Name: array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 47 s
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Queremos agradecer a los miembros de la instalación EM de la Universidad de Lausana por su apoyo durante este desarrollo de diferentes pasos del procedimiento AT. Nos gustaría agradecer a Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O'Brien y Lindsay Lewellyn por las discusiones durante la preparación del manuscrito y la lectura crítica. Queremos reconocer a los grupos que contribuyeron con las muestras utilizadas para demostrar los diferentes escenarios: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat y Fanny Langlet.

NOTA: Los métodos de preparación de muestras se describen en otra parte14,30,31y no se tratan en esta publicación. En resumen, los ejemplos mostrados se fijaron químicamente con glutaraldehído, se posfijaron con 1% de OsO4,luego se trataron con acetato de uranilo acuoso al 1% antes de incrustarlo en la resina incrustada. Alternativamente, las muestras se pueden preparar utilizando congelación a alta presión, se pueden congelar con acetato de uranilo al 0,1% en acetona e incrustarse en resina acrílica. Los bloques de muestra se prepararon utilizando un método de incrustación plana que permite una visión clara de la muestra, facilitando su orientación para la sección (Figura 1B).
1. Procedimiento de generación de arreglos de discos
<ol><li>Orientación y recorte de muestras integrados<ol>
<li>Usando el binocular / microscopio, identifique y marque el ROI en la superficie del bloque incrustado rascando ligeramente la superficie del bloque con una cuchilla de afeitar. Esto ayudará a orientar la muestra dentro del ultramicrotomo y reducirá la superficie de seccionamiento.</li>
		<li>Sujete la muestra en el soporte del ultramicrotomo (Figura 2A).</li>
		<li>Recorte la resina alrededor de la muestra, primero con la hoja de afeitar (recorte en bruto) y continúe con la herramienta de recorte de diamante (recorte fino; Figura 2A). Use cuchillos con una inclinación del borde de 20 ° o 90 ° para asegurarse de que las superficies superior e inferior del bloque sean paralelas al filo de corte del cuchillo. NOTA: Este paso es fundamental para la seccionamiento en serie y la adquisición de cintas rectas.</li>
		<li>Mezcle xileno y pegamento en proporción 3:1. Con una pestaña unida a un palillo de dientes, aplique esta mezcla en los bordes superior e inferior del bloque recortado. Deja que se seque bien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare el soporte de montaje de la matriz A (es decir, obleas de silicio).<ol>
<li>Corte la pieza de la oblea con una herramienta de escisión de obleas (EMS), ajustando su tamaño al objetivo del proyecto. 2 cm x 4 cm es conveniente tanto para observaciones de luz como de microscopía electrónica.</li>
		<li>Limpie la oblea en agua destilada para deshacerse de los escombros.</li>
		<li>Descarga de resplandor/plasma limpia la superficie con equipo estándar. Los parámetros precisos dependerán de la máquina utilizada. Comience con los parámetros para la descarga de las rejillas y ajuste empíricamente el tiempo. Este paso es crucial para una buena distribución de las secciones en el soporte mientras las secciones se están secando y no debe omitirse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar el soporte de montaje B de las matrices (es decir, cubiertas de vidrio)<ol>
<li>Si planea experimentos de inmunomarcado multiplex, transfiera las muestras en un cubrehojas para detectar mejor la señal de fluorescencia. Para mejorar la adhesividad de la capa de cubierta, utilice un procedimiento detallado de recubrimiento de gelatina que se describe anteriormente9.</li>
		<li>Aumente la conductividad recubriendo las diapositivas con el óxido de indio-estaño (ITO) u oro por evaporación. Mantenga los cubrehojas preparados en un ambiente limpio. Descarga con resplandor las muestras como se describe en el punto 1.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Seccionamiento de la muestra
<ol><li>Preparación del cuchillo AT NOTA: Para generar las matrices, utilice un cuchillo modificado (ATS), diseñado para facilitar la adquisición de cintas largas. Los cuchillos Histo-Jumbo o cuchillos similares concebidos para la generación de las secciones en soportes grandes también pueden servir para la seccionamiento AT.<ol>
<li>Fije la aguja en la parte inferior del cuchillo con la cinta adhesiva espumosa y perfore (Figura 2B). Coloque el cuchillo ATS en el soporte del ultramicrotomo a 0°. Ajuste el borde de la cuchilla en paralelo a la superficie del bloque utilizando el procedimiento estándar.</li>
		<li>Lleve el bloque recortado al borde del cuchillo en una posición lista para la seccionamiento.</li>
		<li>Coloque la oblea/ funda dentro del recipiente del cuchillo y llénela con agua al mismo nivel que el filo del cuchillo. Deje que el filo de diamante del cuchillo se humidifique correctamente y, si es necesario, extraiga el agua con la jeringa adjunta (Figura 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Seccionamiento y transferencia de arreglos de discos<ol>
<li>Ajuste el microtomo a los parámetros de corte deseados. Con la cuchilla ATS, el rango de 50-100 nm y una velocidad de corte de 0.6-1 mm / s son recomendables. Iniciar la sección (Figura 2Di).</li>
		<li>Obtenga una cinta de la longitud que cubrirá un volumen z específico y detenga la colección. Dependiendo del tamaño del bloque, la homogeneidad del tejido y el tipo de resina, la cinta será relativamente recta (Figura 2D-ii). Muchas muestras no producirán cintas rectas, a pesar del esfuerzo invertido y el tipo de cuchillo que se utiliza.</li>
