Name: array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Vi vil takke medlemmene av EM-anlegget ved Universitetet i Lausanne for deres støtte under denne utviklingen av ulike trinn i AT-prosedyren. Vi vil takke Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O'Brien og Lindsay Lewellyn for diskusjoner under utarbeidelsen av manuskriptet og kritisk lesning. Vi ønsker å anerkjenne gruppene som bidro med prøvene som ble brukt til å demonstrere de ulike scenariene: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat og Fanny Langlet.

MERK: Eksempler på forberedelsesmetoder er beskrevet andre steder14,30,31, og dekkes ikke i denne publikasjonen. Kort sagt, eksemplene som ble vist var kjemisk festet med glutaraldehyd, post-fast med 1% OsO4, deretter behandlet med 1% vandig uranylacetat før innebygging i innebyggingsharpiksen. Alternativt kan prøver fremstilles ved hjelp av høytrykksfrysing, fryse erstattet med 0,1% uranylacetat i aceton og innebygd i akrylharpiks. Prøveblokker ble utarbeidet ved hjelp av en flat innebyggingsmetode som tillater en klar visning av prøven, noe som letter retningen for inndelingen (figur 1B).
1. Prosedyre for generering av rekker
<ol><li>Innebygd prøveretning og beskjæring<ol>
<li>Bruk kikkerten/mikroskopet til å identifisere og markere avkastningen på den innebygde blokkoverflaten ved å skrape blokkens overflate lett med et barberblad. Dette vil bidra til å orientere prøven inne i ultramikrotomet og vil redusere seksjonsoverflaten.</li>
		<li>Klem prøven på ultramikrotomholderen (Figur 2A).</li>
		<li>Trim harpiksen rundt prøven, først med barberbladet (grov trimming) og fortsett med diamanttrimmingsverktøyet (fin trimming; Figur 2A). Bruk kniver med 20° eller 90° kant helling for å sikre at topp- og bunnflatene på blokken er parallelle med knivens skjærekant. MERK: Dette trinnet er avgjørende for seriell seksjonering og oppkjøp av rette bånd.</li>
		<li>Bland xylen og lim i 3: 1 andel. Med en øyenvippe festet til en tannpirker, bruk denne blandingen på toppen og de nederste kantene på den trimmede blokken. La det tørke grundig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klargjør monteringsstøtten A (dvs. silisiumskiver).<ol>
<li>Klipp waferstykket ved hjelp av et wafer cleaving-verktøy (EMS), og juster størrelsen til prosjektmålet. 2 cm x 4 cm er praktisk for både lys- og elektronmikroskopiobservasjoner.</li>
		<li>Rengjør skiven i destillert vann for å kvitte seg med ruskene.</li>
		<li>Glødutladning/plasma rengjør overflaten ved hjelp av standardutstyr. De nøyaktige parametrene vil avhenge av maskinen som brukes. Start med parametrene for utslipp av gitter og juster tiden empirisk. Dette trinnet er avgjørende for en god spredning av seksjonene på støtten mens seksjonene tørker og bør ikke utelates.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klargjør arrayenes monteringsstøtte B (dvs. glassdeksler)<ol>
<li>Hvis du planlegger multippel immunmerkingseksperimenter, kan du overføre prøvene på en dekslelip for bedre å oppdage fluorescenssignalet. For å forbedre dekslerlip lim, bruk en detaljert gelatin-belegg prosedyre er beskrevet tidligere9.</li>
		<li>Øk ledningsevnen ved å belegge lysbildene med indium-tinnoksid (ITO) eller gull ved fordampning. Hold de tilberedte dekslene i et rent miljø. Glød utladning av prøvene som beskrevet i 1.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Seksjonering av prøven
<ol><li>AT kniv forberedelse MERK: For å generere matrisene, bruk en modifisert kniv (ATS), designet for å lette oppkjøpet av lange bånd. Histo-Jumbo kniver eller lignende kniver unnfanget for generering av seksjonene på store støtter kan tjene for AT seksjonering også.<ol>
<li>Fest nålen til bunnen av kniven ved hjelp av den skummende klebrige tapen og pierce den (Figur 2B). Plasser ATS-kniven i ultramikrotomholderen ved 0°. Juster kanten på kniven parallelt med blokkoverflaten ved hjelp av standardprosedyren.</li>
		<li>Før den trimmede blokken til kanten av kniven i en posisjon som er klar til seksjonering.</li>
		<li>Plasser skiven/dekslene inne i knivbeholderen og fyll den med vann på samme nivå som knivkanten. La diamantkanten av kniven fukte ordentlig og, om nødvendig, trekke ut vann ved hjelp av den vedlagte sprøyten (Figur 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Array-seksjonering og overføring<ol>
<li>Sett mikrotomet til de ønskede skjæreparametrene. Med ATS-kniven anbefales rekkevidden 50-100 nm og en skjærehastighet på 0,6-1 mm / s. Start inndeling (Figur 2Di).</li>
		<li>Skaff deg et bånd av lengden som dekker et målrettet z-volum og stopp samlingen. Avhengig av blokkstørrelsen, homogeniteten til vevet og typen harpiks, vil båndet være relativt rett (Figur 2D-ii). Mange prøver vil ikke produsere rette bånd, til tross for den investerte innsatsen og typen kniv brukes.</li>
		<li>Avhengig av det endelige målet, gjør du ett langt eller flere korte bånd justert side ved side. En støtte på 2 cm x 4 cm kan enkelt holde 100 til 1000 seksjoner. Arrangementet av båndet på støttetrinnet er et trinn som krever fingerferdighet og stødige hender. Imidlertid er læringskurven for denne ferdigheten raskt oppnådd.</li>
		<li>Løsne båndet fra knivkanten ved hjelp av en ren, ikke-klebrig spiss av en øyenvippe limt på tannpirkeren (Figur 2Diii).</li>
		<li>Bruk øyenvippen til å flytte båndet forsiktig over midten av støttemediet. På dette tidspunktet, bruk kloroform eller varmepenn for strekking av seksjonene om nødvendig. Husk imidlertid at denne manipulasjonen kan føre til båndbrudd og deformasjon.</li>
		<li>Begynn å tømme vannet ved å trekke i sprøyten. For mer delikate bånd eller en langsommere vannuttrekking, la vann dryppe ved å løsne sprøyten fra slangen. Når vannstanden senkes til skivenivået, kontrollerer du båndet og omplasserer det om nødvendig ved å skyve båndet forsiktig til midten. Etter å ha avgjort båndene på waferoverflaten, fortsett å drenere til det gjenværende vannet er helt trukket tilbake fra bassenget. MERK: Hvis du ikke bruker ATS-kniven for tilbaketrekking av bunnvann, må du forsiktig redusere vannet fra sidene av ATS-kniven for ikke å fremkalle turbulens.</li>
		<li>La seksjonene på støtten inne i badekaret tørke helt. Avhengig av hydrofobiskheten til støtte- og miljøfuktighetsnivået, vil vann fordampe med en annen hastighet (Figur 2Div). Det er viktig å la prøven tørke sakte for å avta eller helt unngå alle bretter på prøven.</li>
		<li>Overfør den tørre prøven til en tett lukket boks for å beskytte mot smussforurensning og plasser den i en 60 °C ovn i minst 30 minutter. Om nødvendig, motvirke seksjoner ved hjelp av tungmetaller for å forbedre den generelle kontrasten.</li>
		<li>På slutten av prosedyren, rengjør forsiktig kniven i henhold til produsentens instruksjoner MERK: Overføringen av flere eller serielle seksjoner på en wafer (Figur 2E) sammenlignet med overføringen på et sporgitter (Figur 2F) endrer EM-forberedelsesopplevelsen helt. Den uavbrutte inndelingen og samlingen av seksjonene på enkel støtte reduserer mengden seksjonerings- og seksjonssamlingsrelaterte feil som hyppige i seriell seksjonering. Tilsvarende 100 seksjoner på 1000 μm x 500 μm samlet på en wafer tilsvarer 33 sporgitter (Figur 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Eksempelobservasjon
