Name: array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 47 s
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Queremos agradecer aos membros da unidade EM da Universidade de Lausanne pelo apoio durante este desenvolvimento de diferentes etapas do procedimento AT. Gostaríamos de agradecer a Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O'Brien e Lindsay Lewellyn pelas discussões durante a preparação do manuscrito e leitura crítica. Queremos reconhecer os grupos que contribuíram com as amostras usadas para demonstrar os diferentes cenários: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat e Fanny Langlet.

NOTA: Os métodos de preparação da amostra são descritos em outros lugares14,30,31, e não estão cobertos nesta publicação. Em suma, os exemplos mostrados foram quimicamente fixados com glutaraldeído, pós-fixado com 1% osO4, depois tratados com acetato aquoso de uranyl antes de incorporar na resina de incorporação. Alternativamente, as amostras podem ser preparadas usando congelamento de alta pressão, congelamento substituído por acetato de 0,1% de urano em acetona e embutido em resina acrílica. Os blocos amostrais foram preparados utilizando-se um método de incorporação plana que permite uma visão clara da amostra, facilitando sua orientação para a secção (Figura 1B).
1. Procedimento de geração de matriz
<ol><li>Orientação e aparamento de amostras incorporadas<ol>
<li>Usando o binóculo/microscópio, identifique e marque o ROI na superfície do bloco incorporado, arranhando levemente a superfície do bloco com uma lâmina de barbear. Isso ajudará a orientar a amostra dentro do ultramicroome e reduzirá a superfície de secção.</li>
		<li>Fixar a amostra no suporte ultramicrotome(Figura 2A).</li>
		<li>Corte a resina ao redor da amostra, primeiro com a lâmina de barbear (aparador áspero) e continue com a ferramenta de corte de diamante (aparador fino; Figura 2A). Use facas com inclinação de borda de 20° ou 90° para garantir que as superfícies superior e inferior do bloco sejam paralelas à borda de corte da faca. NOTA: Esta etapa é fundamental para secção serial e aquisição de fitas retas.</li>
		<li>Misture xileno e cola em proporção 3:1. Com um cílio preso a um palito, aplique esta mistura na parte superior e nas bordas inferiores do bloco aparado. Deixe secar bem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o suporte de montagem da matriz A (ou seja, wafers de silício).<ol>
<li>Corte a peça do wafer usando uma ferramenta de corte de wafer (EMS), ajustando seu tamanho à meta do projeto. 2 cm x 4 cm é conveniente para observações de microscopia de luz e elétrons.</li>
		<li>Limpe o wafer em água destilada para se livrar dos escombros.</li>
		<li>Descarga de brilho/plasma limpa a superfície usando equipamento padrão. Os parâmetros precisos dependerão da máquina utilizada. Comece com os parâmetros para a descarga das grades e ajuste empiricamente o tempo. Esta etapa é crucial para uma boa disseminação das seções no suporte enquanto as seções estão secando e não devem ser omitidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o suporte de montagem de arrays B (ou seja, deslizamento de tampa de vidro)<ol>
<li>Se planejar experimentos de imuno-rotulagem multiplex, transfira as amostras em um deslizamento de cobertura para detectar melhor o sinal de fluorescência. Para melhorar a adesão ao deslizamento de tampas, use um procedimento detalhado de revestimento de gelatina é descrito anteriormente9.</li>
		<li>Aumente a condutividade revestindo os slides com o índio-estanho-óxido (ITO) ou ouro por evaporação. Mantenha as tampas preparadas em um ambiente limpo. Descarreto de brilho as amostras descritas em 1.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Secção da amostra
<ol><li>Preparação de facas AT NOTA: Para gerar as matrizes, utilize uma faca modificada (ATS), projetada para facilitar a aquisição de fitas longas. Facas Histo-Jumbo ou facas similares concebidas para a geração das seções em grandes suportes também podem servir para secções AT.<ol>
<li>Coloque a agulha na parte inferior da faca usando a fita adesiva espumosa e fure-a(Figura 2B). Coloque a faca ATS no suporte ultramicroome a 0°. Ajuste a borda da faca paralela à superfície do bloco usando o procedimento padrão.</li>
		<li>Leve o bloco aparado para a borda da faca em uma posição pronta para secção.</li>
		<li>Coloque o wafer/tampa dentro da bacia da faca e encha-o com água ao mesmo nível da borda da faca. Deixe a borda de diamante da faca umidificar corretamente e, se necessário, retirar a água usando a seringa presa(Figura 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Secção e transferência de matrizes<ol>
<li>Defina o microtome aos parâmetros de corte desejados. Com a faca ATS, a distância de 50-100 nm e uma velocidade de corte de 0,6-1 mm/s são aconselháveis. Iniciar a secção (Figura 2Di).</li>
		<li>Obtenha uma fita do comprimento que cobrirá um z-volume direcionado e pare a coleção. Dependendo do tamanho do bloco, homogeneidade do tecido e tipo de resina, a fita será relativamente reta(Figura 2D-ii). Muitas amostras não produzirão fitas retas, apesar do esforço investido e do tipo de faca é usada.</li>
