Name: array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Vi vill tacka medlemmarna i EM-anläggningen vid universitetet i Lausanne för deras stöd under denna utveckling av olika steg i AT-förfarandet. Vi vill tacka Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O'Brien och Lindsay Lewellyn för diskussioner under utarbetandet av manuskriptet och kritisk läsning. Vi vill uppmärksamma de grupper som bidrog med de prover som användes för att demonstrera de olika scenarierna: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat och Fanny Langlet.

EXEMPELberedningsmetoder beskrivs någon annanstans14,30,31och omfattas inte av denna publikation. Kort sagt, exemplen som visades var kemiskt fixerade med glutaraldehyd, post-fixed med 1% OsO4, sedan behandlas med 1% vattenhaltigt uranylacetat innan inbäddning i inbäddningshartset. Alternativt kan prover beredas med högtrycksfrysning, frysa ersätts med 0,1% uranylacetat i aceton och bäddas in i akrylharts. Provblocken utarbetades med hjälp av en platt inbäddningsmetod som möjliggör en tydlig bild av provet, vilket underlättar dess orientering för sektioneringen (figur 1B).
1. Förfarande för matrisgenerering
<ol><li>Inbäddad provorientering och trimning<ol>
<li>Använd kikaren/mikroskopet och identifiera och markera avkastningen på den inbäddade blockytan genom att lätt repa blockets yta med ett rakblad. Detta hjälper till att orientera provet inuti ultramicrotomen och minskar sektionsytan.</li>
		<li>Kläm fast provet på ultramicrotomhållaren(figur 2A).</li>
		<li>Trimma hartset runt provet, först med rakbladet (grov trimning) och fortsätt med diamanttrimmeringsverktyget (fin trimning; Figur 2A). Använd knivar med 20° eller 90° kantlutning för att säkerställa att blockets övre och nedre ytor är parallella med knivens skäregg. OBS: Det här steget är avgörande för seriell avsnitting och förvärv av raka band.</li>
		<li>Blanda xylen och limma i 3:1 proportion. Applicera denna blandning på toppen och bottenkanterna på det trimmade blocket med en ögonfrans fäst vid en tandpetare. Låt det torka ordentligt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered matrismonteringsstödet A (dvs. kiselplattor).<ol>
<li>Skär waferbiten med hjälp av ett waferklyvningsverktyg (EMS) och justera dess storlek till projektmålet. 2 cm x 4 cm är bekvämt för både ljus- och elektronmikroskopiobservationer.</li>
		<li>Rengör skivan i destillerat vatten för att bli av med skräpet.</li>
		<li>Glödurladdning/plasma rengör ytan med hjälp av standardutrustning. De exakta parametrarna beror på vilken maskin som används. Börja med parametrarna för rutnätens urladdning och justera tiden empiriskt. Detta steg är avgörande för en god spridning av sektionerna på stödet medan sektioner torkar och bör inte utelämnas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered matrisernas monteringsstöd B (dvs. glasskydd)<ol>
<li>Om du planerar multiplex immunmärkningsexperiment, överför proverna på ett täckslip för att bättre upptäcka fluorescenssignalen. För att förbättra täckslipslim, använd en detaljerad gelatinbeläggningsprocedur beskrivs tidigare9.</li>
		<li>Öka konduktiviteten genom att belägga bilderna med indium-tennoxid (ITO) eller guld genom avdunstning. Förvara de förberedda täcksläparna i en ren miljö. Glödurladdning av proverna enligt beskrivningen i 1.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Avsnitt av provet
<ol><li>AT-knivberedning OBS: För att generera matriserna, använd en modifierad kniv (ATS), utformad för att underlätta förvärv av långa band. Histo-Jumbo knivar eller liknande knivar utformade för generering av sektionerna på stora stöd kan också tjäna för AT-sektionering.<ol>