MERK: Denne delen beskriver arbeidsflyttrinnene som implementert ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig programvare (se Tabell over materialer). Enhver bildeanskaffelsesprogramvare på hvilken som helst SEM utstyrt med de riktige detektorene kan brukes, men de spesifikke brukerhandlingene vil variere og vil ofte være mer manuelle.
<ol><li>Skaff deg et oversiktskart over SEM-bilder som avslører seksjonsplasseringer på skiven. Et innebygd optisk kamerabilde hjelper deg med å definere en SEM-bildemosaikk som dekker et bånd av seksjoner eller alle seksjoner. Opprett mosaikken ved å klikke og dra med musen rett på kamerabildet av prøven, og start automatisk anskaffelse. MERK: Svært grove bildebehandlingsinnstillinger, det vil si 1-2 μm pikselstørrelse og 1 μs dvelende tid er nok. Denne prosessen er illustrert i Tilleggsmateriale (side 2-7).</li>
	<li>Finn deler med funksjonen Automatisk gjenkjenning av seksjonssøker, eller finn dem manuelt. Seksjonsposisjoner og disposisjoner hentes automatisk med denne programvaren basert på bildegjenkjenning. For illustrasjon av denne prosessen, se Tilleggsmateriale (side 8 - 15).</li>
	<li>Hvis oversiktsbildene ikke viser ROIer tydelig, kan du skaffe bilder med høyere oppløsning av seksjoner. Bruk funksjonen Forhåndsvisning av inndeling til å opprette og hente bilder automatisk. Denne prosessen er illustrert i Tilleggsmateriale, side 16-18. Bildeinnstillinger må velges i henhold til arten og størrelsen på avkastningen som brukeren søker etter.<ol>
<li>Hvis du vil finne optimale innstillinger, aktiverer du Live Imaging i programvaren for mikroskopkontroll og navigerer til én avkastning. Endre bildeinnstillingene til bildene viser ROIer tydelig, men bildeanskaffelsen er ikke for lang.</li>
	</ol></li>
	<li>Definere bildeområder MERK: Det foreslås flere ulike strategier.<ol>
<li>Hvis bare noen få seksjoner må avbildes, bruker du bildene av seksjoner som er opprettet så langt, til å navigere til de relevante delene og bruke Zoomable Viewer som viser alle innhentede bilder på de opprinnelige relative stedene for å se på alle delene. Når det er funnet en inndeling som skal avbildes med høy oppløsning, oppretter du et bildeområde med klikk og dra. Velg bildeinnstillinger med høy oppløsning, og lagre innstillingene i en mal. Bruk denne malen på nytt for flere deler.</li>
		<li>For å finne spesielt små eller vanskelige å oppdage sjeldne hendelser, bruk Lateral Screening-tilnærmingen. Opprett et bildeområde manuelt med bildeinnstillinger med høy oppløsning i hver tiende del eller på én del per bånd, og hent bildene. Se gjennom bildene og merk seksjonene som inneholder avkastningen i programvaren, eller noter deg.<ol>
<li>Fra inndelinger som inneholder avkastningen, navigerer du fremover og bakover gjennom inndelingssettet og oppretter bildeområder med høy oppløsning på samme relative plasseringer så lenge strukturen fremdeles er synlig i -delen. Dette kan gjøres manuelt eller ved å bruke fremgangsmåten som er beskrevet i de neste trinnene.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hent bilder i mer enn ti påfølgende deler. Klikk Startposisjonsforbedring etter at du har zoomet bildet for å øke presisjonen til registrerte inndelingssteder som beskrevet i håndboken. Når du gjør dette, reduseres plasseringen av bildeserien. Prosedyren er illustrert og forklart i Tilleggsmateriale side 19-21.</li>
		<li>Klikk og dra i en inndeling for å definere et bildeområde mens du holder nede Alt-tasten, og velg Opprett matrise for flissett på hurtigmenyen som åpnes når museknappen slippes. Programvaren oppretter deretter bildeområder på samme relative plassering i alle seksjoner som er funnet eller merket tidligere. Det er mulig å begrense bildebehandlingen til et bestemt område med inndelinger med glidebryteren Seksjonsspenn. MERK: Denne prosedyren kan gjentas med et hvilket som helst antall bildeområder og tillater derfor opptak av mange små høyoppløselige bilder i stedet for å spille inn et enkelt større bilde på hver seksjon.</li>
		<li>Når pikselantallet er opprettet, kan du konfigurere pikselstørrelse, flisoppsett, pikselbohetstid osv. Når bildeserier er opprettet og satt opp, vises alle i en jobbindikator.</li>
	</ol></li>
	<li>Konfigurere automatiske funksjoner og starte bildeanskaffelse<ol>
<li>Opprett en egen bildeserie for automatiske funksjoner ved hjelp av samme metode som beskrevet i forrige trinn. Flytt bildeserien til en plassering i inndelingen som inneholder strukturer med høy kontrast.</li>
		<li>Sett bildeserien til 1024 x 884 piksler, og velg en pikselstørrelse som tilsvarer den høyeste oppløsningen som ble brukt i bildeserien som ble satt opp i de forrige trinnene. I listen over automatiske funksjoner merker du av for Autofokus og Auto Stigmator.</li>
		<li>Velg Etter inndeling i kontrollene for anskaffelsessekvensen, og kontroller at bildet for automatiske funksjoner er det første elementet i listen. Start bildeanskaffelsen ved å klikke Kjør -knappen ved siden av jobbindikatoren. Disse prosedyrene er illustrert i Tilleggsmateriale, side 22-23. MERK: Det er ikke nødvendig å forhåndsfokusere manuelt på hver seksjon. Under innspillingsøkten, når mikroskopet går videre til en ny seksjon, vil autofunksjonene bli utført før alle andre bilder blir tatt opp i denne delen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Datajustering og analyse
<ol><li>Eksport av data<ol>
<li>Kontroller at data lagres i .tif format, så det er ikke behov for en dedikert eksportfunksjon. Sortere data i en mappestruktur som tilsvarer lagene og elementene i lagtreet.</li>
		<li>Når bildemosaikk er tatt opp, bruker du StitchAll-funksjonen til å sy alle brikkene automatisk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stable justering og beskjæring i Fiji NOTAT. Mange programvarepakker (gratis og kommersielle) kan brukes til å arbeide med Array Tomography-data. Trinnene nedenfor vises med åpen kildekode-programmet Fiji32 fordi det er allment tilgjengelig og inneholder alle nødvendige funksjoner.<ol>
<li>Importer en stabel med bilder (eller sydde bilder) til Fiji som en virtuell stabel.</li>
		<li>Hvis kontrast/lysstyrke må normaliseres, velger du Forbedret kontrast... fra Prosess-menyen. Sett Mettede bildepunkter til 0,1 eller mindre, og merk av for Behandle alle stykker.</li>
		<li>Velg Registrering på Plugins-menyen | Lineær stakkjustering med SIFT.</li>
		<li>Velg Stiv eller Affine på rullegardinmenyen Forventet transformasjon. Hvis ikke, beholder du standardinnstillingene. Start justeringen ved å klikke OK. MERK: Ved å laste inn dataene som virtual stack kan Fiji håndtere stabler av alle størrelser. Utdataene for justeringen opprettes i RAM. Dette kan imidlertid begrense den maksimale størrelsen på stakker som kan behandles. I så fall bruker du Registrer virtuelle stack slices, som er en mappe-til-mappe-implementering av samme registreringsalgoritme. Når registreringen er fullført, laster du inn utdatadataene som en virtuell stakk.</li>