		<li>Dependendo do objetivo final, faça uma fita longa ou várias curtas alinhadas lado a lado. Um suporte de 2 cm x 4 cm pode convenientemente conter de 100 a 1.000 seções. O arranjo da fita na etapa de suporte é um passo que requer destreza e mãos firmes. No entanto, a curva de aprendizado para essa habilidade é rapidamente adquirida.</li>
		<li>Retire a fita da ponta da faca usando uma ponta limpa e antiaderente de um cílio colado no palito(Figura 2Diii).</li>
		<li>Usando o cílio, mova suavemente a fita acima do centro do meio de suporte. Neste ponto, use clorofórmio ou caneta de aquecimento para alongamento das seções, se necessário. No entanto, lembre-se que essa manipulação pode induzir a quebra e deformação da fita.</li>
		<li>Comece a drenar a água puxando a seringa. Para fitas mais delicadas ou uma retração de água mais lenta, deixe a água gotejar, desprendendo a seringa da mangueira. Quando o nível da água estiver baixando para o nível do wafer, controle a fita e reposicione-a, se necessário, empurrando suavemente a fita para o centro. Depois de fixar as fitas na superfície do wafer, continue drenando até que a água restante seja completamente retirada da bacia. NOTA: Se não usar a faca ATS de retração de água inferior, reduza cuidadosamente a água das laterais da faca ATS para não induzir turbulência.</li>
		<li>Deixe as seções no suporte dentro do banho para deixar secar completamente. Dependendo da hidroofobidade do nível de apoio e umidade ambiental, a água evaporará a uma taxa diferente(Figura 2Div). É importante deixar a amostra secar lentamente para diminuir ou evitar todas as dobras na amostra.</li>
		<li>Transfira a amostra seca para uma caixa bem fechada para proteger contra a contaminação da sujeira e coloque-a em um forno de 60 °C por pelo menos 30 minutos. Se necessário, contra-retiver seções usando metais pesados para melhorar o contraste geral.</li>
		<li>No final do procedimento, limpe cautelosamente a faca seguindo as instruções do fabricante NOTA: A transferência de seções múltiplas ou seriais em um wafer(Figura 2E) em comparação com a transferência em uma grade de ranhura(Figura 2F) altera totalmente a experiência de preparação em EM. A seção ininterrupta e a coleta das seções em suporte único reduz a quantidade de erros relacionados à seção e à coleta de seções frequentes na seção serial. O equivalente a 100 seções de 1000 μm x 500 μm coletadas em um wafer corresponde a 33 grades de ranhura(Figura 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Observação da amostra
NOTA: Esta seção descreve as etapas do fluxo de trabalho implementadas usando um software comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Qualquer software de aquisição de imagem em qualquer SEM equipado com os detectores corretos pode ser usado, no entanto, as ações específicas do usuário diferem e muitas vezes serão mais manuais.
<ol><li>Adquira um mapa de visão geral das imagens SEM que revela os locais da seção no wafer. Uma imagem de câmera óptica incorporada ajuda na definição de um mosaico de imagem SEM que cobre uma fita de seções ou todas as seções. Crie o mosaico clicando-arraste com o mouse à direita na imagem da câmera da amostra e inicie a Aquisição Automática. NOTA: Configurações de imagem muito grosseiras, ou seja, tamanho de pixel de 1-2 μm e 1 μs de tempo de moradia suficiente. Esse processo é ilustrado em Material Suplementar (páginas 2-7).</li>
	<li>Localize seções com a função Detecção automática do localizador de seção ou localize-as manualmente. As posições e contornos da seção são recuperados automaticamente com este software com base na correspondência de imagens. Para ilustração desse processo, consulte Material Suplementar (páginas 8 - 15).</li>
	<li>Caso as imagens de visão geral não mostrem ROIs claramente, adquira imagens de maior resolução das seções. Use a função Visualização de seção para criar e adquirir imagens automaticamente. Este processo é ilustrado em Material Suplementar, páginas 16-18. As configurações de imagem devem ser escolhidas de acordo com a natureza e o tamanho do ROI que o usuário procura.<ol>
<li>Para encontrar as configurações ideais, ative a Imagem Ao Vivo no software de controle de microscópio e navegue até um ROI. Altere as configurações de imagem até que as imagens mostrem ROIs claramente, mas a aquisição de imagens não é excessivamente longa.</li>
	</ol></li>
	<li>Definir regiões de imagem NOTA: Várias estratégias diferentes são propostas.<ol>
<li>Se apenas algumas seções precisarem ser imagens, use as imagens de seções criadas até agora para navegar nas seções relevantes e use o Visualizador Zoomable que mostra todas as imagens adquiridas em seus locais relativos originais para olhar todas as seções. Uma vez que uma seção seja encontrada que deve ser imageda em alta resolução, crie uma região de imagem com clique-arrastar. Escolha configurações de imagem de alta resolução e armazene as configurações em um modelo. Reumisso modelo para outras seções.</li>
		<li>Para encontrar eventos particularmente pequenos ou difíceis de detectar eventos raros, use a abordagem de triagem lateral. Crie manualmente uma região de imagem com configurações de imagem de alta resolução em cada décima seção ou em uma seção por fita e adquira as imagens. Revise as imagens e as seções de marca que contenham o ROI no software ou tome uma nota.<ol>