<li>Fäst nålen på knivens underkant med den skummande tejpen och genomborra den (figur 2B). Placera ATS-kniven i ultramicrotomhållaren vid 0°. Justera knivens kant parallellt med blockytan med hjälp av standardproceduren.</li>
		<li>För det trimmade blocket till knivens kant i ett läge som är redo för sektionering.</li>
		<li>Placera skivan/täckslipen inuti knivbassängen och fyll den med vatten till samma nivå som knivkanten. Låt knivens diamantkant fukta ordentligt och vid behov dra ut vatten med den bifogade sprutan(figur 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Matrissektion och överföring<ol>
<li>Ställ in mikrotomen på önskade skärparametrar. Med ATS-kniven är räckvidden 50-100 nm och en skärhastighet på 0,6-1 mm/s tillrådligt. Börja dela upp (bild 2Di).</li>
		<li>Skaffa ett band av längden som täcker en riktad z-volym och stoppa samlingen. Beroende på blockstorlek, homogenitet hos vävnaden och typ av harts kommer bandet att vara relativt rakt (figur 2D-ii). Många prover kommer inte att producera raka band, trots den investerade ansträngningen och typen av kniv används.</li>
		<li>Beroende på det slutliga målet, gör ett långt eller flera korta band justerat sida vid sida. Ett stöd på 2 cm x 4 cm kan bekvämt rymma 100 till 1 000 sektioner. Arrangemanget av bandet på stödsteget är ett steg som kräver fingerfärdighet och stadiga händer. Inlärningskurvan för denna färdighet förvärvas dock snabbt.</li>
		<li>Lossa bandet från knivkanten med en ren, icke-klibbig spets av en ögonfrans limmad på tandpetaren (figur 2Diii).</li>
		<li>Använd ögonfransen och flytta försiktigt bandet ovanför mitten av stödmediet. Använd nu kloroform eller värmepenna för sträckning av sektionerna om det behövs. Kom dock ihåg att denna manipulering kan inducera bandbrytning och deformation.</li>
		<li>Börja tömma vattnet genom att dra sprutan. För mer känsliga band eller en långsammare vattenupprullning, låt vatten droppa genom att lossa sprutan från slangen. När vattennivån sänks till wafer-nivån, kontrollera bandet och flytta det om det behövs genom att försiktigt trycka bandet till mitten. Efter att ha satt banden på waferytan, fortsätt att dränera tills det återstående vattnet är helt indraget från bassängen. OBS: Om du inte använder ats-kniven med bottenvatten, minska försiktigt vattnet från ATS-knivens sidor för att inte framkalla turbulens.</li>
		<li>Låt sektionerna på stödet inuti badet torka helt. Beroende på stödets hydrofobi och luftfuktigheten i miljön kommer vatten att avdunsta i en annan takt (figur 2Div). Det är viktigt att låta provet torka långsamt för att minska eller helt undvika alla veck på provet.</li>
		<li>Överför det torra provet till en tätt sluten låda för att skydda mot smutsförorening och placera den i en ugn på 60 °C i minst 30 minuter. Vid behov motbehåll sektioner med tungmetaller för att förbättra den övergripande kontrasten.</li>
		<li>Rengör försiktigt kniven i slutet av proceduren enligt tillverkarens instruktioner OBS: Överföringen av flera eller seriella sektioner på en skiva(bild 2E) jämfört med överföringen på ett spårnät(bild 2F) förändrar EM-förberedelseupplevelsen helt. Den oavbrutna delningen och insamlingen av avsnitten om enskilt stöd minskar mängden avsnitts- och avsnittssamlingsrelaterade misstag som ofta förekommer i serieavsnitt. Motsvarande 100 sektioner på 1000 μm x 500 μm som samlas in på en skiva motsvarar 33 spårgaller(figur 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Provobservation
I det här avsnittet beskrivs arbetsflödesstegen som implementerade med hjälp av en kommersiellt tillgänglig programvara (se Tabell över material). Alla bildförvärvsprogram på alla SEM-detektorer som är utrustade med rätt detektorer kan användas, men de specifika användaråtgärderna kommer att skilja sig åt och kommer ofta att vara mer manuella.