		<li>Beskjær bildestakken ved å klikke Beskjær slik at den bare inneholder avkastningen.</li>
		<li>Lagre stakken som ett enkelt .tif bilde eller en serie med .tif bilder. MERK: Kritiske trinn i matrisetomografi vises i figur 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Luckner, M., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+light+microscopy+to+analytical+scanning+electron+microscopy+(SEM)+and+focused+ion+beam+(FIB)/SEM+in+biology:+Fixed+coordinates,+flat+embedding,+absolute+references.">From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+electron+microscopy+volume+of+the+brain+of+adult+Drosophila+melanogaster.">A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster.</a> Cell. 174 (3), 730-743 (2018).</li><li>Mulcahy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+volume+electron+microscopy+of+the+caenorhabditis+elegans+nervous+system.">A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system.</a> Frontiers in Neural Circuits. 12, 94 (2018).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+molecules+and+cells.">Electron tomography of molecules and cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).</li><li>Hoog, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+interphase+microtubules+in+fission+yeast+analyzed+by+electron+tomography.">Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography.</a> Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).</li><li>Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+studies+of+eukaryotic+cells+by+cryo-electron+tomography.">Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography.</a> Cells. 8 (1), 57 (2019).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+(S3EM)+on+silicon+wafers+for+ultra-structural+volume+imaging+of+cells+and+tissues.">Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues.</a> PLoS One. 7 (4), 35172 (2012).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).</li><li>Kubota, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+nanotube+tape+for+serial-section+electron+microscopy+of+brain+ultrastructure.">A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure.</a> Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).</li><li>Wacker, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+Hierarchical+Imaging+of+Serial+Sections+for+Finding+Specific+Cellular+Targets+within+Large+Volumes.">Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57059 (2018).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Templier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MagC,+magnetic+collection+of+ultrathin+sections+for+volumetric+correlative+light+and+electron+microscopy.">MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy.</a> Elife. 8, 45696 (2019).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).</li><li>Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+EM-based+reconstruction+of+the+interglomerular+projectome+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).</li><li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology:+Applications+and+technology.">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).</li><li>Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIB-SEM+tomography+in+biology.">FIB-SEM tomography in biology.</a> Methods in Molecular Biology. 1117, 541-558 (2014).</li><li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging.">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, 25916 (2017).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+cluster+ion+beam+SEM+for+imaging+of+large+tissue+samples+with+10+nm+isotropic+resolution.">Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution.</a> Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).</li><li>Maco, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+in+vivo+2+photon+and+focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+of+cortical+neurons.">Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons.</a> PLoS One. 8 (2), 57405 (2013).</li><li>Russell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+microscopes:+3D+correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+of+complex+biological+structures.">Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures.</a> Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).</li><li>Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+for+observing+the+three-dimensional+ultrastructure+of+membranous+cell+organelles+in+relation+to+their+molecular+components.">Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).</li><li>Peddie, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+and+integrated+light+and+electron+microscopy+of+in-resin+GFP+fluorescence,+used+to+localise+diacylglycerol+in+mammalian+cells.">Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).</li><li>Markert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+subcellular+localization+with+superresolution+array+tomography+on+ultrathin+sections+of+various+species.">3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species.</a> Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).</li><li>Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+precise+and+rapid+mapping+protocol+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+small+invertebrate+organisms.">A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms.</a> Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).</li><li>Kolotuev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+correlative+anatomy+of+invertebrate+model+organisms+increases+efficiency+of+TEM+data+production.">Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).</li><li>Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+acetylcholine+signaling+through+a+muscarinic+receptor+regulates+cell+migration.">Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster.">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li><li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis.">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+asymmetric+stem+cell+division.">Mechanisms of asymmetric stem cell division.</a> Cell. 132 (4), 583-597 (2008).</li><li>Daniel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+septate+junctions+assembly+and+completion+of+cytokinesis+in+proliferative+epithelial+tissues.">Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues.</a> Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).</li><li>Pasquettaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peculiar+protrusions+along+tanycyte+processes+face+diverse+neural+and+non-neural+cell+types+in+the+hypothalamic+parenchyma.">Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2020).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+image+browser:+A+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets.">Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li></ol>