		<li>Dependiendo del objetivo final, haz una cinta larga o varias cintas cortas alineadas una al lado de la otra. Un soporte de 2 cm x 4 cm puede sostener convenientemente de 100 a 1,000 secciones. La disposición de la cinta en el escalón de soporte es un paso que requiere destreza y manos firmes. Sin embargo, la curva de aprendizaje para esta habilidad se adquiere rápidamente.</li>
		<li>Separe la cinta del filo del cuchillo con una punta limpia y no pegajosa de una pestaña pegada en el palillo (Figura 2Diii).</li>
		<li>Usando la pestaña, mueva suavemente la cinta por encima del centro del medio de soporte. En este punto, use cloroformo o pluma calefactora para estirar las secciones si es necesario. Sin embargo, recuerde que esta manipulación puede inducir la rotura de la cinta y la deformación.</li>
		<li>Comience a drenar el agua tirando de la jeringa. Para cintas más delicadas o una retracción de agua más lenta, deje que el agua gotee separando la jeringa de la manguera. Cuando el nivel de agua esté bajando al nivel de la oblea, controle la cinta y reposicionarla si es necesario, empujando suavemente la cinta hacia el centro. Después de asentar las cintas en la superficie de la oblea, continúe drenando hasta que el agua restante se retraiga por completo de la cuenca. NOTA: Si no usa el cuchillo ATS de retracción de agua inferior, reduzca cuidadosamente el agua de los lados del cuchillo ATS para no inducir turbulencias.</li>
		<li>Deje que las secciones en el soporte dentro del baño se sequen por completo. Dependiendo de la hidrofobicidad del soporte y del nivel de humedad ambiental, el agua se evaporará a una velocidad diferente(Figura 2Div). Es importante dejar que la muestra se seque lentamente para disminuir o evitar por completo todos los pliegues de la muestra.</li>
		<li>Transfiera la muestra seca a una caja bien cerrada para protegerla de la contaminación por suciedad y colóquela en un horno de 60 °C durante al menos 30 minutos. Si es necesario, contramante secciones que utilizan metales pesados para mejorar el contraste general.</li>
		<li>Al final del procedimiento, limpie con precaución el cuchillo siguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA: La transferencia de secciones múltiples o en serie en una oblea (Figura 2E) en comparación con la transferencia en una rejilla de ranura (Figura 2F) cambia la experiencia de preparación EM por completo. La seccionamiento y la recopilación ininterrumpidos de las secciones en soporte único reducen la cantidad de seccionamiento y los errores relacionados con la recopilación de secciones frecuentes en la sección en serie. El equivalente a 100 secciones de 1000 μm x 500 μm recogidas en una oblea corresponde a 33 rejillas de ranura(Figura 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Observación de la muestra
NOTA: En esta sección se describen los pasos del flujo de trabajo implementados mediante un software disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales). Se puede utilizar cualquier software de adquisición de imágenes en cualquier SEM equipado con los detectores correctos, sin embargo, las acciones específicas del usuario diferirán y, a menudo, serán más manuales.
<ol><li>Adquiera un mapa general de imágenes SEM que revele las ubicaciones de las secciones en la oblea. Una imagen de cámara óptica incorporada ayuda a definir un mosaico de imágenes SEM que cubre una cinta de secciones o todas las secciones. Cree el mosaico haciendo clic y arrastre con el ratón a la derecha en la imagen de la cámara de la muestra e inicie la Adquisición automática. NOTA: Los ajustes de imagen muy gruesos, es decir, el tamaño de píxel de 1-2 μm y el tiempo de permanencia de 1 μs son suficientes. Este proceso se ilustra en Material Complementario (páginas 2-7).</li>
	<li>Localice secciones con la función detección automática del Buscador de secciones o localícelas manualmente. Las posiciones y contornos de las secciones se recuperan automáticamente con este software basado en la coincidencia de imágenes. Para ilustrar este proceso, véase Material complementario (páginas 8 a 15).</li>
	<li>En caso de que las imágenes de resumen no muestren claramente los ROI, adquiera imágenes de mayor resolución de las secciones. Utilice la función Vista previa de sección para crear y adquirir imágenes automáticamente. Este proceso se ilustra en Material Complementario,páginas 16-18. La configuración de imágenes debe elegirse de acuerdo con la naturaleza y el tamaño del ROI que el usuario busca.<ol>
<li>Para encontrar la configuración óptima, active Live Imaging en el software de control del microscopio y navegue a un ROI. Modifique la configuración de imágenes hasta que las imágenes muestren el ROI claramente, pero la adquisición de imágenes no es excesivamente larga.</li>
	</ol></li>
	<li>Definir regiones de imagen NOTA: Se proponen varias estrategias diferentes.<ol>
<li>Si solo es necesario crear imágenes de unas pocas secciones, use las imágenes de las secciones creadas hasta ahora para navegar a las secciones relevantes y use el Visor ampliable que muestra todas las imágenes adquiridas en sus ubicaciones relativas originales para ver todas las secciones. Una vez que se encuentra una sección que debe ser fotografiada en alta resolución, cree una región de imagen con click-drag. Elija la configuración de imágenes de alta resolución y almacene la configuración en una plantilla. Reutiliza esta plantilla para otras secciones.</li>
		<li>Para encontrar eventos raros particularmente pequeños o difíciles de detectar, use el enfoque de detección lateral. Cree manualmente una región de imágenes con ajustes de imágenes de alta resolución en cada décima sección o en una sección por cinta y adquiera las imágenes. Revise las imágenes y marque las secciones que contienen el ROI en el software o tome nota.<ol>
