경우 부착 된 주사기(도 2C)를사용하여 물을 철회하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>배열 단면 및 전송<ol>
<li>원하는 절단 매개 변수에 마이크로토메를 설정합니다. ATS 나이프의 경우 50-100 nm의 범위와 0.6-1 mm/s의 절삭 속도를 내는 것이 좋습니다. 시작 단면(그림 2Di).</li>
		<li>대상 z 볼륨을 커버하고 컬렉션을 중지하는 길이의 리본을 가져옵니다. 블록 크기, 조직의 균질성 및 수지 의 종류에 따라 리본은 비교적 직선(도 2D-ii)이될 것입니다. 많은 샘플은 투자 된 노력과 칼의 종류가 사용에도 불구하고 직선 리본을 생성하지 않습니다.</li>
		<li>최종 목표에 따라 길게 또는 여러 개의 짧은 리본을 나란히 정렬합니다. 2cm x 4cm 지지대는 100~1,000개의 섹션을 편리하게 보관할 수 있습니다. 지원 단계에 리본의 배열은 손재주가 필요하고 꾸준한 손을 필요로하는 단계입니다. 그러나 이 기술에 대한 학습 곡선은 빠르게 획득됩니다.</li>
		<li>이쑤시개에 붙어 있는 속눈썹의 깨끗하고 끈적끈적한 끝을 사용하여 칼 날로부터 리본을 분리합니다(그림2Diii).</li>
		<li>속눈썹을 사용하여 리본을 지지 매체의 중앙 위로 부드럽게 이동합니다. 이 시점에서 필요한 경우 섹션의 스트레칭을 위해 클로로폼 또는 가열 펜을 사용합니다. 그러나,이 조작은 리본 파괴 및 변형을 유도 할 수 있음을 기억하십시오.</li>
		<li>주사기를 당겨 물을 배수하기 시작합니다. 더 섬세한 리본이나 느린 물 회수를 위해 호스에서 주사기를 분리하여 물을 떨어 뜨립니다. 수위가 웨이퍼 레벨로 낮아지면 리본을 제어하고 필요한 경우 리본을 중앙으로 부드럽게 밀어 내십시오. 웨이퍼 표면에 리본을 정착한 후, 나머지 물이 분지에서 완전히 후퇴될 때까지 계속 배수합니다. 참고: 바닥 물 회수 ATS 나이프를 사용하지 않는 경우 ATS 나이프의 측면에서 물을 조심스럽게 줄여 난기류를 유발하지 않습니다.</li>
		<li>욕조 내부에 지지부분에 섹션을 두어 완전히 건조시다. 지지층의 소수성 및 환경 습도 수준에 따라, 물은 다른 속도로 증발한다(도2Div). 시료가 천천히 건조하여 점감하거나 완전히 샘플의 모든 주름을 피하는 것이 중요합니다.</li>
		<li>건조 시료를 단단히 닫힌 상자에 옮겨 먼지 오염으로부터 보호하고 최소 30분 동안 60°C 오븐에 놓습니다. 필요한 경우, 전체 대비를 향상시키기 위해 중금속을 사용하여 카운터 스테인 섹션.</li>
		<li>절차가 끝나면 제조업체의 지시에 따라 조심스럽게 칼을 청소하십시오. 참고: 슬롯 그리드(그림2F)에서의전송과 비교하여 웨이퍼(그림2E)에여러 또는 직렬 섹션의 전송이 EM 준비 환경을 완전히 변화시다. 단일 지원에 대한 섹션의 중단 없는 단면 및 컬렉션은 직렬 단면에서 자주 찾는 섹션 및 섹션 컬렉션 관련 실수의 양을 줄입니다. 하나의 웨이퍼에 수집된 1000 μm x 500 μm의 100개 섹션에 해당되는 것은 33개의 슬롯그리드(그림 2G)에해당한다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 샘플 관찰
참고: 이 섹션에서는 상용 소프트웨어를 사용하여 구현된 워크플로 단계를 설명합니다(재료 표참조). 올바른 검출기가 장착된 모든 SEM의 모든 이미지 수집 소프트웨어를 사용할 수 있지만 특정 사용자 작업은 다르며 종종 더 많은 수동 작업이 될 수 있습니다.
<ol><li>웨이퍼의 섹션 위치를 보여주는 SEM 이미지의 개요 맵을 획득합니다. 내장된 광학 카메라 이미지는 섹션 또는 모든 섹션의 리본을 덮는 SEM 이미지 모자이크를 정의하는 데 도움이 됩니다. 샘플의 카메라 이미지 오른쪽에 마우스로 클릭 드래그하여 모자이크를 만들고 자동 수집을시작합니다. 참고: 매우 거친 이미징 설정, 즉 1-2 μm 픽셀 크기와 1 μs가 충분합니다. 이 과정은 보충 자료(2-7쪽)에 설명되어 있습니다.</li>
	<li>섹션 파인더 자동 탐지 기능이 있는 섹션을 찾거나 수동으로 찾을 수 있습니다. 섹션 위치 및 윤곽선은 이미지 일치를 기반으로 이 소프트웨어로 자동으로 검색됩니다. 이 프로세스의 그림은 보충 자료(8쪽 - 15쪽)를 참조하십시오.</li>
	<li>개요 이미지가 ROI를 명확하게 표시하지 않는 경우 섹션의 고해상도 이미지를 얻습니다. 섹션 미리 보기 함수를 사용하여 이미지를 자동으로 만들고 획득합니다. 이 과정은 보충 자료,16-18 페이지에 설명되어 있습니다. 이미징 설정은 사용자가 검색하는 ROI의 특성 과 크기에 따라 선택해야 합니다.<ol>
<li>최적의 설정을 찾으려면 현미경 제어 소프트웨어에서 라이브 이미징을 활성화하고 하나의 ROI로 이동합니다. 이미지가 ROI를 명확하게 표시할 때까지 이미징 설정을 변경하지만 이미지 수집이 지나치게 길지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이미징 영역 정의 참고: 몇 가지 다른 전략이 제안됩니다.<ol>
<li>몇 섹션만 이미지화해야 하는 경우 지금까지 생성된 섹션의 이미지를 사용하여 관련 섹션으로 탐색하고 원래 상대 위치에 있는 모든 획득된 이미지를 보여 주는 Zoomable Viewer를 사용하여 모든 섹션을 살펴봅니다. 고해상도로 이미지화해야 하는 섹션이 발견되면 클릭 드래그가 있는 이미징 영역을 만듭니다. 고해상도 이미징 설정을 선택하고 템플릿에 설정을 저장합니다. 이 템플릿을 다시 사용하여 추가 섹션에 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>희귀 한 이벤트를 감지하기 위해 특히 작거나 어렵다는 것을 찾으려면 측면 검사 방법을 사용합니다. 10분의 1섹션마다 고해상도 이미징 설정이 있는 이미징 영역을 리본당 한 섹션에 수동으로 만들고 이미지를 수집합니다. 소프트웨어에 ROI가 포함된 이미지 및 표시 섹션을 검토하거나 메모를 작성합니다.<ol>
<li>ROI를 포함하는 섹션에서 시작하여 섹션 집합을 앞뒤로 탐색하고 구조가 섹션에 여전히 표시되는 한 동일한 상대 위치에 고해상도 이미징 영역을 만듭니다. 수동으로 또는 다음 단계에서 설명된 프로시저를 사용하여 수행할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>10개 이상의 연속 섹션에서 이미지를 수집합니다. 이미지를 확대한 후 위치 구체화를 시작하여 설명서에 설명된 대로 등록된 섹션 위치의 정밀도를 높입니다. 이렇게 하면 이미지 시리즈의 위치 가변성이 줄어듭니다. 절차는 설명 및 보충 자료 페이지 19-21에 설명된다.</li>
		<li>모든 섹션을 클릭하여 Alt 키를 누르고 이미징 영역을 정의하고 마우스 버튼이 해제될 때 열리는 컨텍스트 메뉴에서 타일 세트 배열 만들기를 선택합니다. 그런 다음 소프트웨어는 이전에 발견되거나 표시된 모든 섹션에서 동일한 상대 위치에 이미징 영역을 만듭니다. 이미징을 섹션 스팬 슬라이더를 사용하여 특정 섹션 범위로 제한할 수 있습니다. 참고: 이 절차는 이미징 영역의 수와 함께 반복될 수 있으므로 각 섹션에 하나의 더 큰 이미지를 기록하는 대신 많은 작은 고해상도 이미지를 기록할 수 있습니다.</li>