Forfatteren Tilman Franke er ansatt i Thermo Fisher som produserer elektronmikroskop og piloteringsprogrammer som brukes i artikkelen.

Elektronmikroskopi gir innsikt i ultrastruktur av cellene og organismene, som det ofte er ønskelig å bildestrukturer av interesse for i deres 3-dimensjonale kontekst. Til tross for mange EM-taktikker for ultrastrukturell analyse, er det fortsatt ingen "gullstandard" -løsning. Hovedårsaken er det brede utvalget av prøver, mange biologiske spørsmål, som ofte krever en skreddersydd tilnærming. Den foreslåtte AT-arbeidsflyten er utformet for å minimere tiden som er nødvendig for prøvebehandling, datainnsamling, evaluering og lagring. Videre gir den modifiserte kniven et nyttig verktøy for å forenkle matriseanskaffelse. Den kompakte utformingen av seksjoner på wafers er praktisk, både for observasjon og etterfølgende lagring av prøvene. Denne ordningen gjør det mulig å "Lateral Screening" av eksempler ved å flytte vannrett fra bånd til bånd og skanne bare én del på hver, noe som reduserer tiden det tar å lokalisere en avkastning. Foreslåtte datainnsamlingsscenarier legger til rette for målretting av små og tilfeldig fordelte områder. Når AT/SEM er funnet, begrenses bildet med høy oppløsning nøyaktig til det interessante volumet, enten det utføres manuelt eller ved hjelp av automatisk funksjon. AT for begrensede volumer kan fullføres manuelt, med operatøren som navigerer gjennom prøven og definerer bildeområder en etter en. Den automatiserte modulen av programvaren gir en fleksibel bildeinnhentingsstrategi for avbildning av små områder på store seksjoner. Automatiseringen i denne programvaren gjør det mulig å spille inn store høyoppløselige bilder på hundrevis av seksjoner, og oppnår lignende volumer som SBFI. Registrering av oversiktsbilder av alle seksjoner forenkler ROI-lokaliseringen og reduserer tiden som brukes på mikroskopet. Siden avsnittene ikke skades under opptak av oversikter og forhåndsvisninger med høyere oppløsning, tillater AT/SEM gjenbruk av prøven til å samle inn ytterligere data om andre ROIer eller med høyere oppløsning.
Bildeanskaffelsestid er en av de viktigste (og dyreste) aspektene ved 3D EM og bør derfor vurderes i eksperimentdesignet. Selv om det ikke er overraskende at det tar lengre tid å forestille seg store områder enn å forestille seg små områder, er det enkelt å undervurdere virkningen: Avhengig av hvilke bildeparametere som er valgt, kan anskaffelsestiden på hver seksjon variere fra sekunder til timer. Kritiske bildeparametere inkluderer størrelsen på synsfeltet, oppløsningen og oppholdstiden. Forutsatt en måloppløsning på 10 nm per piksel og 1 μs oppholdstid, tar bilde av et felt på 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm eller 500 μm x500 μm tar 4 sekunder, 100 sekunder eller 2500 s å registrere. Vi kan multiplisere disse bildetidene per seksjon med antall seksjoner for å estimere tiden som kreves for hele bildebehandlingsjobben. Lange bildetider per seksjon kan være akseptable hvis antall seksjoner er lite eller hvis mikroskopverktøyets tid ikke er til bekymring.
Det er imidlertid nødvendig å begrense opptakstiden til en overnattingsjobb eller en helgejobb i de fleste tilfeller. Et like kritisk aspekt ved 3D EM som bør vurderes, er mengden og strukturen til de resulterende bildedataene. Registrering av bildefelt ovenfor i 100 deler genererer henholdsvis 400 mb, 10 gb eller 250 GB bildedata. bildene på 500 μm x 500 μm utgjør det ekstra problemet med å være større enn 2 gb hver. Mange av programmene som brukes til dataevaluering, kan ikke åpne bilder av denne størrelsen.
For å redusere bildetiden er det viktig å velge pikselbohetstid for å oppfylle kravene til signal-til-støy-forhold for den påfølgende dataevalueringen (f.eks. rekonstruksjon, sporing) og begrense opptakene til definerte ROIer. AT-utvidelsen av programvaren letter bildeanskaffelse i små områder i serielle seksjoner. Programvaren støtter manuelle og automatiske arbeidsflyter og mange halvautomatiske varianter: Bildeområder kan plasseres manuelt og fokuseres på hver seksjon, eller brukeren kan bruke funksjonene for automatisk seksjonssøker og posisjonsjustering. Avhengig av nivået på automatiseringen som er valgt og støttet av eksempeltypen eller bildemålene, kan tiden som kreves for å sette opp bildeinnhenting i hundrevis av seksjoner, ta en hel arbeidsdag (gjøres manuelt) eller bare noen få minutter. I prinsippet gjør Array Tomography det mer utfordrende enn andre 3D EM-metoder for å skaffe seg små ROIer; upresis regionplassering på påfølgende seksjoner må kompenseres ved å anskaffe større områder. For eksempel, hvis avkastningen er 20 μm x 20 μm i størrelse og seksjon-til-seksjon-posisjonsvariabiliteten til bildefelt er 10μm, må man skaffe seg 40 μm x 40 μm bilder for å være sikker på at avkastningen er fullstendig fanget i hvert bilde, på hver seksjon. Variasjonen i bildeposisjonen i den virkelige verden varierer fra 100 μm til <10 μm, avhengig av tilgjengeligheten eller kvaliteten på programvarefunksjoner for posisjonsjustering eller brukerens tålmodighet. Med denne programvaren kan 10 μm oppnås uten for mye manuell inngripen i de fleste prøver.