<li>A partir de seções que contêm o ROI, navegue para frente e para trás através do conjunto de seção e crie regiões de imagem de alta resolução nos mesmos locais relativos enquanto a estrutura ainda estiver visível na seção. Isso pode ser feito manualmente ou usando o procedimento descrito nos próximos passos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adquira imagens em mais de dez seções consecutivas. Clique em Iniciar o Refinamento de posição após ampliar a imagem para aumentar a precisão dos locais de seção registrados conforme descrito no manual. Isso diminui a variabilidade de posição das séries de imagens. O procedimento é ilustrado e explicado nas páginas material suplementar 19-21.</li>
		<li>Clique em arrastar em qualquer seção para definir uma região de imagem enquanto segura a tecla Alt e selecione Criar conjunto de azulejos no menu de contexto que é aberto quando o botão do mouse é liberado. O software cria então regiões de imagem no mesmo local relativo em todas as seções que foram encontradas ou marcadas anteriormente. É possível limitar a imagem a uma faixa específica de seções com o controle deslizante Seção Span. NOTA: Este procedimento pode ser repetido com qualquer número de regiões de imagem e, portanto, permite gravar muitas pequenas imagens de alta resolução em vez de gravar uma única imagem maior em cada seção.</li>
		<li>Uma vez criado, configure a contagem de pixels, tamanho do pixel, layout de revestimento, tempo de moradia dos pixels, etc. em cada série de imagens, conforme necessário. Uma vez que as séries de imagens são criadas e configuradas, todas elas são listadas em uma sugestão de trabalho.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure funções automáticas e inicie a aquisição de imagens<ol>
<li>Crie uma série de imagens separada para funções automáticas usando o mesmo método descrito na etapa anterior. Mova a série de imagens para uma posição na seção que contém estruturas de alto contraste.</li>
		<li>Defina a série de imagens para 1024 x 884 pixels e escolha um tamanho de pixel correspondente à maior resolução usada na série de imagens configurada nas etapas anteriores. Na lista de funções automáticas, verifique Auto Focus e Auto Stigmator.</li>
		<li>Selecione Por seção nos controles de sequência de aquisição e certifique-se de que a imagem de funções automáticas seja o primeiro item da lista. Inicie a aquisição da imagem clicando no botão Executar ao lado da sugestão de trabalho. Esses procedimentos são ilustrados em Material Suplementar, páginas 22-23. NOTA: Não é necessário pré-focar manualmente em cada seção. Durante a sessão de gravação, sempre que o microscópio avançar para uma nova seção, as funções automáticas serão executadas antes que todas as outras imagens sejam gravadas nesta seção.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Alinhamento e análise de dados
<ol><li>Exportação de dados<ol>
<li>Certifique-se de que os dados são salvos em formato .tif, para que não haja necessidade de uma função de exportação dedicada. Classifique os dados em uma estrutura de pasta que corresponda diretamente às camadas e elementos da Árvore de Camadas.</li>
		<li>Uma vez que os mosaicos de imagem tenham sido gravados, use a função StitchAll para costurar automaticamente todas as telhas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alinhamento de pilha e corte em Fiji NOTA. Muitos pacotes de software (gratuitos e comerciais) podem ser usados para trabalhar com dados do Array Tomography. As etapas abaixo são mostradas com o programa de código aberto Fiji32 porque ele está amplamente disponível e contém todas as funções necessárias.<ol>
<li>Importe uma pilha de imagens (ou imagens costuradas) em Fiji como uma pilha virtual.</li>
		<li>Se o contraste/brilho precisar ser normalizado, escolha Contraste Aprimorado... do menu Processo. Defina Pixels Saturados para 0,1 ou menos e verifique Processar todas as fatias.</li>
		<li>No menu Plugins, escolha o Registro | Alinhamento da pilha linear com SIFT.</li>
		<li>Escolha Rigid ou Affine no menu suspenso de Transformação Esperada. Caso contrário, mantenha as configurações padrão. Inicie o alinhamento clicando em OK. NOTA: Carregar os dados como Virtual Stack permite que Fiji manuseie pilhas de qualquer tamanho. A saída do alinhamento é criada em RAM; no entanto, isso pode limitar o tamanho máximo de pilhas que podem ser processadas. Nesse caso, use o Register Virtual Stack Slices, que é uma implementação de pasta para pasta do mesmo algoritmo de registro. Uma vez que o registro esteja concluído, carregue os dados de saída como uma pilha virtual.</li>
		<li>Corte a pilha de imagens clicando em Crop para que contenha apenas o ROI.</li>
		<li>Salve a pilha como uma única imagem .tif ou uma série de imagens .tif. NOTA: Etapas críticas da Tomografia matriz são mostradas na Figura 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Luckner, M., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+light+microscopy+to+analytical+scanning+electron+microscopy+(SEM)+and+focused+ion+beam+(FIB)/SEM+in+biology:+Fixed+coordinates,+flat+embedding,+absolute+references.">From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. 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R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+image+browser:+A+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets.">Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li></ol>