<ol><li>Skaffa en översiktskarta över SEM-bilder som avslöjar avsnittsplatser på skivan. En inbyggd optisk kamerabild hjälper till att definiera en SEM-bildmosaik som täcker ett band av sektioner eller alla sektioner. Skapa mosaiken genom att klicka-dra med musen direkt på kamerabilden av exemplet och starta automatisk anskaffning. OBS: Mycket grova bildinställningar, dvs. 1-2 μm pixelstorlek och 1 μs uppehållstid räcker. Denna process illustreras i Kompletterande material (sidorna 2-7).</li>
	<li>Leta reda på avsnitt med funktionen Automatisk identifiering av avsnittssökare eller hitta dem manuellt. Avsnittspositioner och konturer hämtas automatiskt med den här programvaran baserat på bildmatchning. För illustration av denna process, se Kompletterande material (sidorna 8 - 15).</li>
	<li>Om översiktsbilderna inte visar ROI tydligt, skaffa bilder av avsnitt med högre upplösning. Använd funktionen Förhandsgranskning av avsnitt för att skapa och hämta bilder automatiskt. Denna process illustreras i Kompletterande material, sidorna 16-18. Bildinställningar måste väljas beroende på typen och storleken på den ROI som användaren söker efter.<ol>
<li>Om du vill hitta optimala inställningar aktiverar du Live Imaging i mikroskopstyrningsprogramvaran och navigerar till en ROI. Ändra bildinställningarna tills bilderna visar ROIs tydligt, men bildförvärvet är inte överdrivet långt.</li>
	</ol></li>
	<li>Definiera bildområden OBS: Flera olika strategier föreslås.<ol>
<li>Om bara ett fåtal avsnitt behöver avbildas använder du bilderna av avsnitt som hittills har skapats för att navigera till relevanta avsnitt och använd zoombar visning som visar alla förvärvade bilder på sina ursprungliga relativa platser för att titta på alla avsnitt. När ett avsnitt har hittats som ska avbildas med hög upplösning skapar du ett bildområde med klickdrag. Välj högupplösta bildinställningar och lagra inställningarna i en mall. Återanvänd den här mallen för ytterligare avsnitt.</li>
		<li>Använd metoden lateral screening för att hitta särskilt små eller svåra att upptäcka sällsynta händelser. Skapa en bildområde manuellt med högupplösta bildinställningar i vart tionde avsnitt eller på ett avsnitt per menyfliksområde och hämta bilderna. Granska bilderna och markera avsnitt som innehåller ROI i programvaran eller anteckna.<ol>
<li>Börja från avsnitt som innehåller avkastningen, navigera framåt och bakåt genom avsnittsuppsättningen och skapa högupplösta bildområden på samma relativa platser så länge strukturen fortfarande är synlig i avsnittet. Detta kan göras manuellt eller genom att använda proceduren som beskrivs i nästa steg.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hämta bilder i mer än tio på varandra följande avsnitt. Klicka på Starta position förfining efter att du har zoomat bilden om du vill öka precisionen för registrerade avsnittsplatser enligt beskrivningen i handboken. Om du gör det minskar bildseriens positionsvariation. Förfarandet illustreras och förklaras i kompletterande materialsidorna 19-21.</li>
		<li>Klicka på ett avsnitt om du vill definiera ett bildområde medan du håller ned Alt-tangenten och väljer Skapa paneluppsättningsmatris på snabbmenyn som öppnas när musknappen släpps. Programvaran skapar sedan bildområden på samma relativa plats i alla avsnitt som har hittats eller markerats tidigare. Det är möjligt att begränsa avbildningen till ett visst område med skjutreglaget Section Span. OBS: Den här proceduren kan upprepas med valfritt antal bildområden och gör det därför möjligt att spela in många små högupplösta bilder i stället för att spela in en enda större bild på varje avsnitt.</li>
		<li>När du har skapat pixelantalet, pixelstorleken, plattsättningslayouten, pixelboendetiden osv. i varje bildserie efter behov. När bildserien har skapats och konfigurerats visas alla i en jobbkö.</li>
	</ol></li>
	<li>Konfigurera automatiska funktioner och starta bildförvärv<ol>
<li>Skapa en separat bildserie för automatiska funktioner med samma metod som beskrivs i föregående steg. Flytta bildserien till en position i avsnittet som innehåller strukturer med hög kontrast.</li>
		<li>Ställ in bildserien på 1 024 x 884 pixlar och välj en pixelstorlek som motsvarar den högsta upplösningen som används i bildserien som ställts in i föregående steg. I listan över automatiska funktioner kontrollerar du AutoFokus och Auto Stigmator.</li>
		<li>Välj Efter avsnitt i kontroller av anskaffningssekvensen och kontrollera att bilden av automatiska funktioner är det första objektet i listan. Starta bildförvärvet genom att klicka på knappen Kör bredvid jobbreferensen. Dessa procedurer illustreras i kompletterande material, sidorna 22-23. OBS: Det är inte nödvändigt att manuellt förfokusera på varje avsnitt. Under inspelningssessionen, när mikroskopet går vidare till ett nytt avsnitt, kommer de automatiska funktionerna att utföras innan alla andra bilder spelas in i det här avsnittet.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Anpassning och analys av data
<ol><li>Dataexport<ol>
<li>Se till att data sparas i .tif format, så att det inte finns något behov av en dedikerad exportfunktion. Sortera data i en mappstruktur som motsvarar lagren och elementen i lagerträdet.</li>