Som enhver teknikk har AT flere svake punkter som kan påvirke vellykket datainnsamling, og mange ligner på andre seksjonsbaserte metoder. Mangel på homogen fordeling av tom harpiks versus vev kan resultere i buede eller ødelagte matriser. I ekstreme tilfeller kan seksjoner løsne fra støtten (Figur 6A). Variabel komprimering eller strekking under skjæreprosessen kan skape bretter som kan forstyrre prøven i variable områder i etterfølgende seksjoner (Figur 6B). Knivmerker kan vises på overflaten av de oppsamlede delene med en skadet kniv (Figur 6C). Forskjeller i seksjonsforhold kan føre til sporadiske kompresjons- og tykkelsesforskjeller. Støv- eller smusspartikler kan lande på en seksjon og delvis skjule interessesonen (Figur 6D). Bildeanskaffelse kan mislykkes på grunn av ufullkomne funksjoner for automatisk kontrast, autofokus og automatisk stigmator. Plasseringen av automatisk opprettede bildeområder kan være variabel og kan mislykkes i å fange opp avkastningen i alle seksjoner.
Flere problemer kan oppstå på scenen av søm og justering. Den automatiske søm av mosaikkfliser oppkjøp kan mislykkes, for eksempel på grunn av den store tomme plassen inne i prøven. På grunn av en drastisk endring i form i 3D, kan bildestakker være utfordrende å registrere. Spesialutviklede programmer (f.eks. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB eller MAPS-AT) kan forenkle halvautomatisk justering32,38,39,40. Mer utfordrende seksjoner kan justeres manuelt ved hjelp av fotoredigeringsprogramvare. Dessverre kan noen datasett være umulige å justere riktig.
Store prøver er utfordrende for TEM serielle seksjoner som passer på rutenett; På den annen side rettferdiggjør mange prosjekter ikke lange automatiske oppkjøp ved hjelp av FIB / SEM eller SBF-SEM. AT er et enkelt alternativ til en kjedelig seriell seksjon TEM der innsamling og manipulering av serielle seksjoner på en wafer er enklere enn med sporgitteret. Flere strategier ble utviklet for å lette samlingen av matrisene, og vi deler vår metode for å utvide det eksisterende verktøysettet. I tilfeller der identifiseringen av avkastningen er utfordrende, gir AT-SEM en grunnleggende fordel, med effektiv screening av prøvene der organelle-skalaoppløsning over 50 til 500 seksjoner er nødvendig. For større volumer kan AT-strategiene for automatisk innsamling samles inn effektivt hvis det kreves flere seksjoner. AT-prøver kan avbildes på nytt flere ganger, noe som letter målrettet bildebehandling av områder med høy oppløsning basert på tidligere oppkjøpte oversiktsbilder. Vi mener at den målrettede analysen og redusert oversampling av AT/SEM som foreslås her, reduserer kravene til arbeids- og datalagring. Til syvende og sist kan biblioteker av seksjoner samles inn og vedlikeholdes for senere gjenbruk og konsultasjon. For volumanskaffelse tilbyr FIB- eller SBF-SEM-tilnærminger en utmerket løsning når avkastningen er enkel å identifisere på blokkflaten eller hvis store 3D-volumer er nødvendige for analysen. FIB/SBF-SEM er imidlertid mindre effektive når stabelen med høy oppløsning må samles inn fra en definert avkastning på en målrettet måte. For å konkludere tillater de foreslåtte metodene for screening av AT-prøver og bruk av middels oppløsningsoversiktsbilder å begrense bildeinnhentingen til de relevante delene av seksjonsmatrisen. Nøyaktig målgang av bildeområder øker hastigheten på tid til data og forenkler dataevaluering.
Oppsummert, selv om begrepet AT / SEM ikke er nytt, er bruken fortsatt ikke så utbredt som fordelene antyder. Totalt sett gir det en komplementær prosedyre til andre eksisterende EM-metoder. AT/SEM er kompatibel med det bredeste utvalget av prøveprepareringsprotokoller og bildearbeidsflyter og kan gjøres på alle FIB/SEM- eller SBF-SEM-mikroskoper som en tilhørende teknikk. I dette dokumentet har vi konsentrert oss om AT for registrering av ultrastrukturelle data fra prøver som det er mindre sannsynlig at blir adressert av andre metoder. Vi håper at den beskrevne prosedyren for praktisk innsamling av seksjoner og betydelig automatiserte anskaffelsesstrategier vil hjelpe i de første forsøkene for de som aldri har møtt metoden og vil bidra til å perfeksjonere den for de som allerede har litt erfaring.