<li>A partir de secciones que contienen el ROI, navegue hacia adelante y hacia atrás a través del conjunto de secciones y cree regiones de imágenes de alta resolución en las mismas ubicaciones relativas durante el tiempo que la estructura siga siendo visible en la sección. Esto se puede hacer manualmente o utilizando el procedimiento descrito en los siguientes pasos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adquiere imágenes en más de diez secciones consecutivas. Haga clic en Iniciar refinamiento de posición después de ampliar la imagen para aumentar la precisión de las ubicaciones de sección registradas como se describe en el manual. Al hacerlo, disminuye la variabilidad de posición de las series de imágenes. El procedimiento se ilustra y explica en las páginas 19-21 del Material Complementario.</li>
		<li>Haga clic y arrastre en cualquier sección para definir una región de imagen mientras mantiene presionada la tecla Alt y seleccione Crear matriz de conjunto de mosaicos en el menú contextual que se abre cuando se suelta el botón del mouse. Luego, el software crea regiones de imágenes en la misma ubicación relativa en todas las secciones que se han encontrado o marcado anteriormente. Es posible limitar las imágenes a un rango específico de secciones con el control deslizante Section Span. NOTA: Este procedimiento se puede repetir con cualquier número de regiones de imagen y, por lo tanto, permite grabar muchas imágenes pequeñas de alta resolución en lugar de grabar una sola imagen más grande en cada sección.</li>
		<li>Una vez creado, configure el recuento de píxeles, el tamaño de píxel, el diseño de mosaico, el tiempo de permanencia de píxeles, etc. en cada serie de imágenes según sea necesario. Una vez que se crean y configuran las series de imágenes, todas se enumeran en una señal de trabajo.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurar funciones automáticas e iniciar la adquisición de imágenes<ol>
<li>Cree una serie de imágenes independiente para las funciones automáticas utilizando el mismo método que se describe en el paso anterior. Mueva la serie de imágenes a una posición en la sección que contenga estructuras de alto contraste.</li>
		<li>Establezca la serie de imágenes en 1024 x 884 píxeles y elija un tamaño de píxel correspondiente a la resolución más alta utilizada en la serie de imágenes configurada en los pasos anteriores. En la lista de funciones automáticas, marque Enfoque automático y Estigmatizador automático.</li>
		<li>Seleccione Por sección en los controles de la secuencia de adquisición y asegúrese de que la imagen de funciones automáticas es el primer elemento de la lista. Inicie la adquisición de la imagen haciendo clic en el botón Ejecutar situado junto a la señal de trabajo. Estos procedimientos se ilustran en Material Complementario,páginas 22-23. NOTA: No es necesario preenfocar manualmente en cada sección. Durante la sesión de grabación, cada vez que el microscopio avanza a una nueva sección, las funciones automáticas se ejecutarán antes de que todas las demás imágenes se graben en esta sección.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Alineación y análisis de datos
<ol><li>Exportación de datos<ol>
<li>Asegúrese de que los datos se guardan en formato .tif, por lo que no es necesario una función de exportación dedicada. Ordene los datos en una estructura de carpetas que corresponda directamente a las capas y elementos del árbol de capas.</li>
		<li>Una vez que se hayan grabado los mosaicos de imágenes, utilice la función StitchAll para coser automáticamente todos los mosaicos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alineación de pilas y recorte en Fiji NOTA. Muchos paquetes de software (gratuitos y comerciales) se pueden utilizar para trabajar con datos de array tomography. Los pasos a continuación se muestran con el programa de código abierto Fiji32 porque está ampliamente disponible y contiene todas las funciones requeridas.<ol>
<li>Importe una pila de imágenes (o imágenes cosidas) a Fiji como una pila virtual.</li>
		<li>Si es necesario normalizar el contraste/brillo, elija Contraste mejorado... en el menú Proceso. Establezca Píxeles saturados en 0,1 o menos y marque Procesar todos los sectores.</li>
		<li>En el menú Plugins, selecciona Registro | Alineación lineal de la pila con SIFT.</li>
		<li>Elija Rígido o Afín en el menú desplegable Transformación esperada. De lo contrario, mantenga la configuración predeterminada. Inicie la alineación haciendo clic en Aceptar. NOTA: La carga de los datos como pila virtual permite a Fiji manejar pilas de cualquier tamaño. La salida de la alineación se crea en RAM; sin embargo, esto puede limitar el tamaño máximo de las pilas que se pueden procesar. En ese caso, utilice Register Virtual Stack Slices, que es una implementación de carpeta a carpeta del mismo algoritmo de registro. Una vez completado el registro, cargue los datos de salida como una pila virtual.</li>
		<li>Recorte la pila de imágenes haciendo clic en Recortar para que contenga solo el ROI.</li>
		<li>Guarde la pila como una sola imagen .tif o una serie de imágenes .tif. NOTA: Los pasos críticos de la tomografía de matriz se muestran en la Figura 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Luckner, M., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+light+microscopy+to+analytical+scanning+electron+microscopy+(SEM)+and+focused+ion+beam+(FIB)/SEM+in+biology:+Fixed+coordinates,+flat+embedding,+absolute+references.">From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. 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El autor Tilman Franke es un empleado de Thermo Fisher que fabrica microscopios electrónicos y programas de pilotaje que se utilizan en el artículo.