		<li>일단 만들어지면 필요에 따라 각 이미지 시리즈에서 픽셀 수, 픽셀 크기, 타일링 레이아웃, 픽셀 거주 시간 등을 설정합니다. 이미징 시리즈가 만들어지고 설정되면 모두 작업 큐에 나열됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>자동 기능 구성 및 이미지 수집 시작<ol>
<li>이전 단계에서 설명하는 것과 동일한 메서드를 사용하여 자동 기능에 대한 별도의 이미지 시리즈를 만듭니다. 이미지 계열을 고대비 구조가 포함된 섹션의 위치로 이동합니다.</li>
		<li>이미지 시리즈를 1024 x 884 픽셀로 설정하고 이전 단계에서 설정된 이미지 계열에서 사용되는 가장 높은 해상도에 해당하는 픽셀 크기를 선택합니다. 자동 기능 목록에서 자동 초점 및 자동 낙인을확인합니다.</li>
		<li>획득 시퀀스 컨트롤의 섹션별로 선택하고 자동 함수 이미지가 목록의 첫 번째 항목인지 확인합니다. 작업 큐 옆에 있는 실행 단추를 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다. 이러한 절차는 보충 자료,22-23 페이지에 설명되어 있습니다. 참고: 각 섹션에 수동으로 사전 집중할 필요는 없습니다. 기록 세션 동안 현미경이 새 섹션으로 진행될 때마다 이 섹션에 다른 모든 이미지가 기록되기 전에 자동 기능이 실행됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 데이터 정렬 및 분석
<ol><li>데이터 내보내기<ol>
<li>데이터가 .tif 형식으로 저장되어 있는지 확인하므로 전용 내보내기 기능이 필요하지 않습니다. 레이어 트리의 레이어 및 요소에 직접 해당하는 폴더 구조로 데이터를 정렬합니다.</li>
		<li>이미지 모자이크가 기록되면 StitchAll 함수를 사용하여 모든 타일을 자동으로 스티치합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피지에서 스택 정렬 및 자르기 메모. 많은 소프트웨어 패키지(무료 및 상용)를 사용하여 배열 단층 촬영 데이터로 작업할 수 있습니다. 아래 단계는 널리 사용할 수 있기 때문에 오픈 소스 프로그램 피지와 함께 표시됩니다32 필요한 모든 기능을 포함.<ol>
<li>가상 스택으로 피지에 이미지 (또는 스티치 이미지)의 스택을 가져옵니다.</li>
		<li>대비/밝기를 정규화해야 하는 경우 향상된 콘트라스트를선택하십시오... 프로세스 메뉴에서. 포화 픽셀을 0.1 이하로 설정하고 모든 슬라이스 프로세스를 확인합니다.</li>
		<li>플러그인 메뉴에서 등록 | 선택 SIFT와 선형 스택 정렬.</li>
		<li>예상 변환 드롭다운 메뉴에서 강성 또는 Affine을 선택합니다. 그렇지 않으면 기본 설정을 유지합니다. 확인을클릭하여 정렬을 시작합니다. 참고: 데이터를 가상 스택으로 로드하면 피지가 모든 크기의 스택을 처리할 수 있습니다. 선형의 출력은 RAM에서 만들어집니다. 그러나 처리할 수 있는 스택의 최대 크기를 제한할 수 있습니다. 이 경우 동일한 등록 알고리즘의 폴더 간 구현인 가상 스택 조각 등록을사용합니다. 등록이 완료되면 출력 데이터를 가상 스택으로 로드합니다.</li>
		<li>ROI만 포함되도록 자르기(Crop)를 클릭하여 이미지 스택을 자르게 합니다.</li>
		<li>스택을 단일 .tif 이미지 또는 일련의 .tif 이미지로 저장합니다. 참고: 배열 단층 촬영의 중요한 단계는 그림 3에표시됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>Lucas, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+and+integrated+light+and+electron+microscopy+of+in-resin+GFP+fluorescence,+used+to+localise+diacylglycerol+in+mammalian+cells.">Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).</li><li>Markert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+subcellular+localization+with+superresolution+array+tomography+on+ultrathin+sections+of+various+species.">3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species.</a> Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).</li><li>Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+precise+and+rapid+mapping+protocol+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+small+invertebrate+organisms.">A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms.</a> Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).</li><li>Kolotuev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+correlative+anatomy+of+invertebrate+model+organisms+increases+efficiency+of+TEM+data+production.">Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).</li><li>Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+acetylcholine+signaling+through+a+muscarinic+receptor+regulates+cell+migration.">Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster.">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li><li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis.">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li><li>Knoblich, J. 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R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+image+browser:+A+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets.">Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li></ol>