O autor Tilman Franke é um funcionário da Thermo Fisher que fabrica microscópios eletrônicos e programas de pilotagem que são usados no artigo.

A microscopia eletrônica dá uma visão da ultraestrutura das células e organismos, para as quais muitas vezes é desejável imagens de estruturas de interesse em seu contexto tridimensional. Apesar de inúmeras táticas EM para análise ultraestrutural, ainda não há uma solução "padrão-ouro". A principal razão é a grande variedade de amostras, muitas questões biológicas, que frequentemente requerem uma abordagem personalizada. O fluxo de trabalho AT proposto foi projetado para minimizar o tempo necessário para processamento de amostras, aquisição de dados, avaliação e armazenamento. Além disso, a faca modificada fornece uma ferramenta útil para simplificar a aquisição de arrays. O layout compacto de seções em wafers é conveniente, tanto para a observação quanto para o armazenamento subsequente das amostras. Este arranjo permite a "Triagem Lateral" das amostras movendo-se horizontalmente da fita para a fita e escaneando apenas uma seção em cada uma, reduzindo significativamente o tempo necessário para localização de um ROI. Os cenários propostos de aquisição de dados facilitam o direcionamento de áreas pequenas e distribuídas aleatoriamente. Uma vez encontrado, a AT/SEM restringe a imagem de alta resolução precisamente ao volume de juros, seja realizada manualmente ou com a ajuda da função automática. AT para volumes limitados pode ser concluído manualmente, com o operador navegando através da amostra e definindo regiões de imagem um a um. O módulo automatizado do software fornece uma estratégia flexível de aquisição de imagens para imagens de pequenas áreas em grandes seções. A automação neste software permite gravar grandes imagens de alta resolução em centenas de seções, alcançando volumes semelhantes aos SBFI. A gravação de imagens de visão geral de todas as seções simplifica a localização do ROI e reduz o tempo gasto no microscópio. Uma vez que as seções não são prejudicadas durante o registro de visões gerais e visualizações de resolução mais alta, a AT/SEM permite reutilizar a amostra para coletar dados adicionais de outros ROIs ou em uma resolução mais alta.
O tempo de aquisição de imagens é um dos aspectos mais importantes (e mais caros) do EM 3D e, portanto, deve ser considerado no design do experimento. Embora não seja surpreendente que a imagem de grandes áreas deva mais tempo do que a imagem de pequenas áreas, é fácil subestimar o impacto: Dependendo dos parâmetros de imagem selecionados, o tempo de aquisição em cada seção pode variar de segundos a horas. Os parâmetros críticos de imagem incluem o tamanho do campo de visão, resolução e tempo de moradia. Assumindo uma resolução de destino de 10nm por pixel e 1 μs de tempo de moradia, a imagem de um campo de 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm, ou 500 μm x500 μm leva 4 segundos, 100 segundos ou 2.500 s para gravar. Podemos multiplicar esses tempos de imagem por seção pelo número de seções para estimar o tempo necessário para o trabalho completo de imagem. Longos tempos de imagem por seção podem ser aceitáveis se o número de seções for pequeno ou se o tempo da ferramenta do microscópio não for de nenhuma preocupação.
No entanto, é necessário limitar o tempo de gravação a um trabalho noturno ou a um trabalho de fim de semana na maioria dos casos. Um aspecto igualmente crítico do EM 3D que deve ser considerado, é a quantidade e a estrutura dos dados de imagem resultantes. O registro dos campos de imagem acima mencionados em 100 seções gera 400 mb, 10 gb ou 250 gb de dados de imagem, respectivamente; as imagens de 500 μm x 500 μm representam a questão adicional de ser maior que 2 gb cada. Muitos dos programas de software usados para avaliação de dados não podem abrir imagens deste tamanho.
Para reduzir o tempo de imagem, é importante escolher o tempo de moradia do pixel para atender aos requisitos da relação sinal-ruído para a avaliação de dados subsequente (por exemplo, reconstrução, rastreamento) e limitar as gravações a ROIs definidas. A extensão AT do software facilita a aquisição de imagens em pequenas áreas em seções seriais. O software suporta fluxos de trabalho manuais e automáticos e muitas variantes semiautomáticas: as áreas de imagem podem ser posicionadas manualmente e focadas em cada seção, ou o usuário pode usar os recursos automáticos de localizador de seção e alinhamento de posição. Dependendo do nível de automação escolhido e suportado pelo tipo de amostra ou metas de imagem, o tempo necessário para configurar a aquisição de imagens em centenas de seções pode levar um dia de trabalho inteiro (feito manualmente) ou apenas alguns minutos. Em princípio, a Tomografia Array torna mais desafiador do que outros métodos EM 3D para adquirir pequenos ROIs; a colocação imprecisa da região em seções consecutivas deve ser compensada pela aquisição de áreas maiores. Por exemplo, se o ROI tiver 20 μm x 20 μm de tamanho e a variabilidade de posição de seção para seção dos campos de imagem for de 10μm, é preciso adquirir imagens de 40 μm x 40 μm para ter certeza de que o ROI está totalmente capturado em cada imagem, em cada seção. A variabilidade da posição de imagem do mundo real varia de 100 μm a < 10 μm, dependendo da disponibilidade ou qualidade dos recursos de software para alinhamento de posição ou paciência do usuário. Com este software, 10 μm podem ser alcançados sem muita intervenção manual na maioria das amostras.