La microscopía electrónica da una idea de la ultraestructura de las células y los organismos, para lo cual a menudo es deseable obtener imágenes de estructuras de interés en su contexto de 3 dimensiones. A pesar de las numerosas tácticas de EM para el análisis ultraestructural, todavía no existe una solución "estándar de oro". La razón principal es la gran variedad de muestras, muchas preguntas biológicas, que con frecuencia requieren un enfoque personalizado. El flujo de trabajo de AT propuesto está diseñado para minimizar el tiempo necesario para el procesamiento de muestras, la adquisición de datos, la evaluación y el almacenamiento. Además, el cuchillo modificado proporciona una herramienta útil para simplificar la adquisición de matrices. El diseño compacto de las secciones en las obleas es conveniente, tanto para la observación como para el almacenamiento posterior de las muestras. Esta disposición permite el "cribado lateral" de muestras moviéndose horizontalmente de cinta a cinta y escaneando solo una sección en cada una, lo que reduce significativamente el tiempo requerido para localizar un ROI. Los escenarios de adquisición de datos propuestos facilitan la focalización de áreas pequeñas y distribuidas aleatoriamente. Una vez encontradas, AT/SEM restringe las imágenes de alta resolución precisamente al volumen de interés, ya sea que se realicen manualmente o con la ayuda de la función automática. AT para volúmenes limitados se puede completar manualmente, con el operador navegando a través de la muestra y definiendo las regiones de imagen una por una. El módulo automatizado del software proporciona una estrategia flexible de adquisición de imágenes para la obtención de imágenes de áreas pequeñas en secciones grandes. La automatización en este software permite grabar grandes imágenes de alta resolución en cientos de secciones, logrando volúmenes similares a los de SBFI. La grabación de imágenes generales de todas las secciones simplifica la localización del ROI y reduce el tiempo que se pasa en el microscopio. Dado que las secciones no se dañan durante la grabación de resúmenes y vistas previas de mayor resolución, AT / SEM permite reutilizar la muestra para recopilar más datos de otros ROI o a una resolución más alta.
El tiempo de adquisición de imágenes es uno de los aspectos más importantes (y más caros) de 3D EM y, por lo tanto, debe considerarse en el diseño del experimento. Si bien no es sorprendente que la obtención de imágenes de áreas grandes tome más tiempo que la obtención de imágenes de áreas pequeñas, es fácil subestimar el impacto: dependiendo de los parámetros de imagen seleccionados, el tiempo de adquisición en cada sección puede variar de segundos a horas. Los parámetros críticos de imagen incluyen el tamaño del campo de visión, la resolución y el tiempo de permanencia. Suponiendo una resolución objetivo de 10 nm por píxel y un tiempo de permanencia de 1 μs, la obtención de imágenes de un campo de 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm o 500 μm x500 μm tarda 4 segundos, 100 segundos o 2.500 s en grabarse. Podemos multiplicar estos tiempos de imagen por sección por el número de secciones para estimar el tiempo requerido para el trabajo completo de imágenes. Los tiempos largos de obtención de imágenes por sección pueden ser aceptables si el número de secciones es pequeño o si el tiempo de la herramienta del microscopio no es motivo de preocupación.
Sin embargo, es necesario limitar el tiempo de grabación a un trabajo nocturno o un trabajo de fin de semana en la mayoría de los casos. Un aspecto igualmente crítico de 3D EM que debe considerarse es la cantidad y estructura de los datos de imagen resultantes. El registro de los campos de imagen mencionados anteriormente en 100 secciones genera 400 mb, 10 gb o 250 gb de datos de imagen, respectivamente; las imágenes de 500 μm x 500 μm plantean el problema adicional de ser mayores de 2 gb cada una. Muchos de los programas de software utilizados para la evaluación de datos no pueden abrir imágenes de este tamaño.
Para reducir el tiempo de obtención de imágenes, es importante elegir el tiempo de permanencia de los píxeles para cumplir con los requisitos de relación señal-ruido para la evaluación de datos posterior (por ejemplo, reconstrucción, rastreo) y limitar las grabaciones a ROI definidos. La extensión AT del software facilita la adquisición de imágenes en áreas pequeñas en secciones en serie. El software admite flujos de trabajo manuales y automáticos y muchas variantes semiautomáticas: las áreas de imagen se pueden colocar y enfocar manualmente en cada sección, o el usuario puede usar el buscador automático de secciones y las funciones de alineación de posición. Dependiendo del nivel de automatización elegido y respaldado por el tipo de muestra o los objetivos de imagen, el tiempo requerido para configurar la adquisición de imágenes en cientos de secciones puede tomar un día de trabajo completo (hecho manualmente) o solo unos minutos. En principio, la tomografía de matriz hace que sea más difícil que otros métodos 3D EM adquirir pequeños ROI; la colocación imprecisa de la región en secciones consecutivas debe compensarse mediante la adquisición de áreas más grandes. Por ejemplo, si el ROI es de 20 μm x 20 μm de tamaño y la variabilidad de posición de sección a sección de los campos de imagen es de 10 μm, uno necesita adquirir imágenes de 40 μm x 40 μm para asegurarse de que el ROI se capture completamente en cada imagen, en cada sección. La variabilidad de la posición de la imagen en el mundo real varía de 100 μm a <10 μm dependiendo de la disponibilidad o calidad de las funciones del software para la alineación de la posición o la paciencia del usuario. Con este software, se pueden lograr 10 μm sin demasiada intervención manual en la mayoría de las muestras.