저자 틸만 프랭크는 전자 현미경과 문서에 사용되는 파일럿 프로그램을 제조 Thermo Fisher의 직원입니다.

전자 현미경 검사는 세포와 유기체의 초구조에 대한 통찰력을 제공하며, 이는 종종 3 차원 컨텍스트에 대한 관심구조를 이미지하는 것이 바람직합니다. 초구조 분석을 위한 수많은 EM 전술에도 불구하고 여전히 "골드 스탠다드" 솔루션은 없습니다. 주된 이유는 다양한 샘플, 많은 생물학적 질문으로, 종종 맞춤형 접근이 필요합니다. 제안된 AT 워크플로우는 샘플 처리, 데이터 수집, 평가 및 저장소에 필요한 시간을 최소화하도록 설계되었습니다. 또한 수정된 나이프는 배열 수집을 단순화하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 웨이퍼의 섹션의 컴팩트한 레이아웃은 샘플의 관찰 및 후속 저장모두에 편리합니다. 이 배열을 사용하면 리본에서 리본으로 수평으로 이동하고 각 섹션에 하나의 섹션만 스캔하여 샘플의 "측면 스크리닝"을 가능하게 하여 ROI를 국소화하는 데 필요한 시간을 크게 줄입니다. 제안된 데이터 수집 시나리오는 작고 무작위로 분산된 영역의 타겟팅을 용이하게 합니다. 일단 발견되면 AT/SEM은 수동으로 수행하든 자동 기능의 도움으로 고해상도 이미징을 관심 있는 볼륨으로 정확하게 제한합니다. 제한된 볼륨에 대한 AT는 작업자가 샘플을 탐색하고 이미징 영역을 하나씩 정의하는 것으로 수동으로 완료할 수 있습니다. 소프트웨어의 자동화된 모듈은 큰 섹션에서 작은 영역의 이미징을 위한 유연한 이미지 수집 전략을 제공합니다. 이 소프트웨어의 자동화를 통해 수백 개의 섹션에 대형 고해상도 이미지를 기록하여 SBFI와 유사한 볼륨을 달성할 수 있습니다. 모든 섹션의 개요 이미지를 기록하면 ROI 현지화가 간소화되고 현미경에서 소요되는 시간을 줄입니다. 오버뷰 및 고해상도 미리 보기 기록 중에 섹션이 손상되지 않으므로 AT/SEM은 샘플을 재사용하여 다른 ROI의 추가 데이터를 수집하거나 더 높은 해상도로 수집할 수 있도록 허용합니다.
이미지 수집 시간은 3D EM의 가장 중요하고 가장 비싼 측면 중 하나이므로 실험 설계에서 고려해야 합니다. 넓은 부위를 이미징하는 데 작은 영역보다 더 오래 걸리는 것은 놀라운 일이 아니지만, 선택한 이미징 매개 변수에 따라 각 섹션의 획득 시간이 초마다 다를 수 있습니다. 중요한 이미징 매개 변수에는 시야, 해상도 및 거주 시간의 크기가 포함됩니다. 픽셀당 10nm의 목표 해상도와 1 μs의 투지 시간을 가정할 때, 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm 또는 500 μm x500 μm의 필드를 이미징하는 데 4초, 100초 또는 2,500초가 소요됩니다. 우리는 전체 이미징 작업에 필요한 시간을 추정하기 위해 섹션 수로 이러한 섹션별 이미징 시간을 곱할 수 있습니다. 섹션 수가 적거나 현미경 도구 시간이 문제가 없는 경우 섹션당 긴 이미징 시간이 허용될 수 있습니다.
그러나 대부분의 경우 기록 시간을 야간 작업 또는 주말 작업으로 제한해야 합니다. 고려해야 할 3D EM의 똑같이 중요한 측면은 결과 이미지 데이터의 양과 구조입니다. 위에서 언급한 이미징 필드를 100개 섹션에서 기록하는 것은 각각 400MB, 10gb 또는 250gb의 이미지 데이터를 생성합니다. 500 μm x 500 μm 이미지는 각각 2gb보다 큰 추가 문제를 제기합니다. 데이터 평가에 사용되는 많은 소프트웨어 프로그램은 이 크기의 이미지를 열 수 없습니다.
이미징 시간을 줄이기 위해 후속 데이터 평가(예: 재구성, 추적)에 대한 신호 대 잡음 비율 요구 사항을 충족하고 기록을 정의된 ROI로 제한하는 것이 중요합니다. 소프트웨어의 AT 확장은 직렬 섹션의 작은 영역에서 이미지 수집을 용이하게 합니다. 이 소프트웨어는 수동 및 자동 워크플로우및 많은 반자동 변형을 지원합니다: 이미징 영역은 수동으로 배치하고 각 섹션에 초점을 맞출 수 있으며, 사용자는 자동 단면 파인더 및 위치 정렬 기능을 사용할 수 있습니다. 샘플 유형 또는 이미징 목표에 의해 선택되고 지원되는 자동화 수준에 따라 수백 개의 섹션에서 이미지 수집을 설정하는 데 필요한 시간은 전체 근무일(수동으로 완료) 또는 몇 분밖에 걸리지 않습니다. 원칙적으로 배열 단층 촬영은 작은 ROI를 획득하는 다른 3D EM 방법보다 더 어려워집니다. 연속 구간의 부정확한 영역 배치는 더 큰 영역을 획득하여 보상해야 합니다. 예를 들어, ROI가 크기가 20 μm x 20 μm이고 이미징 필드의 단면 위치 가변성이 10μm인 경우, 각 섹션에서 ROI가 완전히 캡처되도록 하기 위해 40 μm x 40 μm 이미지를 획득해야 합니다. 실제 이미지 위치 가변성은 위치 정렬 또는 사용자의 인내심을 위한 소프트웨어 기능의 가용성 또는 품질에 따라 100 μm에서 <10 μm까지 다양합니다. 이 소프트웨어를 사용하면 대부분의 샘플에서 너무 많은 수동 개입없이 10 μm을 달성 할 수 있습니다.