Til tross for viktigheten av EM-relaterte teknikker, holder innsatsen som kreves for å mestre dem hele feltet begrenset til et lite antall spesialister. En betydelig vanskelighet er identifisering og gjenfinning av en region av interesse (ROI) i prøvene bevart for EM. Utseendet til den samme prøven varierer betydelig når den analyseres ved optisk mikroskopi og etter behandling for EM-observasjon. Endringene for kjemisk forberedte prøver inkluderer anisotrop prøvekrymping etter dehydreringstrinnene (~ 10% i hver dimensjon) og tap av fluorescens ved bruk av osmium i fikserings- og fargingsprotokollen (Figur 1A). For ultratynnende seksjonering er prøvene innebygd i epoksy- eller akrylharpikser ved hjelp av forskjellige strategier (figur 1B). For vellykkede resultater av dette preparatet må hele prøven fraksjoneres i stykker som ikke overstiger 1 mm x 1 mm. For å oppfylle standard TEM-observasjonsforhold (Transmission Electron Microscopy), er denne lille delen av prøven videre seksjonert til 50-150 nm tykke skiver. De resulterende gråtonebildene viser vevsorganisering og organellstruktur på et minutt brøkdel av hele prøven mer detaljert enn noen annen mikroskopiteknikk (Figur 1C). Et typisk TEM-datasett gir 2D-informasjon, teoretisk ekstrapolert for å forstå prosessene som naturlig forekommer i et 3D-rom i celler og vev. Figur 1D presenterer utfordringen med oppkjøp av ultrastrukturelle volumer: Hvis en kube på side 1000 μm er seksjonert med 50 nm tykkelse, vil det være nødvendig med 20.000 seksjoner for å dekke hele volumet; For en 500 μm sidekube, vil det være 10.000 seksjoner. For å dekke et volum på 50 μm x 50 μm x 50 μm, kan det være nødvendig med 1000 seksjoner "bare". Å skaffe dette volumet manuelt er praktisk talt umulig og ekstremt utfordrende å utføre med automatisering. Hvis vi i tillegg til prøvedybden må dekke hele overflaten av slike hypotetiske kuber, blir dekningen av 1 μm2 overflate med rimelig oppløsning et alvorlig logistisk problem (Figur 1E). Mens for de ekstraordinære store prosjektene, som connectomics tilnærminger, er det store antallet seksjoner avgjørende, for de fleste av de "verdslige" EM-prosjektene, og genererer flere seksjoner som kreves for observasjonen, gir en betydelig ulempe.
Det finnes flere metoder for å skaffe 3D ultrastrukturell informasjon: seriell seksjonering Transmission Electron Microscopy (TEM), TEM tomografi, Array Tomography (AT), Serial Block Face Imaging Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) og Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM). Hovedforskjellene mellom disse metodene er seksjoneringsstrategien og om bildeanskaffelsen er koblet til seksjonsgenerering1. I TEM for serielle inndelinger samles sekvensielle inndelinger på sporrutenett, TEM-bilder genereres fra disse sekvensene og justeres2,3,4,5. I TEM-tomografi gir vippeserier fra 150-300 nm-seksjoner på et rutenett, og når de kobles til seriell inndeling, en svært høy oppløsning, men relativt små volumer6,7,8. AT-tilnærmingen bruker fysisk seksjonering med forskjellige manuelle og halvautomatiske manerer av seksjonssamling på relativt stor støtte, for eksempel glassdekslerlip, silisiumskiver eller et spesielt tape. For bildeanskaffelse analyseres støtten i SEM, med forskjellige bildeanskaffelsesstrategier tilgjengelig9,10,11,12,13,14,15 . For SBF-SEM oppnås fysisk seksjonering ved hjelp av en minimikrotom med en diamantkniv satt direkte inne i SEM-kammeret, med SEM-bildet generert fra overflaten av harpiksblokk16,17,18,19. For FIB-SEM fjerner ionkilden tynne lag av prøven, etterfulgt av automatisk bildebehandling av den eksponerte overflaten av SEM20,21. TEM-tomografi og AT genererer fysiske seksjoner, som kan avbildes om nødvendig, mens FSBF-SEM og FIB-SEM eliminerer delen etter avbildning. En nylig kombinasjon av fysiske seksjoner avbildet av en multi-beam SEM gir en kombinasjon av metoder som løser "flaskehalsen" problemet med hastigheten på bildeoppkjøp22. Hver av disse teknikkene har revolusjonert måten EM-data kan innhentes og analyseres på, og hver tilnærming har sine praktiske effekter knyttet til et gitt forskningsspørsmål.
Gitt arten av preparatet og omfanget av de ultrastrukturelle dimensjonene, er det ikke enkelt å forutsi hvor en bestemt målstruktur ligger i prøveblokken (Figur1D,E). En løsning for ROI-lokaliseringen er å ta opp bildene fra hele blokken med ønsket oppløsning fra begynnelsen. Strukturene av interesse kan være i det oppkjøpte datavolumet når de er borte fra mikroskopet. Innsamlingstid og datahåndtering knyttet til denne strategien er problematisk. Det er ønskelig å redusere mengden registrerte data, spesielt hvis ROIene er mye mindre enn vevsblokken, det vil si hvis gjenstandene av interesse er spesifikke typer celler (ikke hele organer). Ulike korrelative lys- og elektronmikroskopiteknikker (CLEM) kan lykkes når fluorescensen bevares og lokaliseres før eller etter tilberedning i samme prøve23,24,25,26,27,28,29. Likevel er mange cellulære strukturer gjenkjennelige selv uten fluorescenskorrelasjon, bare basert på den kjente ultrastrukturen. I disse tilfellene mener vi at lateral screening Array Tomography gir en balanse avveining mellom innsatsen investert i ROI lokalisering og ultrastrukturell informasjonskvalitet. Ved hjelp av denne strategien blir et undersett av seksjoner på waferen screenet innenfor jevne mellomrom, som kan etableres basert på avkastningens størrelse og natur. Når ROIer er funnet, settes datainnsamlingen opp i en kontinuerlig serie av seksjoner som starter før og slutter etter ankerdelen, og samler inn relevant informasjon på en målrettet måte.
Vi presenterer protokoller for AT som forenkler og akselererer oppkjøpet av regioner eller hendelser av interesse i mange seksjoner og gir bedre justerte bildevolumer. Lateral screening og multistep-anskaffelse produserer data med svært høy oppløsning i nøyaktig målrettede regioner. Prosedyren vi beskriver tar for seg flere utfordringer ved datainnsamling i 3D EM, som den sørger for: kompatibilitet med et bredt spekter av prøver uten fundamental endring av arbeidsflyten for prøveforberedelse; målrettet lokalisering for seksjonering og SEM-oppkjøp; redusert tid og krefter under installasjonen; avbildning av områder i flere seksjoner med bedre justering av de resulterende volumene; og en jevn søm- og justeringsprosedyre for å kompilere forskjellige bilder til et sydd mosaikkbilde. Vi valgte å demonstrere styrken på metoden vår med flere prøver fra publiserte og pågående prosjekter. Vi tror at denne tilnærmingen kan legge til rette for generering og innsamling av målrettede EM-data, selv for etterforskere med begrenset EM-erfaring.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AT sectioning knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUATS3530</td>
			<td>Diatome Jumbo knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td>Diatome trimming 20&#176; 
			Glass knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16015</td>
			<td>Resistance: 1-30 Ohms 
			Type P: (Boron) (1 primary flat) 
			Roughness: 2 nm 
			No SiO2 top coating 
			TTV: = &#60;20 &#181;m 
			Wafer is polished on one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer cleaving kit</td>
			<td>EMS</td>
			<td>7642</td>
			<td>EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Thermo Fischer Helios</td>
			<td>1072419</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maps 3 for SEM with Correlative Workflow &#38; Array Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1135932</td>
			<td>Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira x.y</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131599</td>
			<td>Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td>IMOD, MIB (See text for refferences)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy

Elektronmikroskopi brukes i biologi og medisin for avbildning av cellulære og strukturelle detaljer ved nanometeroppløsning. Historisk sett ga Transmission Electron Microscopy (TEM) innsikt i celle ultrastruktur, men i det siste tiåret har utviklingen av moderne skanning elektronmikroskop (SEM) endret måten å se inne i cellene på. Selv om oppløsningen av TEM er overlegen når strukturelle detaljer på proteinnivå er nødvendig, er SEM-oppløsning tilstrekkelig for de fleste av de organelle cellebiologiske spørsmålene. Utviklingen i teknologiaktiverte automatiske volumanskaffelsesløsninger som seriell blokk-ansiktsavbildning (SBF-SEM) og fokusert ionstråle SEM (FIB-SEM). Likevel, til denne dagen, forblir disse metodene ineffektive når identifisering og navigering til interesseområder er avgjørende. Uten midler til presis lokalisering av målområder før avbildning, må operatørene skaffe seg mye mer data enn de trenger (i SBF-SEM), eller enda verre, forberede mange rutenett og bilde dem alle (i TEM). Vi foreslår strategien for "lateral screening" ved hjelp av Array Tomography i SEM, som letter lokalisering av interesseområder, etterfulgt av automatisert bildebehandling av den relevante brøkdelen av det totale prøvevolumet. Matrisetomografieksempler lagres under avbildning, og de kan ordnes i inndelingsbiblioteker som er klare for gjentatt avbildning. Flere eksempler vises der lateral screening gjør det mulig for oss å analysere strukturelle detaljer som er utrolig utfordrende å få tilgang til med en hvilken som helst annen metode.

Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Vi beskriver utarbeidelsen av bånd av serielle seksjoner og deres innsamling på stor overføringsstøtte for bruk som Array Tomography-prøver, sammen med automatiserte bildebehandlingsprosedyrer i et skanningselektronmikroskop. Protokollen tillater screening, henting og målrettet avbildning av lokale, sjeldne hendelser og innsamling av store datavolumer.

Matrisetomografiarbeidsflyt for målrettet anskaffelse av voluminformasjon ved hjelp av skanningselektronmikroskopi

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Elektronmikroskopianalyse er ofte kompleks. Vi mener at vår protokoll legger til rette for behandling og innsamling av EM-data fra den store prøveflaten og mellomvolumet. Vår protokoll hjelper deg med å finne målstrukturer i serielle seksjoner.Dataregistrering er begrenset til det som er nødvendig. Sammenlignet med datainnsamling i helvevsblokker reduseres registreringstiden og dataanalysen er enklere. Gitt den generelle enkelheten i tilnærmingen, tror vi at den kan brukes til å adressere ikke bare vitenskapelige spørsmål, men også som et diagnostisk verktøy.For å generere en matrise for analyse, må du først klemme prøven på en ultramikrotomholder og bruke et barberblad for å grovt trimme harpiksen rundt prøven. Bruk et diamanttrimmeverktøy for å finjustere prøven og bruke trimmekniver med 20- eller 90-graders helling for å sikre at de øverste og nederste overflatene på blokken er parallelle med knivens skjærekant. Bland xylen og lim i en 3:1-andel og bruk en øyenvippe festet til en tannpirker for å påføre blandingen på topp- og bunnkantene på den trimmede blokken.Mens blandingen tørker, bruk et skiskiveklyngeverktøy for å kutte et stykke wafer til riktig størrelse for analysen. Rengjør skiven i destillert vann for å skylle bort rusk og rengjør overflaten med plasma etter at skiven er tørr. For å forberede en array tomografikniv, bruk skummende klebrig tape for å feste en nål til bunnen av en histo jumbokniv og plasser kniven i ultramikrotomholderen ved null grader.Juster kanten på kniven parallelt med blokkoverflaten og ta den trimmede blokken til kanten av kniven i en posisjon som er klar for seksjonering. Plasser den rene skiven i knivbassenget og fyll vasken med vann til samme nivå som knivkanten, la deretter diamantkanten av kniven fukte riktig, ved hjelp av den vedlagte sprøyten for å legge til eller trekke ut vann etter behov. For array-seksjonering setter du mikrotomet til et skjæreområde på 50 til 100 nanometer og en skjærehastighet på 6 til 1 millimeter per sekund, og begynner å seksjonere for å få et bånd lenge nok til å dekke et målrettet Z-volum.Avhengig av blokkstørrelsen, homogeniteten til vevet og typen harpiks, vil båndet være omtrent rett. Bruk en ren, ikke-klebrig spiss av en øyenvippe for å løsne båndene fra knivkanten. Bruk øyenvippen til å flytte båndet forsiktig over til midten av støttemediet.Kloroform eller en varmepenn kan brukes til å strekke delen om nødvendig. Etter strekking, trekk sprøyten tilbake for å begynne å tømme vannet. For mer delikate bånd, eller en langsommere vannuttrekking, løsne sprøyten fra slangen for å la vannet dryppe.Når vannstanden når skivenivået, skyver du forsiktig båndet til midten av bassenget og fortsetter å drenere til alt gjenværende vann er helt fjernet fra bassenget. La skiven tørke i et rent miljø. Tørking tar ca. 30 minutter.Når prøven er helt tørket, overfør matrisen til en tett lukket boks for å beskytte den mot smussforurensning. Og legg esken i en 60 graders Celsius-ovn i minst 30 minutter. For å få et oversiktskart over SEM-bilder som avslører seksjonsplasseringer på skiven, bruk det innebygde optiske kameraet til å skaffe deg et SEM-bilde som dekker et bånd av seksjoner.Hvis du vil opprette en mosaikk, klikker og drar du kamerabildet av prøven og starter den automatiske anskaffelsen. Få oversikter ved høyere oppløsning for å finne målstrukturer. Hvis bare noen få seksjoner må avbildes, kan du bruke visningsprogrammet som kan zoomes til å vise anskaffede bilder på de opprinnelige plasseringene.Når en inndeling som skal avbildes med høy oppløsning er identifisert, klikker og drar du for å opprette et bildeområde, velger innstillinger for høyoppløselig bildebehandling og lagrer innstillingene i en mal Hvis du vil finne spesielt små eller vanskelige å oppdage sjeldne hendelser, bruker du innstillingene for bildebehandling med høy oppløsning på hver tiende del eller på én del per bånd for å opprette et bildeområde manuelt og hente bildene. Se deretter gjennom bildene og merk seksjonene som inneholder interesseområdet. Hvis du vil skaffe deg mer enn 10 påfølgende inndelinger, bruker du seksjonssøkeren til å finne alle delene automatisk.Hvis oversiktsbildene ikke viser klare interesseområder, skaffer du bilder med høyere oppløsning av delene og bruker forhåndsvisningsfunksjonen for seksjoner til å opprette og hente bildene automatisk. For å bestemme de optimale bildeinnstillingene, aktiver live-avbildningen i mikroskopkontrollprogramvaren og naviger til ett område av interesse, og juster deretter bildeinnstillingene til bildene viser klare interesseområder, men uten et for langt bildeanskaffelse, i henhold til produsentens retningslinjer. Hvis du vil optimalisere plasseringen av bildeområdene i påfølgende inndelinger, zoomer du til bildet av interesse og klikker Start posisjonsforbedring for å øke presisjonen for registrerte inndelingssteder.Hvis du vil definere et bildeområde, klikker og drar du i en inndeling mens du holder nede Alt-tasten og velger Opprett matrise for flissett på hurtigmenyen. Programvaren vil lage bildeområder på samme relative plassering i alle seksjonene som er funnet eller tidligere merket. Konfigurer deretter pikselantall, pikselstørrelse, flisleggingsoppsett og pikselbotid i hver bildeserie etter behov.Hvis du vil konfigurere den automatiske funksjonen, oppretter du en egen bildeserie for automatiske funksjoner som vist, og flytter bildeserien til en plassering i inndelingen som inneholder strukturer med høy kontrast. Sett bildeserien til 1024 x 884 piksler, og velg en pikselstørrelse som tilsvarer den høyeste oppløsningen som brukes i bildeserien. I listen over automatiske funksjoner, sjekk Autofokus og Auto stigmator.Velg Bisection i kontrollene for anskaffelsessekvensen, og bekreft at bildet av den automatiske funksjonen er det første elementet i listen, og klikk deretter Hent alle for å starte bildeanskaffelsen. Når alle bildeseriene er opprettet og satt opp, vises serien i en jobbkø. Oppkjøp med lav oppløsning kan utføres manuelt eller automatisk direkte på utvalgte deler av seksjonen eller en hel seksjon ved hjelp av enkelt- eller mosaikkavbildning, etterfulgt av søm.Bilder fra det valgte området kan deretter anskaffes ved hjelp av høyoppløselige parametere for å visualisere mitokondrier, kjerner og mikrovilli, for eksempel Etter at den automatiske oppkjøpet av løste mosaikkkart er valgt, kan flere interesseområder beskjæres ut eller brukes til å definere flere lokale bildeområder i regionene. Selv om forskjellige spesialiserte celletyper i Drosophila-tarmen er tilfeldig fordelt, kan de visuelt skilles etter å ha screening av bildene ved hjelp av høyoppløselige parametere, enten fra enkeltinndelinger eller som en samling serielle bilder. Etter justeringen kan stakkene gjengis ved hjelp av forskjellige programvareløsninger.Matrisetomografianalyse gjør det mulig å generere mange sekvensielle seksjoner på den enkle skiven, og skal screenes ved hjelp av lavoppløsningsparametere for å lokalisere de generelle interesseområdene. Disse områdene kan målrettes mot videre analyse ved hjelp av avanserte anskaffelsesparametere. For eksempel er mytotiske divisjoner i notumet ikke lett å lokalisere på ultrastrukturelt nivå, da cellene er relativt store sammenlignet med abscission-sonen.Ved hjelp av denne metoden kan imidlertid de automatiske oversiktsbildene med middels oppløsning av sprangene på 20 til 40 seksjoner brukes til å lokalisere delingscellene. Matrisetomografiprosedyren gir en enklere elektronmikroskopidataanalyse. Vi oppfordrer seerne til å investere i å mestre regenereringen og gjøre seg kjent med den kartrelaterte arbeidsflyten Etter vår erfaring er det få forskningstemaer som krever ultrastrukturelt analyse av hele dyr eller hele organer.Vår metode hjelper med rask lokalisering av celler og deres interaksjonspartnere i vev.

Research

JoVE Journal

Biology

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

En standardisert metode for analyse av Liver Sinus endotelceller og deres Fenestrations ved scanning elektronmikroskopi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Skanning elektronmikroskopi av oppmalte Tissue å visualisere den ekstracellulære matriks

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Studerer Supramolecular Organisering av foto Membraner innen Freeze frakturerte Leaf Vev av Cryo-scanning elektronmikroskopi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Skanning elektronmikroskopi (SEM) Protokoller for Problema Plant, eggsporesopper, og Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Utarbeidelse og Observasjon av Thick biologiske prøver av Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Undersøke den skadelige effekter av lav press plasmasterilisering på overlevelse av Bacillus subtilis Spores ved hjelp av Live celle mikroskopi

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Utarbeidelse av Prokaryotic og Eukaryotic organismer med kjemiske tørking for morfologisk analyse skanning elektronmikroskop (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske utvalg forberedelse av høytrykks fryser, mikrobølgeovn-assistert kontrast ekstrautstyr og Minimal harpiks innebygging volum Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

Målrettede studier ved hjelp av seriell blokk ansikt og fokusert ion Beam Scan Electron mikroskopi

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Seriell blokk-ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) av biologiske vevsprøver

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...