Como cualquier técnica, el AT tiene varios puntos débiles que pueden influir en la adquisición exitosa de datos, y muchos son similares a otros métodos basados en seccionamiento. La falta de distribución homogénea de resina vacía versus tejido puede resultar en matrices curvas o rotas. En casos extremos, las secciones pueden separarse del soporte (Figura 6A). La compresión o estiramiento variable durante el proceso de corte puede crear pliegues que pueden interrumpir la muestra en regiones variables en secciones posteriores(Figura 6B). Las marcas de cuchillo pueden aparecer en la superficie de las secciones recolectadas usando un cuchillo dañado (Figura 6C). Las diferencias en las condiciones de seccionamiento pueden inducir diferencias ocasionales de compresión y grosor de la sección. Las partículas de polvo o suciedad pueden aterrizar en una sección y oscurecer parcialmente la zona de interés(Figura 6D). La adquisición de imágenes puede fallar debido a funciones imperfectas de contraste automático, enfoque automático y estigmatizador automático. El posicionamiento de las áreas de imagen creadas automáticamente puede ser variable y puede no capturar el ROI en todas las secciones.
Pueden surgir varios problemas en la etapa de costura y alineación. La costura automática de las adquisiciones de azulejos de mosaico puede fallar, por ejemplo, debido al gran espacio vacío dentro de la muestra. Debido a un cambio drástico en la forma en 3D, las pilas de imágenes pueden ser difíciles de registrar. Los programas especialmente desarrollados (por ejemplo, IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB o MAPS-AT) pueden facilitar la alineación semiautomática32,38,39,40. Las secciones más desafiantes se pueden alinear manualmente utilizando el software de edición de fotos. Desafortunadamente, algunos conjuntos de datos pueden ser imposibles de alinear correctamente.
Las muestras grandes son un desafío para las secciones serie TEM que se ajustan a las rejillas; por otro lado, muchos proyectos no justifican la adquisición automática prolongada utilizando FIB/SEM o SBF-SEM. El AT es una alternativa sencilla a un tem de sección serie tediosa donde la recolección y manipulación de secciones en serie en una oblea son más sencillas que con las rejillas de ranura. Se desarrollaron varias estrategias para facilitar la recopilación de las matrices, y compartimos nuestro método para expandir el conjunto de herramientas existente. En los casos en que la identificación del ROI es un desafío, AT-SEM proporciona una ventaja fundamental, con el cribado eficiente de las muestras donde se requiere una resolución a escala de orgánulos en 50 a 500 secciones. Para volúmenes más grandes, las estrategias de AT de recolección automática se pueden recopilar de manera eficiente si se requieren más secciones. Las muestras de AT se pueden volver a visualizar varias veces, lo que facilita la obtención de imágenes específicas de áreas de alta resolución basadas en imágenes generales previamente adquiridas. Creemos que el análisis dirigido y la reducción del sobremuestreo por at/SEM propuestos aquí disminuyen los requisitos de mano de obra y almacenamiento de datos. En última instancia, las bibliotecas de secciones se pueden recopilar y mantener para su posterior reutilización y consulta. Para la adquisición de volumen, los enfoques FIB o SBF-SEM ofrecen una excelente solución siempre que el ROI sea fácil de identificar en la cara del bloque o si se necesitan grandes volúmenes 3D para el análisis. Sin embargo, FIB / SBF-SEM son menos eficientes cuando la imagen de pila de alta resolución debe recopilarse de un ROI definido de manera específica. Para concluir, los métodos propuestos para el cribado de muestras de AT y el uso de imágenes generales de resolución media permiten limitar la adquisición de imágenes a las partes relevantes de la matriz de secciones. La orientación precisa de las regiones de imágenes acelera el tiempo de obtención de datos y simplifica la evaluación de los datos.
En resumen, aunque el concepto de AT/SEM no es novedoso, su uso todavía no está tan extendido como sus méritos sugieren. En general, proporciona un procedimiento complementario a otros métodos EM existentes. AT/SEM es compatible con la más amplia gama de protocolos de preparación de muestras y flujos de trabajo de imágenes y se puede realizar en cualquier microscopio FIB/SEM o SBF-SEM como técnica de acompañamiento. En este artículo, nos hemos concentrado en AT para registrar datos ultraestructurales de muestras que tienen menos probabilidades de ser abordadas con éxito por otros métodos. Esperamos que el procedimiento descrito para la recopilación conveniente de secciones y las estrategias de adquisición considerablemente automatizadas ayuden en los primeros intentos para aquellos que nunca han encontrado el método y ayuden a perfeccionarlo para aquellos que ya tienen algo de experiencia.