다른 기술과 마찬가지로 AT는 성공적인 데이터 수집에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 약점을 가지고 있으며, 많은 사람들이 다른 단면 기반 방법과 유사합니다. 빈 수지대 조직의 균질분포가 부족하면 곡면또는 파손된 배열이 발생할 수 있습니다. 극단적인 경우, 단면은 지지에서 분리될 수있다(도 6A). 절단 공정 중 가변 압축 또는 스트레칭은 후속섹션(그림 6B)에서가변 영역에서 샘플을 방해할 수 있는 접이를 만들 수 있다. 칼 자국은 손상된 나이프(도6C)를사용하여 수집된 섹션의 표면에 나타날 수 있다. 단면 조건의 차이는 가끔 단면 압축 및 두께 차이를 유도할 수 있습니다. 먼지 또는 먼지 입자는 단면에 착륙하여 관심영역(도 6D)을부분적으로 모호하게 할 수 있습니다. 불완전한 자동 대비, 자동 초점 및 자동 낙인 기능으로 인해 이미지 수집이 실패할 수 있습니다. 자동으로 생성된 이미징 영역의 위치는 가변적일 수 있으며 모든 섹션에서 ROI를 캡처하지 못할 수 있습니다.
스티치 및 정렬 단계에서 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 예를 들어 샘플 내부의 큰 빈 공간으로 인해 모자이크 타일 획득의 자동 스티치가 실패할 수 있습니다. 3D의 모양이 급격한 변화로 인해 이미지 스택을 등록하기가 어려울 수 있습니다. 특별히 개발 된 프로그램 (예 : IMOD, 피지, TrackEM2, MIB 또는 MAPS-AT)는 반자동 정렬32,38,39,40을용이하게 할 수 있습니다. 사진 편집 소프트웨어를 사용하여 보다 까다로운 섹션을 수동으로 정렬할 수 있습니다. 안타깝게도 일부 데이터 집합은 올바르게 정렬하는 것이 불가능할 수 있습니다.
그리드에 맞는 TEM 직렬 섹션에는 큰 샘플이 까다롭습니다. 반면에 많은 프로젝트는 FIB/SEM 또는 SBF-SEM을 사용하여 긴 자동 인수를 정당화하지 않습니다. AT는 웨이퍼의 직렬 섹션의 수집 및 조작이 슬롯 그리드보다 더 간단합니다 지루한 직렬 섹션 TEM에 대한 간단한 대안입니다. 배열의 수집을 용이하게 하기 위해 여러 전략이 개발되었으며 기존 툴킷을 확장하는 방법을 공유합니다. ROI의 식별이 어려운 경우 AT-SEM은 50~500개 섹션에서 세포기관 스케일 분해능이 필요한 샘플의 효율적인 선별과 함께 근본적인 이점을 제공합니다. 더 많은 볼륨의 경우 더 많은 섹션이 필요한 경우 자동 컬렉션 AT 전략을 효율적으로 수집할 수 있습니다. AT 샘플은 이전에 획득한 개요 이미지를 기반으로 고해상도 영역의 표적 이미징을 용이하게 하여 여러 번 다시 이미지화할 수 있습니다. 여기에서 제안된 AT/SEM에 의한 목표 분석 및 축소된 오버샘플링이 인건비 및 데이터 저장 요구 사항을 감소시한다고 생각합니다. 궁극적으로, 섹션의 라이브러리를 수집하고 나중에 재사용 및 상담을 위해 유지 관리 할 수 있습니다. 볼륨 획득의 경우 FIB 또는 SBF-SEM 접근 방식은 ROI가 블록 면에서 쉽게 식별할 수 있거나 분석에 큰 3D 볼륨이 필요한 경우 탁월한 솔루션을 제공합니다. 그러나 FIB/SBF-SEM은 고해상도 스택 이미지를 대상으로 정의된 ROI에서 수집해야 할 때 효율성이 낮습니다. 결론적으로 AT 샘플을 선별하는 제안된 방법과 중간 해상도 개요 이미지를 사용하면 이미지 수집을 섹션 배열의 관련 부분으로 제한할 수 있습니다. 이미징 영역을 정밀하게 목표로 하면 데이터 간 속도가 빨라지고 데이터 평가를 간소화합니다.
요약하자면, AT/SEM의 개념은 참신하지는 않지만, 그 사용은 여전히 그 장점이 제안하는 만큼 광범위하지 않습니다. 전반적으로 다른 기존 EM 메서드에 대한 보완 적인 절차를 제공합니다. AT/SEM은 광범위한 샘플 준비 프로토콜 및 이미징 워크플로우와 호환되며 모든 FIB/SEM 또는 SBF-SEM 현미경에서 동반 된 기술로 수행 할 수 있습니다. 이 문서에서는 다른 방법으로 성공적으로 해결할 가능성이 적은 샘플의 초구조 데이터를 기록하기 위해 AT에 집중했습니다. 우리는 섹션의 편리한 수집에 대한 설명 된 절차와 상당히 자동화 된 인수 전략이 방법을 만난 적이없는 사람들을위한 첫 번째 시도에 도움이 될 것이며 이미 경험이있는 사람들을 위해 그것을 완벽하게 하는 데 도움이되기를 바랍니다.