Como qualquer técnica, o AT tem vários pontos fracos que podem influenciar a aquisição bem-sucedida de dados, e muitos são semelhantes a outros métodos baseados em secções. A falta de distribuição homogênea de resina vazia versus tecido pode resultar em matrizes curvas ou quebradas. Em casos extremos, as seções podem se desvincular do suporte(Figura 6A). A compressão variável ou alongamento durante o processo de corte pode criar dobras que podem interromper a amostra em regiões variáveis em seções subsequentes(Figura 6B). Marcas de faca podem aparecer na superfície das seções coletadas usando uma faca danificada(Figura 6C). Diferenças nas condições de secção podem induzir diferenças ocasionais de compressão e espessura da seção. Partículas de poeira ou sujeira podem pousar em uma seção e obscurecer parcialmente a zona de interesse(Figura 6D). A aquisição de imagens pode falhar devido a funções imperfeitas de auto-contraste, foco automático e auto-estigmator. O posicionamento de áreas de imagem criadas automaticamente pode ser variável e pode não capturar o ROI em todas as seções.
Vários problemas podem surgir na fase de costura e alinhamento. A costura automática de aquisições de telhas de mosaico pode falhar, por exemplo, por causa do grande espaço vazio dentro da amostra. Devido a uma mudança drástica de forma em 3D, pilhas de imagens podem ser desafiadoras para registrar. Programas especialmente desenvolvidos (por exemplo, IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB ou MAPS-AT) podem facilitar o alinhamento semiautomático32,38,39,40. Seções mais desafiadoras podem ser alinhadas manualmente usando software de edição de fotos. Infelizmente, alguns conjuntos de dados podem ser impossíveis de alinhar corretamente.
Grandes amostras são desafiadoras para seções seriais TEM que se encaixam em grades; por outro lado, muitos projetos não justificam a aquisição automática de longa duração utilizando a FIB/SEM ou a SBF-SEM. O AT é uma alternativa simples a uma seção serial tediosa TEM onde a coleta e manipulação de seções seriais em um wafer são mais simples do que com as grades de ranhura. Várias estratégias foram desenvolvidas para facilitar a coleta das matrizes, e compartilhamos nosso método para expandir o kit de ferramentas existente. Nos casos em que a identificação do ROI é desafiadora, o AT-SEM oferece uma vantagem fundamental, com a triagem eficiente das amostras em que a resolução em escala de organela em 50 a 500 seções é necessária. Para volumes maiores, as estratégias AT de coleta automática podem ser coletadas de forma eficiente se forem necessárias mais seções. As amostras AT podem ser reimagem várias vezes, facilitando imagens direcionadas de áreas de alta resolução com base em imagens de visão geral adquiridas anteriormente. Acreditamos que a análise direcionada e a redução do excesso de preços pela AT/SEM proposta aqui diminui os requisitos de mão-de-obra e armazenamento de dados. Em última análise, bibliotecas de seções podem ser coletadas e mantidas para posterior reutilização e consulta. Para aquisição de volume, as abordagens FIB ou SBF-SEM oferecem uma excelente solução sempre que o ROI é fácil de identificar na face do bloco ou se grandes volumes 3D são necessários para a análise. No entanto, o FIB/SBF-SEM é menos eficiente quando a imagem de pilha de alta resolução deve ser coletada de um ROI definido de forma direcionada. Para concluir, os métodos propostos para triagem de amostras AT e o uso de imagens de visão geral de resolução média permitem limitar a aquisição de imagens às partes relevantes do array de seção. O objetivo preciso das regiões de imagem acelera o tempo de dados e simplifica a avaliação dos dados.
Em resumo, embora o conceito de AT/SEM não seja novo, seu uso ainda não é tão difundido quanto seus méritos sugerem. No geral, fornece um procedimento complementar a outros métodos EM existentes. O AT/SEM é compatível com a mais ampla gama de protocolos de preparação de amostras e fluxos de trabalho de imagem e pode ser feito em qualquer microscópio FIB/SEM ou SBF-SEM como técnica de acompanhamento. Neste artigo, concentramos-nos no AT para o registro de dados ultraestruturais de amostras menos propensas a serem tratadas com sucesso por outros métodos. Esperamos que o procedimento descrito para a coleta conveniente de seções e estratégias de aquisição consideravelmente automatizadas ajude nas primeiras tentativas para aqueles que nunca encontraram o método e ajude a aperfeiçoá-lo para aqueles que já têm alguma experiência.