A pesar de la importancia de las técnicas relacionadas con los EM, el esfuerzo requerido para dominarlas mantiene todo el campo restringido a un pequeño número de especialistas. Una dificultad significativa es la identificación y recuperación de una Región de Interés (ROI) en las muestras conservadas para EM. La apariencia de la misma muestra difiere considerablemente cuando se analiza por microscopía óptica y después del procesamiento para la observación EM. Los cambios para las muestras preparadas químicamente incluyen la contracción de la muestra anisotrópica después de los pasos de deshidratación (~ 10% en cada dimensión) y la pérdida de fluorescencia cuando se usa osmio en el protocolo de fijación y tinción(Figura 1A). Para la seccionamiento ultrafino, las muestras se incrustan en resinas epoxi o acrílicas utilizando diferentes estrategias(Figura 1B). Para obtener resultados exitosos de esta preparación, toda la muestra debe fraccionarse en piezas que no excedan de 1 mm x 1 mm. Para cumplir con los requisitos estándar de observación de las condiciones de observación de la Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM), esta pequeña porción de la muestra se secciona aún más a rodajas de 50-150 nm de espesor. Las imágenes en escala de grises resultantes muestran la organización del tejido y la estructura del orgánulo de una fracción diminuta de toda la muestra con mayor detalle que cualquier otra técnica de microscopía(Figura 1C). Un conjunto de datos TEM típico proporciona información 2D, teóricamente extrapolada para comprender los procesos que ocurren naturalmente en un espacio 3D en células y tejidos. La Figura 1D presenta el desafío de la adquisición de volúmenes ultraestructurales: si se secciona un cubo de lado de 1.000 μm a 50 nm de espesor, se requerirán 20.000 secciones para cubrir todo el volumen; para un cubo lateral de 500 μm, será de 10.000 secciones. Para cubrir un volumen de 50 μm x 50 μm x 50 μm, podrían ser necesarias 1.000 secciones "solamente". Obtener este volumen manualmente es prácticamente imposible y extremadamente difícil de realizar con automatización. Si, además de la profundidad de la muestra, necesitamos cubrir toda la superficie de tales cubos hipotéticos, la cobertura de 1 μm2 de superficie a una resolución razonable se convierte en un problema logístico grave(Figura 1E). Mientras que para los extraordinarios proyectos a gran escala, como los enfoques de conectómica, el gran número de secciones es crucial, para la mayoría de los proyectos EM "mundanos", generar más secciones requeridas para la observación presenta una desventaja significativa.
Existen varios métodos para adquirir información ultraestructural 3D: microscopía electrónica de transmisión de seccionamiento en serie (TEM), tomografía TEM, tomografía de matriz (AT), microscopía electrónica de barrido de imágenes faciales en bloque serie (SBF-SEM) y microscopía electrónica de barrido de haz iónico enfocado (FIB-SEM). Las principales diferencias entre estos métodos son la estrategia de seccionamiento y si la adquisición de imágenes está acoplada a la sección de generación1. En el seccionamiento en serie TEM, las secciones secuenciales se recogen en cuadrículas de ranuras, las imágenes TEM se generan a partir de estas secuencias y se alinean2,3,4,5. En la tomografía TEM, las series de inclinación de secciones de 150-300 nm en una cuadrícula, y cuando se acoplan a la seccionamiento en serie, proporcionan una resolución muy alta, aunque relativamente pequeñavolúmenes 6,7,8. El enfoque AT utiliza secciones físicas con diversas formas manuales y semiautomáticas de recolección de secciones en soportes relativamente grandes, como cubiertas de vidrio, obleas de silicio o una cinta especial. Para la adquisición de imágenes, el soporte se analiza en SEM, con diversas estrategias de adquisición de imágenes están disponibles9,10,11,12,13,14,15. Para SBF-SEM, la seccionamiento físico se logra utilizando un mini-microtomo con un cuchillo de diamante engastado directamente dentro de la cámara SEM, con la imagen SEM generada a partir de la superficie del bloque de resina16,17,18,19. Para FIB-SEM, la fuente iónica elimina las capas delgadas de la muestra, seguida de imágenes automáticas de la superficie expuesta por el SEM20,21. La tomografía TEM y el AT generan secciones físicas, que se pueden volver a visualizar si es necesario, mientras que FSBF-SEM y FIB-SEM eliminan la sección después de la imagen. Una combinación reciente de secciones físicas fotografiadas por un SEM multihaz proporciona una combinación de métodos que resuelve el problema del "cuello de botella" de la velocidad de adquisición de imágenes22. Cada una de estas técnicas ha revolucionado la forma en que se pueden obtener y analizar los datos em, y cada enfoque tiene sus impactos prácticos relacionados con una pregunta de investigación determinada.
Dada la naturaleza de la preparación y la escala de las dimensiones ultraestructurales, no es sencillo predecir dónde se encuentra una estructura objetivo específica en el bloque de muestra (Figura 1D,E). Una solución para la localización del ROI es grabar las imágenes de todo el bloque a la resolución deseada desde el principio. Las estructuras de interés pueden estar en el volumen de datos adquirido cuando se está lejos del microscopio. El tiempo de adquisición y el manejo de datos asociados con esta estrategia son problemáticos. Es deseable reducir la cantidad de datos registrados, especialmente si los ROI son mucho más pequeños que el bloque tisular, es decir, si los objetos de interés son tipos específicos de células (no órganos completos). Diferentes técnicas correlativas de luz y microscopía electrónica (CLEM) pueden tener éxito cuando la fluorescencia se conserva y localiza antes o después de la preparación dentro de la misma muestra23,24 ,25,26,27,28,29. Sin embargo, muchas estructuras celulares son reconocibles incluso sin correlación de fluorescencia, solo basada en la ultraestructura conocida. Para estos casos, creemos que la tomografía de matriz de cribado lateral proporciona una compensación de equilibrio entre el esfuerzo invertido en la localización del ROI y la calidad de la información ultraestructural. Usando esta estrategia, un subconjunto de secciones en la oblea se examinan dentro de intervalos regulares, que se pueden establecer en función del tamaño y la naturaleza del ROI. Una vez que se encuentran los ROI, la adquisición de datos se configura en una serie continua de secciones que comienzan antes y terminan después de la sección de anclaje, recopilando la información relevante de manera específica.
Presentamos protocolos para AT que simplifican y aceleran la adquisición de regiones o eventos de interés en numerosas secciones y producen volúmenes de imágenes mejor alineados. El cribado lateral y la adquisición multipaso producen datos con muy alta resolución en regiones específicas con precisión. El procedimiento que describimos aborda varios desafíos de la adquisición de datos 3D EM, ya que prevé: compatibilidad con una amplia gama de especímenes sin cambiar fundamentalmente el flujo de trabajo de preparación de muestras; localización específica para seccionamiento y adquisiciones de SEM; reducción del tiempo y el esfuerzo durante la configuración; imágenes de regiones en múltiples secciones con mejor alineación de los volúmenes resultantes; y un procedimiento suave de costura y alineación para compilar diferentes imágenes en una imagen de mosaico cosida. Elegimos demostrar la fortaleza de nuestro método con varias muestras de proyectos publicados y en curso. Creemos que este enfoque puede facilitar significativamente la generación y adquisición de datos EM específicos, incluso para investigadores con experiencia limitada en EM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AT sectioning knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUATS3530</td>
			<td>Diatome Jumbo knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td>Diatome trimming 20&#176; 
			Glass knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16015</td>
			<td>Resistance: 1-30 Ohms 
			Type P: (Boron) (1 primary flat) 
			Roughness: 2 nm 
			No SiO2 top coating 
			TTV: = &#60;20 &#181;m 
			Wafer is polished on one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer cleaving kit</td>
			<td>EMS</td>
			<td>7642</td>
			<td>EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Thermo Fischer Helios</td>
			<td>1072419</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maps 3 for SEM with Correlative Workflow &#38; Array Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1135932</td>
			<td>Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira x.y</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131599</td>
			<td>Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td>IMOD, MIB (See text for refferences)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy

La microscopía electrónica se aplica en biología y medicina para obtener imágenes de detalles celulares y estructurales a resolución nanométrica. Históricamente, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporcionó información sobre la ultraestructura celular, pero en la última década, el desarrollo de los microscopios electrónicos de barrido (SEM) modernos ha cambiado la forma de mirar dentro de las células. A pesar de que la resolución de TEM es superior cuando se necesitan detalles estructurales a nivel de proteína, la resolución SEM es suficiente para la mayoría de las preguntas relacionadas con la biología celular a nivel de orgánulos. El avance en la tecnología permitió soluciones automáticas de adquisición de volumen, como la imagen de cara de bloque serie (SBF-SEM) y el haz de iones enfocado SEM (FIB-SEM). Sin embargo, hasta el día de hoy, estos métodos siguen siendo ineficientes cuando la identificación y navegación a áreas de interés son cruciales. Sin los medios para la localización precisa de las áreas objetivo antes de la obtención de imágenes, los operadores necesitan adquirir muchos más datos de los que necesitan (en SBF-SEM) o, lo que es peor, preparar muchas cuadrículas e imaginarlas todas (en TEM). Proponemos la estrategia de "cribado lateral" mediante Tomografía Array en SEM, que facilita la localización de áreas de interés, seguida de imágenes automatizadas de la fracción relevante del volumen total de la muestra. Las muestras de tomografía de matriz se conservan durante la obtención de imágenes y se pueden organizar en bibliotecas de secciones listas para imágenes repetidas. Se muestran varios ejemplos en los que el cribado lateral nos permite analizar detalles estructurales a los que es increíblemente difícil acceder con cualquier otro método.