EM 관련 기술의 중요성에도 불구하고 이를 마스터하는 데 필요한 노력은 소수의 전문가로 제한된 전체 분야를 유지합니다. 한 가지 중요한 어려움은 EM에 대해 보존된 샘플에서 관심 영역(ROI)을 식별하고 검색하는 것입니다. 동일한 샘플의 외관은 광학 현미경 검사법에 의해 분석될 때 와 EM 관찰을 위한 처리 후에 상당히 다릅니다. 화학적으로 제조된 시료에 대한 변화는 탈수 단계(각 차원에서~10%)와 고정 및 염색 프로토콜에서 osmium을 사용할 때 형광손실(도1A)을포함한다. 초박형 단면의 경우, 샘플은 상이한전략(도 1B)을사용하여 에폭시 또는 아크릴 수지에 내장되어 있습니다. 이 준비의 성공적인 결과를 얻으려면 전체 샘플을 1mm x 1mm를 초과하지 않는 조각으로 분별해야 합니다. 표준 전송 전자 현미경 검사법 (TEM) 관측 조건의 요구 사항을 충족하기 위해, 샘플의이 작은 부분은 추가 50-150 nm 두께의 조각으로 단면된다. 결과 그레이스케일 이미지는 다른 현미경기술(도 1C)보다더 자세하게 전체 샘플의 분분의 조직 조직 및 세포기관 구조를 보여줍니다. 일반적인 TEM 데이터 집합은 이론적으로 세포 및 조직의 3D 공간에서 발생하는 프로세스를 이해하기 위해 추정된 2D 정보를 제공합니다. 도 1D는 초구조적 볼륨 획득의 과제를 제시합니다: 측면 1,000 μm의 큐브가 50nm 두께로 단면되는 경우, 전체 부피를 커버하기 위해 20,000개의 섹션이 필요합니다. 500 μm 측면 큐브의 경우 10,000개의 섹션이 됩니다. 50 μm x 50 μm x 50 μm 부피를 커버하려면 1,000개의 섹션이 "만" 필요할 수 있습니다. 이 볼륨을 수동으로 얻는 것은 실질적으로 불가능하고 자동화로 수행하기가 매우 어렵습니다. 시료 깊이 이외에, 우리는 이러한 가상 큐브의 전체 표면을 커버해야하는 경우, 합리적인 해상도에 1 μm2 표면의 범위는 심각한 물류 문제가된다(도 1E). 커넥토믹스 접근법과 같은 비범한 대규모 프로젝트의 경우 많은 섹션이 중요하지만, 대부분의 "평범한" EM 프로젝트에서 관찰에 필요한 더 많은 섹션을 생성하는 것은 상당한 단점을 제시합니다.
3D 초구조 적 정보를 획득하는 몇 가지 방법이 있습니다 : 직렬 변속기 전자 현미경 검사법 (TEM), TEM 단층 촬영, 배열 단층 촬영 (AT), 직렬 블록 얼굴 이미징 스캐닝 전자 현미경 검사 (SBF-SEM), 집중 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 검사 (FIB-SEM). 이러한 메서드 간의 주요 차이점은 단면 화 전략과 이미지 수집이 섹션생성 1과결합되는지 여부입니다. 직렬 단면 TEM에서 순차적인 섹션은 슬롯 그리드에서 수집되며, TEM 이미지는 이러한 시퀀스에서 생성되고정렬된 2,3,4,5. TEM 단층 촬영에서, 그리드의 150-300 nm 섹션에서 틸트 계열, 그리고 직렬 단면에 결합 할 때, 상대적으로 작은 볼륨6,7,8하지만,매우 높은해상도를제공합니다 . AT 접근 방식은 유리 커버슬립, 실리콘 웨이퍼 또는 특수 테이프와 같이 상대적으로 큰 지지에 다양한 수동 및 반자동 섹션 컬렉션의 물리적 단면을 사용합니다. 이미지 수집의 경우, 다양한 이미지 수집 전략이9,10,11,12,13,14,15로 SEM에서 분석된다. SBF-SEM의 경우, 물리적 단면은 SEM 챔버 내부에 직접 설정된 다이아몬드 나이프가 있는 미니 마이크로토메를 사용하여달성되며, 수지블록(16,17,18,19)의표면에서 생성된 SEM 영상을 갖는다. FIB-SEM의 경우, 이온 소스는 샘플의 얇은 층을 제거하고, 그 다음에 는 SEM20, 21에의해 노출된 표면의 자동 이미징이뒤따릅니다. TEM 단층 촬영 및 AT는 필요한 경우 다시 이미지화 할 수있는 물리적 섹션을 생성하며 FSBF-SEM 및 FIB-SEM은 이미징 후 섹션을 제거합니다. 멀티 빔 SEM에 의해 이미지된 물리적 섹션의 최근 조합은 이미지 수집속도(22)의"병목 현상" 문제를 해결하는 방법의 조합을 제공한다. 이러한 각 기술은 EM 데이터를 획득하고 분석하는 방식에 혁명을 일으켰으며 각 접근 방식은 주어진 연구 질문과 관련된 실질적인 영향을 미칩니다.
초구조적 차원의 준비 의 특성과 스케일을 감안할 때, 시료블록(Figure1D,E)에특정 대상 구조가 어디에 있는지 예측하는 것은 간단하지 않다. ROI 지역화의 한 가지 솔루션은 처음부터 원하는 해상도로 전체 블록의 이미지를 기록하는 것입니다. 관심구조는 현미경으로부터 멀어질 때 획득된 데이터 볼륨에 있을 수 있다. 이 전략과 관련된 수집 시간 및 데이터 처리는 문제가 됩니다. 기록된 데이터의 양을 감소시키는 것이 바람직하며, 특히 ROI가 조직 블록보다 훨씬 작은 경우, 즉 관심있는 개체가 특정 유형의 세포(전체 장기가 아님)인 경우. 상이한 상이한 상이한 상반되는 광및 전자 현미경기술(CLEM)은 동일한 샘플23,24,25,26,27,28,29내에서 제조 전후에 형광이 보존되고 국한될 때 성공할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 많은 세포 구조는 알려진 초구조에 기초한 형광 상관관계 없이도 인식할 수 있다. 이러한 경우 측면 스크리닝 어레이 단층 촬영은 ROI 현지화에 투자된 노력과 초구조적 정보 품질 사이의 균형 절충을 제공한다고 생각합니다. 이 전략을 사용하여 웨이퍼의 하위 섹션 집합은 ROI의 크기와 특성에 따라 설정할 수 있는 일정한 간격으로 검사됩니다. ROI가 발견되면, 데이터 수집은 앵커 섹션 전후부터 종료되는 일련의 섹션으로 설정되어 관련 정보를 대상으로 수집합니다.
우리는 다양한 섹션에서 지역 또는 관심의 이벤트의 인수를 단순화하고 가속화하고 더 잘 정렬 된 이미지 볼륨을 산출 AT에 대한 프로토콜을 제시한다. 측면 스크리닝 및 다단계 획득은 정밀타겟팅 된 지역에서 매우 높은 해상도의 데이터를 생성합니다. 우리가 설명하는 절차는 3D EM 데이터 수집의 몇 가지 과제를 해결합니다: 샘플 준비 워크플로우를 근본적으로 변경하지 않고 광범위한 표본과의 호환성; 단면 및 SEM 인수를 위한 대상 현지화; 설정 시 시간과 노력이 줄어듭니다. 결과 볼륨의 더 나은 정렬과 여러 섹션에서 영역의 이미징; 그리고 스티치 모자이크 그림으로 다른 이미지를 컴파일하는 부드러운 스티치 및 정렬 절차. 우리는 출판 및 진행 중인 프로젝트에서 여러 샘플로 방법의 강도를 입증하기로 결정했습니다. 우리는 이 접근 방식이 EM 경험이 제한된 조사관에게도 표적 EM 데이터의 생성 및 수집을 크게 촉진할 수 있다고 믿습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AT sectioning knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUATS3530</td>
			<td>Diatome Jumbo knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td>Diatome trimming 20&#176; 
			Glass knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16015</td>
			<td>Resistance: 1-30 Ohms 
			Type P: (Boron) (1 primary flat) 
			Roughness: 2 nm 
			No SiO2 top coating 
			TTV: = &#60;20 &#181;m 
			Wafer is polished on one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer cleaving kit</td>
			<td>EMS</td>
			<td>7642</td>
			<td>EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Thermo Fischer Helios</td>
			<td>1072419</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maps 3 for SEM with Correlative Workflow &#38; Array Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1135932</td>
			<td>Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira x.y</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131599</td>
			<td>Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td>IMOD, MIB (See text for refferences)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy

전자 현미경 검사는 나노미터 해상도에서 세포 및 구조 적 세부 사항의 이미징을 위한 생물학 및 의학에서 적용됩니다. 역사적으로, 전염 전자 현미경 검사법 (TEM)은 세포 초음파 구조에 대한 통찰력을 제공했지만, 최근 10 년 동안 현대 스캐닝 전자 현미경 (SEM)의 개발은 세포 내부를 찾는 방식을 변화시켰습니다. 단백질 수준의 구조적 세부 사항이 필요할 때 TEM의 해상도가 우수하더라도, SEM 해상도는 세포 수준 세포 생물학 관련 질문의 대다수에 충분합니다. 기술의 발전으로 직렬 블록 페이스 이미징(SBF-SEM) 및 포커스이있는 이온 빔 SEM(FIB-SEM)과 같은 자동 볼륨 획득 솔루션이 활성화되었습니다. 그럼에도 불구하고, 현재까지 이러한 방법은 관심 지역에 대한 식별 및 탐색이 중요할 때 비효율적이지 않습니다. 이미징 전에 대상 영역을 정확하게 현지화할 수 있는 수단이 없으면 운영자는 필요한 것보다 훨씬 더 많은 데이터를 확보해야 합니다(SBF-SEM) 또는 더 나쁜 경우 많은 그리드를 준비하고 모든 것을 이미지화해야 합니다(TEM). 관심 영역의 국소화를 용이하게 하는 SEM의 Array 단층 촬영을 사용하여 "측면 스크리닝"의 전략을 제안하고, 그 다음으로 전체 샘플 볼륨의 관련 부분의 자동화된 이미징을 제안합니다. 배열 단층 촬영 샘플은 이미징 중에 보존되며 반복 이미징을 위한 섹션 라이브러리로 배열할 수 있습니다. 측면 스크리닝을 통해 다른 방법으로 액세스하기가 매우 어려운 구조적 세부 사항을 분석할 수 있는 몇 가지 예가 표시됩니다.