Apesar da importância das técnicas relacionadas ao EM, o esforço necessário para dominá-las mantém todo o campo restrito a um pequeno número de especialistas. Uma dificuldade significativa é a identificação e recuperação de uma Região de Interesse (ROI) nas amostras preservadas para EM. O aparecimento da mesma amostra difere consideravelmente quando analisado por microscopia óptica e após o processamento para observação EM. As alterações para amostras quimicamente preparadas incluem o encolhimento da amostra anisotropica após as etapas de desidratação (~10% em cada dimensão) e a perda de fluorescência ao usar o ósmio no protocolo de fixação e coloração(Figura 1A). Para a secção ultrathin, as amostras são incorporadas em resinas epóxi ou acrílicas utilizando diferentes estratégias(Figura 1B). Para resultados bem-sucedidos desta preparação, toda a amostra deve ser fracionada em pedaços que não excedam 1 mm x 1 mm. Para atender aos requisitos padrão das condições de observação da Microscopia eletrônica de Transmissão (TEM), esta pequena porção da amostra é ainda mais seccionada para fatias de 50-150 nm de espessura. As imagens resultantes em escala de cinza mostram a organização tecidual e a estrutura organela de uma fração minuciosa de toda a amostra em maior detalhe do que qualquer outra técnica de microscopia(Figura 1C). Um conjunto de dados tem típico fornece informações 2D, teoricamente extrapoladas para entender os processos que ocorrem naturalmente em um espaço 3D em células e tecidos. A Figura 1D apresenta o desafio da aquisição de volumes ultraestruturais: se um cubo de 1.000 μm lateral for seccionado com 50 nm de espessura, 20.000 seções serão necessárias para cobrir todo o volume; para um cubo lateral de 500 μm, serão 10.000 seções. Para cobrir um volume de 50 μm x 50 μm x 50 μm, 1.000 seções "apenas" podem ser necessárias. Obter esse volume manualmente é praticamente impossível e extremamente desafiador para realizar com automação. Se, além da profundidade da amostra, precisarmos cobrir toda a superfície desses cubos hipotéticos, a cobertura de 1 μm2 superfície em resolução razoável torna-se uma questão logística séria(Figura 1E). Embora para os projetos extraordinários em larga escala, como abordagens de connectômica, o grande número de seções é crucial, para a maioria dos projetos EM "mundanos", gerar mais seções necessárias para a observação apresenta uma desvantagem significativa.
Existem vários métodos para adquirir informações ultraestruturais 3D: seção serial De Microscopia eletrônica de transmissão (TEM), tomografia TEM, Tomografia de Array (AT), Microscopia eletrônica de varredura de imagens de bloco serial (SBF-SEM) e Microscopia eletrônica de varredura de feixe de íons focado (FIB-SEM). As principais diferenças entre esses métodos são a estratégia de secção e se a aquisição de imagem está acoplado à seção geração1. Na seção serial TEM, seções sequenciais são coletadas em grades de ranhura, imagens TEM são geradas a partir dessas sequências e alinhadas2,3,4,5. Na tomografia TEM, a série de inclinação de 150-300 nm seções em uma grade, e quando acoplado à seção serial, fornecem uma resolução muito alta, embora relativamente pequenos volumes6,7,8. A abordagem AT usa seção física com diversas formas manuais e semiautomáticas de seções de coleta em suporte relativamente grande, como tampas de vidro, wafers de silício ou uma fita especial. Para aquisição de imagens, o suporte é analisado no SEM, com diversas estratégias de aquisição de imagens disponíveis9,10,11,12,13,14,15 . Para a SBF-SEM, a secção física é realizada utilizando-se um mini-microtómeo com uma faca de diamante fixada diretamente dentro da câmara SEM, com a imagem SEM gerada a partir da superfície do bloco de resina16,17,18,19. Para o FIB-SEM, a fonte de íon remove camadas finas da amostra, seguida de imagem automática da superfície exposta pelo SEM20,21. A TEM-tomografia e o AT geram seções físicas, que podem ser reimagem, se necessário, enquanto FSBF-SEM e FIB-SEM eliminam a seção após a imagem. Uma combinação recente de seções físicas imagens por um SEM multi-feixe fornece uma combinação de métodos que resolve o problema do "gargalo" da velocidade de aquisição de imagem22. Cada uma dessas técnicas revolucionou a forma como os dados EM podem ser obtidos e analisados, e cada abordagem tem seus impactos práticos relacionados a uma determinada questão de pesquisa.
Dada a natureza da preparação e a escala das dimensões ultraestruturais, não é simples prever onde uma estrutura alvo específica está localizada no bloco amostral (Figure1D,E). Uma solução para a localização do ROI é gravar as imagens de todo o bloco na resolução desejada desde o início. As estruturas de interesse podem estar no volume de dados adquiridos quando longe do microscópio. O tempo de aquisição e o manuseio de dados associados a essa estratégia são problemáticos. É desejável reduzir a quantidade de dados registrados, especialmente se os ROIs forem muito menores do que o bloco tecidual, ou seja, se os objetos de interesse são tipos específicos de células (não órgãos inteiros). Diferentes técnicas correlativas de luz e microscopia eletrônica (CLEM) podem ser bem sucedidas quando a fluorescência for preservada e localizada antes ou depois da preparação dentro da mesma amostra23,24,25,26,27,28,29. No entanto, muitas estruturas celulares são reconhecíveis mesmo sem correlação de fluorescência, apenas com base na ultraestrutura conhecida. Para esses casos, acreditamos que a tomografia do Array de triagem lateral proporciona uma troca de equilíbrio entre o esforço investido na localização do ROI e a qualidade da informação ultraestrutural. Usando essa estratégia, um subcontrato de seções no wafer é exibido dentro de intervalos regulares, que podem ser estabelecidos com base no tamanho e natureza do ROI. Uma vez encontradas ROIs, a aquisição de dados é configurada em uma série contínua de seções que começam antes e terminam após a seção âncora, coletando as informações relevantes de forma direcionada.
Apresentamos protocolos para AT que simplificam e aceleram a aquisição de regiões ou eventos de interesse em inúmeras seções e produzem volumes de imagem mais alinhados. A triagem lateral e a aquisição de várias etapas produzem dados com resolução muito alta em regiões precisamente visadas. O procedimento que descrevemos aborda vários desafios da aquisição de dados 3D EM, como prevê: compatibilidade com uma ampla gama de espécimes sem alterar fundamentalmente o fluxo de trabalho de preparação da amostra; localização direcionada para secção e aquisições de SEM; tempo e esforço reduzidos durante a configuração; imagem de regiões em múltiplas seções com melhor alinhamento dos volumes resultantes; e um procedimento de costura e alinhamento suave para compilar diferentes imagens em uma imagem de mosaico costurada. Optamos por demonstrar a força do nosso método com várias amostras de projetos publicados e em andamento. Acreditamos que essa abordagem pode facilitar significativamente a geração e aquisição de dados EM direcionados, mesmo para pesquisadores com experiência em EM limitada.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AT sectioning knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUATS3530</td>
			<td>Diatome Jumbo knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td>Diatome trimming 20&#176; 
			Glass knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16015</td>
			<td>Resistance: 1-30 Ohms 
			Type P: (Boron) (1 primary flat) 
			Roughness: 2 nm 
			No SiO2 top coating 
			TTV: = &#60;20 &#181;m 
			Wafer is polished on one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer cleaving kit</td>
			<td>EMS</td>
			<td>7642</td>
			<td>EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Thermo Fischer Helios</td>
			<td>1072419</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maps 3 for SEM with Correlative Workflow &#38; Array Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1135932</td>
			<td>Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira x.y</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131599</td>
			<td>Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td>IMOD, MIB (See text for refferences)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy

A microscopia eletrônica é aplicada em biologia e medicina para imagens de detalhes celulares e estruturais na resolução de nanômetros. Historicamente, a Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) forneceu uma visão da ultraestrutura celular, mas na última década, o desenvolvimento dos modernos microscópios eletrônicos de varredura (SEM) mudou a maneira de olhar dentro das células. Embora a resolução do TEM seja superior quando são necessários detalhes estruturais de nível proteico, a resolução sem é suficiente para a maioria das questões relacionadas à biologia celular de nível organela. O avanço da tecnologia possibilitou soluções automáticas de aquisição de volume, como imagem serial de face de bloco (SBF-SEM) e feixe de íons focados SEM (FIB-SEM). No entanto, até hoje, esses métodos permanecem ineficientes quando a identificação e navegação para áreas de interesse são cruciais. Sem os meios para localização precisa de áreas alvo antes da imagem, os operadores precisam adquirir muito mais dados do que precisam (na SBF-SEM), ou, pior ainda, preparar muitas grades e imagem de todas (no TEM). Propomos a estratégia de "triagem lateral" utilizando a Tomografia Matriz no SEM, que facilita a localização de áreas de interesse, seguida de imagem automatizada da fração relevante do volume total da amostra. Amostras de tomografia são conservadas durante a imagem, e podem ser organizadas em bibliotecas de seção prontas para imagens repetidas. Vários exemplos são mostrados em que a triagem lateral nos permite analisar detalhes estruturais que são incrivelmente desafiadores para acessar com qualquer outro método.