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Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Describimos la preparación de cintas de secciones seriadas y su recolección en soporte de transferencia grande para su uso como muestras de tomografía de matriz, junto con procedimientos de imágenes automatizados en un microscopio electrónico de barrido. El protocolo permite la detección, la recuperación y la obtención de imágenes dirigidas de eventos locales y raros, y la adquisición de grandes volúmenes de datos.

Flujo de trabajo de tomografía de matriz para la adquisición dirigida de información de volumen mediante microscopía electrónica de barrido

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

El análisis de microscopía electrónica es a menudo complejo. Creemos que nuestro protocolo facilita el procesamiento y la adquisición de los datos EM de la gran superficie de muestra y el volumen intermedio. Nuestro protocolo ayuda a encontrar estructuras objetivo en secciones en serie.El registro de datos se limita a lo necesario. En comparación con la adquisición de datos en bloques de tejido entero, el tiempo de registro se reduce y el análisis de datos es más fácil. Dada la facilidad general del enfoque, creemos que se puede utilizar para abordar no solo cuestiones científicas, sino también como herramienta de diagnóstico.Para generar una matriz para el análisis, primero sujete la muestra en un soporte de ultramicrotomo y use una cuchilla de afeitar para recortar aproximadamente la resina alrededor de la muestra. Use una herramienta de recorte de diamante para recortar la muestra y use cuchillos de recorte de inclinación de 20 o 90 grados para asegurarse de que las superficies superior e inferior del bloque sean paralelas al filo de corte del cuchillo. Mezcle xileno y pegamento en una proporción de 3: 1 y use una pestaña unida a un palillo de dientes para aplicar la mezcla en los bordes superior e inferior del bloque recortado.Mientras la mezcla se está secando, use una herramienta de escisión de obleas para cortar un trozo de oblea al tamaño apropiado para el análisis. Limpie la oblea en agua destilada para enjuagar cualquier residuo y limpie la superficie con plasma después de que la oblea esté seca. Para preparar un cuchillo de tomografía de matriz, use cinta adhesiva espumosa para unir una aguja al fondo de un cuchillo jumbo histo y coloque el cuchillo en el soporte de ultra microtomo a cero grados.Ajuste el borde de la cuchilla paralela a la superficie del bloque y lleve el bloque recortado al borde de la cuchilla en una posición lista para la sección. Coloque la oblea limpia en el recipiente del cuchillo y llene el recipiente con agua al mismo nivel que el filo del cuchillo, luego, deje que el borde de diamante del cuchillo se humidifique correctamente, usando la jeringa adjunta para agregar o extraer agua según sea necesario. Para la seccionamiento de la matriz, configure el microtomo en un rango de corte de 50 a 100 nanómetros y una velocidad de corte de 6 a 1 milímetros por segundo, y comience la sección para obtener una cinta lo suficientemente larga como para cubrir un volumen Z objetivo.Dependiendo del tamaño del bloque, la homogeneidad del tejido y el tipo de resina, la cinta será aproximadamente recta. Use una punta limpia y no pegajosa de una pestaña para separar las cintas del filo del cuchillo. Use la pestaña para mover suavemente la cinta hacia el centro del medio de soporte.Se puede usar cloroformo o una pluma calefactora para estirar la sección si es necesario. Después del estiramiento, retraiga la jeringa para comenzar a drenar el agua. Para cintas más delicadas, o una retracción de agua más lenta, separe la jeringa de la manguera para dejar que el agua gotee.Cuando el nivel del agua alcance el nivel de la oblea, empuje suavemente la cinta hacia el centro de la cuenca y continúe drenando hasta que toda el agua restante se elimine por completo de la cuenca. Deje que la oblea se seque en un ambiente limpio. El secado dura aproximadamente 30 minutos.Cuando la muestra esté completamente seca, transfiera la matriz a una caja bien cerrada para protegerla de la contaminación por suciedad. Y coloque la caja en un horno de 60 grados centígrados durante al menos 30 minutos. Para adquirir un mapa general de imágenes SEM que revele las ubicaciones de las secciones en la oblea, use la cámara óptica incorporada para adquirir una imagen SEM que cubra una cinta de secciones.Para crear un mosaico, haga clic y arrastre la imagen de la cámara de la muestra e inicie la adquisición automática. Adquiera descripciones generales a mayor resolución para encontrar estructuras objetivo. Si solo es necesario crear imágenes de unas pocas secciones, utilice el visor con zoom para ver las imágenes adquiridas en sus ubicaciones originales.Una vez que se haya identificado una sección que debe visualizarse en alta resolución, haga clic y arrastre para crear una región de imágenes, luego seleccione Configuración de imágenes de alta resolución y almacene la configuración en una plantilla Para encontrar eventos raros particularmente pequeños o difíciles de detectar, use la configuración de imágenes de alta resolución en cada 10ª sección o en una sección por cinta para crear manualmente una región de imágenes y adquirir las imágenes. A continuación, revise las imágenes y marque las secciones que contienen la región de interés. Para adquirir más de 10 secciones consecutivas, utilice el buscador de secciones para localizar todas las secciones automáticamente.Si las imágenes de vista general no muestran regiones claras de interés, adquiera imágenes de mayor resolución de las secciones y utilice la función de vista previa de secciones para crear y adquirir las imágenes automáticamente. Para determinar la configuración óptima de la imagen, active la imagen en vivo en el software de control del microscopio y navegue a una región de interés, luego ajuste la configuración de la imagen hasta que las imágenes muestren regiones claras de interés, pero sin una adquisición de imagen excesivamente larga, de acuerdo con las pautas del fabricante. Para optimizar el posicionamiento de las regiones de imagen en secciones consecutivas, haga zoom a la imagen de interés y haga clic en Iniciar refinamiento de posición para aumentar la precisión de las ubicaciones de sección registradas.Para definir una región de imagen, haga clic y arrastre en cualquier sección mientras mantiene presionada la tecla Alt y seleccione Crear matriz de conjunto de mosaicos en el menú contextual emergente. El software creará regiones de imágenes en la misma ubicación relativa en todas las secciones que se han encontrado o marcado previamente. A continuación, configure el recuento de píxeles, el tamaño de píxel, el diseño de mosaico y el tiempo de permanencia de píxeles en cada serie de imágenes según sea necesario.Para configurar la función automática, cree una serie de imágenes independiente para las funciones automáticas, como se ha demostrado, y mueva la serie de imágenes a una posición en la sección que contenga estructuras de alto contraste. Establezca la serie de imágenes en 1024 x 884 píxeles y seleccione un tamaño de píxel correspondiente a la resolución más alta utilizada en la serie de imágenes. En la lista de funciones automáticas, marque Enfoque automático y Estigmatizador automático.Seleccione Bisección en los controles de secuencia de adquisición y confirme que la imagen de la función automática es el primer elemento de la lista y, a continuación, haga clic en Adquirir todo para iniciar la adquisición de imágenes. Cuando se hayan creado y configurado todas las series de imágenes, las series se enumerarán en una cola de trabajos. La adquisición de baja resolución se puede realizar de forma manual o automática directamente en partes seleccionadas de la sección o en una sección completa utilizando imágenes individuales o en mosaico, seguidas de costuras.Las imágenes del área seleccionada se pueden adquirir utilizando parámetros de alta resolución para visualizar mitocondrias, núcleos y microvellosidades, por ejemplo, Después de que se haya seleccionado la adquisición automática de mapas de mosaico resueltos, se pueden recortar varias regiones de interés o usarse para definir áreas de imágenes locales adicionales dentro de las regiones. Aunque diferentes tipos de células especializadas en el intestino de Drosophila se distribuyen al azar, se pueden distinguir visualmente después de examinar las imágenes utilizando parámetros de alta resolución, ya sea de secciones individuales o como una colección de imágenes en serie. Después de la alineación, las pilas se pueden renderizar utilizando diferentes soluciones de software.El análisis de tomografía de matriz permite generar muchas secciones secuenciales en una sola oblea y examinarse utilizando parámetros de baja resolución para localizar las áreas generales de interés. Estas áreas pueden ser objeto de análisis posteriores utilizando parámetros de adquisición avanzados. Por ejemplo, las divisiones mitóticas en el notum no son fáciles de localizar en el nivel ultraestructural, ya que las células son relativamente grandes en comparación con la zona de abscisión.Sin embargo, utilizando este método, las imágenes automáticas de visión general de resolución media de los saltos de 20 a 40 secciones se pueden usar para localizar las células en división. El procedimiento de tomografía de matriz proporciona un análisis de datos de microscopía electrónica más sencillo. Alentamos a los espectadores a invertir en dominar la regeneración y familiarizarse con el flujo de trabajo relacionado con los mapas En nuestra experiencia, pocos temas de investigación requieren el análisis ultraestructural de animales enteros u órganos completos.Nuestro método ayuda con la localización rápida de las células y sus socios de interacción en los tejidos.

Research

JoVE Journal

Biology

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Un método estandarizado para el análisis de las células del hígado sinusoidal endoteliales y sus Fenestraciones por Microscopía Electrónica de Barrido

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Investigación

Biología

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

El estudio de la Organización Supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-Freeze por Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Escaneado de Protocolos de Microscopía Electrónica (SEM) para la Problemática de la planta, Oomycete, y muestras de hongos

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso Electrónica de Transmisión de Positrones

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

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Investigar los efectos perjudiciales de baja presión Plasma esterilización sobre la supervivencia de vivir el Bacillus subtilis esporas usando el celular microscopia

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Preparación de los organismos procarióticos y eucarióticos con secado químico para análisis morfológico en microscopía electrónica de barrido (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

Estudios dirigidos mediante la cara de bloque serie y la microscopía electrónica de escaneo de haz de iones enfocado

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Microscopía Electrónica De Barrido Bloque-Cara Serial (SBF-SEM) De Muestras De Tejido Biológico

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...