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Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

우리는 스캐닝 전자 현미경의 자동화 된 이미징 절차와 함께 배열 단층 촬영 샘플로 사용하기 위해 대형 전송 지원에 직렬 섹션의 리본과 컬렉션의 준비를 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 로컬, 희귀 한 이벤트의 스크리닝, 검색 및 표적 이미징및 대량 데이터 볼륨을 수집 할 수 있습니다.

스캐닝 전자 현미경 을 사용하여 대량 정보의 표적 수집을위한 배열 단층 학워크

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

전자 현미경 분석은 빈번히 복잡합니다. 당사는 당사의 프로토콜이 대규모 샘플 표면 및 중간 부피에서 EM 데이터의 처리 및 수집을 용이하게 한다고 믿습니다. 우리의 프로토콜은 직렬 섹션에서 대상 구조를 찾는 데 도움이됩니다.데이터 레코딩은 필요한 것으로 제한됩니다. 전체 조직 블록의 데이터 수집과 비교하여 기록 시간이 단축되고 데이터 분석이 쉬워집니다. 접근의 전반적인 용이성을 감안할 때, 우리는 과학적인 질문뿐만 아니라 진단 도구로도 해결할 수 있다고 믿습니다.분석을 위한 어레이를 생성하려면 먼저 샘플을 초미세토메 홀더에 고정시키고 면도날을 사용하여 샘플 주위의 수지를 대략 다듬습니다. 다이아몬드 트리밍 도구를 사용하여 시료를 미세 다듬고 20도 또는 90도 경사의 트리밍 나이프를 사용하여 블록의 상단 및 하단 표면이 칼의 절삭날과 평행하도록 합니다. 자일렌과 접착제를 3:1 비율로 섞고 이쑤시개에 부착된 속눈썹을 사용하여 트리밍 된 블록의 위쪽과 아래쪽 가장자리에 혼합물을 적용하십시오.혼합물이 건조되는 동안 웨이퍼 클리닝 도구를 사용하여 웨이퍼 조각을 해석에 적합한 크기로 자른다. 웨이퍼를 증류수로 청소하여 이물질을 헹구고 웨이퍼가 건조한 후 플라즈마로 표면을 청소하십시오. 어레이 단층 촬영 나이프를 준비하려면 거품이 많은 끈적끈적한 테이프를 사용하여 히스토 점보 나이프 의 바닥에 바늘을 부착하고 칼을 초미세톰 홀더에 0도 로 넣습니다.칼의 가장자리를 블록 표면에 평행하게 조정하고 절제 할 준비가된 위치에서 잘라진 블록을 칼 가장자리로 가져옵니다. 깨끗한 웨이퍼를 칼 분지에 넣고 분지를 칼 가장자리와 같은 수준으로 채우는 다음, 부착된 주사기를 사용하여 칼의 다이아몬드 가장자리가 제대로 가습하여 필요에 따라 물을 추가하거나 인출하십시오. 어레이 단면의 경우 마이크로토메를 50 내지 100 나노미터의 절삭 범위와 초당 6~1밀리미터의 절삭 속도로 설정하고, 표적 Z 부피를 커버할 수 있을 만큼 긴 리본을 얻기 위해 단면편을 시작합니다.블록 크기, 조직의 균질성 및 수지 의 유형에 따라 리본은 약 직선이 될 것입니다. 속눈썹의 깨끗하고 끈적끈적한 끝을 사용하여 칼 가장자리에서 리본을 분리하십시오. 속눈썹을 사용하여 리본을 지지 매체의 중심으로 부드럽게 이동합니다.클로로폼 또는 가열 펜은 필요한 경우 섹션을 스트레칭하는 데 사용할 수 있습니다. 스트레칭 후 주사기를 철회하여 물을 배수하기 시작합니다. 더 섬세한 리본이나 느린 물 회수를 위해 주사기를 호스에서 분리하여 물이 떨어지게 합니다.수위가 웨이퍼 레벨에 도달하면 리본을 분지 중앙으로 부드럽게 밀어 내고 나머지 모든 물이 분지에서 완전히 제거될 때까지 계속 배수합니다. 깨끗한 환경에서 웨이퍼를 건조시키십시오. 건조는 약 30분이 소요됩니다.시료가 완전히 건조되면 어레이를 단단히 닫힌 상자로 옮겨 먼지 오염으로부터 보호합니다. 그리고 상자를 60도 오븐에 넣고 적어도 30분 동안 보관하십시오. 웨이퍼의 섹션 위치를 보여주는 SEM 이미지의 개요 맵을 획득하려면 내장 된 광학 카메라를 사용하여 섹션의 리본을 덮는 SEM 이미지를 얻습니다.모자이크를 만들려면 샘플의 카메라 이미지를 클릭하고 드래그하여 자동 수집을 시작합니다. 대상 구조를 찾기 위해 더 높은 해상도로 개요를 획득합니다. 몇 섹션만 이미지화해야 하는 경우 확대 가능한 뷰어를 사용하여 원래 위치에서 획득한 이미지를 볼 수 있습니다.고해상도로 이미지화해야 하는 섹션이 식별되면 이미징 영역을 만들고 클릭하고 드래그한 다음 고해상도 이미징 설정을 선택하고 템플릿에 설정을 저장하여 특히 작거나 감지하기 어려운 희귀 이벤트를 찾고, 10단 섹션마다 또는 리본당 한 섹션에 고해상도 이미징 설정을 사용하여 수동으로 이미징 영역을 만들고 이미지를 수집합니다. 그런 다음 관심 영역이 포함된 이미지와 마크 섹션을 검토합니다. 10개 이상의 연속 섹션을 가져오려면 섹션 파인더를 사용하여 모든 섹션을 자동으로 찾습니다.개요 이미지에 관심 영역이 명확하지 않은 경우 섹션의 더 높은 해상도 이미지를 획득하고 섹션 미리 보기 기능을 사용하여 이미지를 자동으로 만들고 획득합니다. 