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Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Descrevemos a preparação de fitas de seções seriais e sua coleção em grande suporte de transferência para uso como amostras de tomografia de array, juntamente com procedimentos automatizados de imagem em um microscópio eletrônico de varredura. O protocolo permite a triagem, recuperação e imagens direcionadas de eventos locais, raros e a aquisição de grandes volumes de dados.

Fluxo de trabalho de tomografia de array para a aquisição direcionada de informações de volume usando microscopia eletrônica de varredura

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

A análise da microscopia eletrônica é frequentemente complexa. Acreditamos que nosso protocolo facilita o processamento e aquisição dos dados EM a partir da grande superfície da amostra e volume intermediário. Nosso protocolo ajuda a encontrar estruturas alvo em seções seriais.O registro de dados é limitado ao que é necessário. Em comparação com a aquisição de dados em blocos de tecido inteiro, o tempo de gravação é reduzido e a análise de dados é mais fácil. Dada a facilidade geral da abordagem, acreditamos que ela pode ser usada para abordar não apenas questões científicas, mas também como uma ferramenta de diagnóstico.Para gerar uma matriz para análise, primeiro aperte a amostra em um suporte ultramicromédo e use uma lâmina de barbear para aproximadamente aparar a resina ao redor da amostra. Use uma ferramenta de corte de diamante para aparar bem a amostra e use facas de corte de inclinação de 20 ou 90 graus para garantir que as superfícies superior e inferior do bloco estejam paralelas à borda de corte da faca. Misture o xileno e a cola em uma proporção de 3:1 e use um cílio preso a um palito para aplicar a mistura nas bordas superior e inferior do bloco aparado.Enquanto a mistura estiver secando, use uma ferramenta de corte de wafer para cortar um pedaço de wafer ao tamanho apropriado para a análise. Limpe o wafer em água destilada para enxaguar os detritos e limpar a superfície com plasma depois que o wafer estiver seco. Para preparar uma faca de tomografia, use fita adesiva espumosa para prender uma agulha na parte inferior de uma faca histo jumbo e coloque a faca no suporte de ultra microtómeo a zero graus.Ajuste a borda da faca paralela à superfície do bloco e leve o bloco aparado para a borda da faca em uma posição pronta para secção. Coloque o wafer limpo na bacia da faca e encha a bacia com água ao mesmo nível da borda da faca, em seguida, deixe a borda de diamante da faca umidificar corretamente, usando a seringa presa para adicionar ou retirar a água conforme necessário. Para seção de matriz, defina o microtome para uma faixa de corte de 50 a 100 nanômetros e uma velocidade de corte de 6 a 1 milímetros por segundo, e comece a seção para obter uma fita longa o suficiente para cobrir um volume Z direcionado.Dependendo do tamanho do bloco, homogeneidade do tecido e tipo de resina, a fita será aproximadamente reta. Use uma ponta limpa e anti pegajosa de um cílio para separar as fitas da borda da faca. Use o cílio para mover suavemente a fita para o centro do meio de suporte.Clorofórmio ou caneta de aquecimento podem ser usados para esticar a seção, se necessário. Após o alongamento, retraia a seringa para começar a drenar a água. Para fitas mais delicadas, ou uma retração de água mais lenta, retire a seringa da mangueira para deixar a água escorrer.Quando o nível da água atingir o nível do wafer, empurre suavemente a fita para o centro da bacia e continue a drenar até que toda a água restante seja completamente removida da bacia. Deixe o wafer secar em um ambiente limpo. A secagem leva aproximadamente 30 minutos.Quando a amostra estiver completamente seca, transfira a matriz para uma caixa bem fechada para protegê-la da contaminação da sujeira. E coloque a caixa em um forno de 60 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Para adquirir um mapa de visão geral das imagens SEM que revelam os locais da seção no wafer, use a câmera óptica incorporada para adquirir uma imagem SEM que cubra uma fita de seções.Para criar um mosaico, clique e arraste a imagem da câmera da amostra e inicie a aquisição automática. Adquira visões gerais em maior resolução para encontrar estruturas-alvo. Se apenas algumas seções precisarem ser imagens, use o visualizador zoom para visualizar imagens adquiridas em seus locais originais.Uma vez identificada uma seção que deve ser imagem em alta resolução, clique e arraste para criar uma região de imagem, selecione Configurações de imagem de alta resolução e armazene as configurações em um modelo Para encontrar eventos raros particularmente pequenos ou difíceis de detectar, use as configurações de imagem de alta resolução em cada seção 10 ou em uma seção por fita para criar manualmente uma região de imagem e adquirir as imagens. Em seguida, revise as imagens e marque seções que contenham a região de interesse. Para adquirir mais de 10 seções consecutivas, use o localizador de seção para localizar todas as seções automaticamente.Se as imagens de visão geral não mostrarem regiões claras de interesse, adquira imagens de maior resolução das seções e use a função de visualização da seção para criar e adquirir as imagens automaticamente. Para determinar as configurações de imagem ideais, ative a imagem ao vivo no software de controle de microscópio e navegue até uma região de interesse, em seguida, ajuste as configurações de imagem até que as imagens mostrem regiões claras de interesse, mas sem uma aquisição excessiva de imagens, de acordo com as diretrizes do fabricante. Para otimizar o posicionamento das regiões de imagem em seções consecutivas, amplie a imagem de interesse e clique em Iniciar o Refinamento de Posição para aumentar a precisão dos locais de seção registrados.Para definir uma região de imagem, clique e arraste em qualquer seção enquanto segura a tecla Alt e selecione Criar conjunto de azulejos no menu de contexto pop-up. O software criará regiões de imagem no mesmo local relativo em todas as seções que foram encontradas ou marcadas anteriormente. Em seguida, configure a contagem de pixels, o tamanho do pixel, o layout de revestimento e o tempo de moradia dos pixels em cada série de imagens, conforme necessário.Para configurar a função automática, crie uma série de imagens separada para funções automáticas como demonstrado e mova a série de imagens para uma posição na seção que contém estruturas de alto contraste. Defina a série de imagens para 1024 x 884 pixels e selecione um tamanho de pixel correspondente à maior resolução usada na série de imagens. Na lista de funções automáticas, verifique o foco automático e o estigma automático.Selecione Bisection nos controles de sequência de aquisição e confirme que a imagem da função automática é o primeiro item da lista e clique em Adquirir Tudo para iniciar a aquisição da imagem. Quando todas as séries de imagens tiverem sido criadas e configuradas, a série será listada em uma fila de empregos. A aquisição de baixa resolução pode ser realizada manualmente ou automaticamente diretamente em partes selecionadas da seção ou em uma seção inteira usando imagens únicas ou de mosaico, seguidas de costura.Imagens da área selecionada podem então ser adquiridas usando parâmetros de alta resolução para visualizar mitocôndrias, núcleos e microvilli, por exemplo, Após a aquisição automática de mapas de mosaico resolvidos, várias regiões de interesse podem ser cortadas ou usadas para definir áreas de imagem locais adicionais dentro das regiões. Embora diferentes tipos de células especializadas no intestino Drosophila sejam distribuídos aleatoriamente, eles podem ser visualizados após a triagem das imagens usando parâmetros de alta resolução, seja de seções únicas ou como uma coleção de imagens seriais. Após o alinhamento, as pilhas podem ser renderizadas usando diferentes soluções de software.A análise da tomografia do array permite que muitas seções sequenciais sejam geradas no wafer único e sejam examinadas usando parâmetros de baixa resolução para localização das áreas gerais de interesse. Essas áreas podem ser direcionadas para análise suplementar usando parâmetros avançados de aquisição. Por exemplo, divisões mitóticas no notum não são fáceis de localização no nível ultraestrusivo, pois as células são relativamente grandes em comparação com a zona de abscisão.Usando este método, no entanto, as imagens de visão geral automática de resolução média dos saltos de 20 a 40 seções podem ser usadas para localização das células divisórias. O procedimento de tomografia do array fornece uma análise mais simples de dados de microscopia eletrônica. Incentivamos os espectadores a investir em dominar a regeneração e se familiarizar com o fluxo de trabalho relacionado aos mapas Em nossa experiência, poucos tópicos de pesquisa exigem a análise ultraestrutural de animais inteiros ou órgãos inteiros.Nosso método ajuda na rápida localização das células e seus parceiros de interação nos tecidos.

Research

JoVE Journal

Biology

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Biologia

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

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Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

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Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

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Investigando os prejudiciais efeitos de baixa pressão Plasma esterilização na sobrevivência de esporos de Bacillus subtilis usando Live celular microscopia

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

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Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

Estudos alvejados usando a cara de bloco de série e a microscopia focalizada da varredura do feixe de íon

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Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBF-SEM) de amostras de tecido biológico

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...