최적의 이미징 설정을 결정하기 위해 현미경 제어 소프트웨어에서 라이브 이미징을 활성화하고 관심 영역으로 이동한 다음, 제조업체의 지침에 따라 이미지가 명확한 관심 영역을 보여줄 때까지 이미징 설정을 조정합니다. 연속 섹션에서 이미징 영역의 위치를 최적화하려면 관심 이미지를 확대/축소하고 위치 수정 을 클릭하여 등록된 섹션 위치의 정밀도를 높입니다.이미징 영역을 정의하려면 Alt 키를 누를 때 모든 섹션을 클릭하고 드래그하고 팝업 컨텍스트 메뉴에서 타일 집합 배열 만들기를 선택합니다. 이 소프트웨어는 발견되었거나 이전에 표시된 모든 섹션에서 동일한 상대 위치에 이미징 영역을 만듭니다. 그런 다음 필요에 따라 각 이미지 시리즈에서 픽셀 수, 픽셀 크기, 타일링 레이아웃 및 픽셀 거주 시간을 설정합니다.자동 기능을 구성하려면 입증된 대로 자동 기능에 대한 별도의 이미지 시리즈를 만들고 이미지 시리즈를 고대비 구조가 포함된 섹션의 위치로 이동합니다. 이미지 시리즈를 1024 x 884 픽셀로 설정하고 이미지 시리즈에서 사용되는 가장 높은 해상도에 해당하는 픽셀 크기를 선택합니다. 자동 기능 목록에서 자동 포커스 및 자동 낙인을 확인합니다.획득 시퀀스 컨트롤에서 양면을 선택하고 자동 함수의 이미지가 목록의 첫 번째 항목인지 확인한 다음 모두 를 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다. 모든 이미징 시리즈가 만들어지고 설정되면 계열이 작업 큐에 나열됩니다. 저해상도 획득은 단일 또는 모자이크 이미징을 사용하여 섹션의 선택된 부분 또는 전체 섹션에서 수동으로 또는 자동으로 직접 수행한 다음 스티치할 수 있습니다.선택된 영역의 이미지는 미토콘드리아, 핵 및 마이크로빌리를 시각화하기 위해 고해상도 파라미터를 사용하여 획득할 수 있으며, 예를 들어, 해결된 모자이크 맵의 자동 획득 후, 여러 관심 영역을 잘라내거나 지역 내의 추가 로컬 이미징 영역을 정의하는 데 사용될 수 있다. Drosophila 창자에 있는 다른 특화된 세포 모형은 무작위로 분포하더라도, 그(것)들은 단일 단에서 또는 직렬 이미지의 집합으로 고해상도 매개변수를 사용하여 심상을 사용하여 심상을 선별한 후에 시각적으로 구별될 수 있습니다. 정렬 후 다른 소프트웨어 솔루션을 사용하여 스택을 렌더링할 수 있습니다.배열 단층 촬영 분석을 사용하면 단일 웨이퍼에서 많은 순차적인 섹션을 생성하고 저해상도 매개 변수를 사용하여 스크리니치하여 일반적인 관심 영역을 지역화할 수 있습니다. 이러한 영역은 고급 수집 매개 변수를 사용하여 추가 분석을 위해 대상이 될 수 있습니다. 예를 들어, 노텀내의 균주 분단은 세포가 복근 영역에 비해 상대적으로 크므로 초구조적 수준에서 국소화하기가 쉽지 않다.그러나 이 방법을 사용하여 20~40개의 단면의 도약의 자동 중간 해상도 개요 이미지를 사용하여 분할 셀을 국소화할 수 있다. 어레이 단층 촬영 절차는 보다 간단한 전자 현미경 데이터 분석을 제공합니다. 우리는 시청자가 재생을 마스터하고지도 관련 워크플로우에 익숙해지는 데 투자할 것을 권장하며, 전체 동물이나 전체 장기에 대한 초구조적 분석이 필요한 연구 주제는 거의 없습니다.우리의 방법은 조직에서 세포와 상호 작용 파트너의 신속한 현지화에 도움이됩니다.

Research

JoVE Journal

Biology

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

주사 전자 현미경으로 간 사인 내피 세포의 분석 및 그들의 Fenestrations위한 표준화 된 방법

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

연구

생물학

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

침연 (macerated) 조직의 전자 현미경을 스캔하면 세포 외 매트릭스를 시각화하기

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

알아내는 주사 전자 현미경에 의해 동결 골절 잎 조직 내에서 광합성 멤브레인의 초분자 조직을 공부

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

스캐닝 전자 현미경 (SEM)에서 형태소 분석에 대 한 화학 건조를 사용 하 여 간결한 진 핵 유기 체의 준비

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

직렬 블록 얼굴 및 집중된 이온 빔 검사 전자 현미경 검사법을 사용하여 표적으로 한 연구 결과

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

생물학적 조직 샘플의 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...