		<li>När bildmosaik har spelats in använder du StitchAll-funktionen för att automatiskt sy alla brickor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stackjustering och beskärning i Fiji NOT. Många programvarupaket (gratis och kommersiella) kan användas för att arbeta med Array Tomography-data. Stegen nedan visas med open source-programmet Fiji32 eftersom det är allmänt tillgängligt och innehåller alla nödvändiga funktioner.<ol>
<li>Importera en hög med bilder (eller sydda bilder) till Fiji som en virtuell stack.</li>
		<li>Om kontrast/ljusstyrka behöver normaliseras väljer du Förbättrad kontrast... från Process-menyn. Ange mättade pixlar till 0,1 eller mindre och markera Bearbeta alla segment.</li>
		<li>Välj Registrering | på plugin-menyn Linjär stackjustering med SIFT.</li>
		<li>Välj Rigid eller Affine på den nedrullningsbar menyn Förväntad omvandling. Annars behåller du standardinställningarna. Starta justeringen genom att klicka på OK. OBS: Genom att läsa in data som virtuell stack kan Fiji hantera stackar av alla storlekar. Justeringens utdata skapas i RAM- minne. Detta kan dock begränsa den maximala storleken på staplar som kan bearbetas. I så fall använder du Register Virtual Stack Slices, som är en mapp-till-mapp-implementering av samma registreringsalgoritm. När registreringen är klar läser du in utdata som en virtuell stack.</li>
		<li>Beskär bildstacken genom att klicka på Beskär så att den bara innehåller avkastningen.</li>
		<li>Spara stapeln som en enda .tif bild eller serie .tif bilder. Obs: Kritiska steg i matristomografi visas i bild 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Luckner, M., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+light+microscopy+to+analytical+scanning+electron+microscopy+(SEM)+and+focused+ion+beam+(FIB)/SEM+in+biology:+Fixed+coordinates,+flat+embedding,+absolute+references.">From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+electron+microscopy+volume+of+the+brain+of+adult+Drosophila+melanogaster.">A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster.</a> Cell. 174 (3), 730-743 (2018).</li><li>Mulcahy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+volume+electron+microscopy+of+the+caenorhabditis+elegans+nervous+system.">A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system.</a> Frontiers in Neural Circuits. 12, 94 (2018).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+molecules+and+cells.">Electron tomography of molecules and cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).</li><li>Hoog, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+interphase+microtubules+in+fission+yeast+analyzed+by+electron+tomography.">Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography.</a> Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).</li><li>Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+studies+of+eukaryotic+cells+by+cryo-electron+tomography.">Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography.</a> Cells. 8 (1), 57 (2019).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+(S3EM)+on+silicon+wafers+for+ultra-structural+volume+imaging+of+cells+and+tissues.">Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues.</a> PLoS One. 7 (4), 35172 (2012).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).</li><li>Kubota, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+nanotube+tape+for+serial-section+electron+microscopy+of+brain+ultrastructure.">A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure.</a> Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).</li><li>Wacker, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+Hierarchical+Imaging+of+Serial+Sections+for+Finding+Specific+Cellular+Targets+within+Large+Volumes.">Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57059 (2018).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Templier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MagC,+magnetic+collection+of+ultrathin+sections+for+volumetric+correlative+light+and+electron+microscopy.">MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy.</a> Elife. 8, 45696 (2019).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).</li><li>Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+EM-based+reconstruction+of+the+interglomerular+projectome+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).</li><li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology:+Applications+and+technology.">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).</li><li>Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIB-SEM+tomography+in+biology.">FIB-SEM tomography in biology.</a> Methods in Molecular Biology. 1117, 541-558 (2014).</li><li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging.">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, 25916 (2017).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+cluster+ion+beam+SEM+for+imaging+of+large+tissue+samples+with+10+nm+isotropic+resolution.">Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution.</a> Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).</li><li>Maco, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+in+vivo+2+photon+and+focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+of+cortical+neurons.">Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons.</a> PLoS One. 8 (2), 57405 (2013).</li><li>Russell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+microscopes:+3D+correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+of+complex+biological+structures.">Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures.</a> Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).</li><li>Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+for+observing+the+three-dimensional+ultrastructure+of+membranous+cell+organelles+in+relation+to+their+molecular+components.">Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).</li><li>Peddie, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+and+integrated+light+and+electron+microscopy+of+in-resin+GFP+fluorescence,+used+to+localise+diacylglycerol+in+mammalian+cells.">Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).</li><li>Markert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+subcellular+localization+with+superresolution+array+tomography+on+ultrathin+sections+of+various+species.">3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species.</a> Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).</li><li>Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+precise+and+rapid+mapping+protocol+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+small+invertebrate+organisms.">A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms.</a> Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).</li><li>Kolotuev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+correlative+anatomy+of+invertebrate+model+organisms+increases+efficiency+of+TEM+data+production.">Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).</li><li>Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+acetylcholine+signaling+through+a+muscarinic+receptor+regulates+cell+migration.">Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster.">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li><li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis.">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+asymmetric+stem+cell+division.">Mechanisms of asymmetric stem cell division.</a> Cell. 132 (4), 583-597 (2008).</li><li>Daniel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+septate+junctions+assembly+and+completion+of+cytokinesis+in+proliferative+epithelial+tissues.">Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues.</a> Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).</li><li>Pasquettaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peculiar+protrusions+along+tanycyte+processes+face+diverse+neural+and+non-neural+cell+types+in+the+hypothalamic+parenchyma.">Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2020).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+image+browser:+A+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets.">Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li></ol>

Författaren Tilman Franke är anställd av Thermo Fisher som tillverkar elektronmikroskop och pilotprogram som används i artikeln.

Elektronmikroskopi ger insikt i cellernas och organismernas ultrastruktur, för vilken det ofta är önskvärt att avbilda strukturer av intresse i deras 3-dimensionella sammanhang. Trots många EM-taktiker för ultrastrukturell analys finns det fortfarande ingen "guldstandard" lösning. Den främsta orsaken är det stora utbudet av prover, många biologiska frågor, som ofta kräver ett skräddarsytt tillvägagångssätt. Det föreslagna AT-arbetsflödet är utformat för att minimera den tid som krävs för prov bearbetning, datainsamling, utvärdering och lagring. Dessutom ger den modifierade kniven ett användbart verktyg för att förenkla matrisförvärv. Den kompakta layouten av sektioner på plattor är bekväm, både för observation och efterföljande lagring av proverna. Detta arrangemang möjliggör "lateral screening" av prover genom att horisontellt flytta från band till band och skanna endast ett avsnitt på varje, vilket avsevärt minskar den tid som krävs för att lokalisera en ROI. Föreslagna scenarier för datainsamling underlättar inriktningen av små och slumpmässigt fördelade områden. När AT/SEM väl har hittats begränsar den högupplösta avbildningen exakt till den mängd av intresse som utförs manuellt eller med hjälp av automatisk funktion. AT för begränsade volymer kan slutföras manuellt, där operatören navigerar genom provet och definierar bildområden en efter en. Den automatiserade modulen i programvaran ger en flexibel bildförvärvsstrategi för avbildning av små områden på stora sektioner. Automatiseringen i denna programvara gör det möjligt att spela in stora högupplösta bilder på hundratals sektioner, vilket uppnår liknande volymer som SBFI. Att spela in översiktsbilder av alla avsnitt förenklar ROI-lokaliseringen och minskar tiden vid mikroskopet. Eftersom avsnitten inte skadas under inspelningen av översikter och förhandsversionen med högre upplösning tillåter AT/SEM återanvändning av provet för att samla in ytterligare data från andra ROM-produkter eller med högre upplösning.
Bildförvärvstid är en av de viktigaste (och dyraste) aspekterna av 3D EM och bör därför beaktas i experimentdesignen. Även om det inte är förvånande att avbildning av stora områden tar längre tid än att avbilda små områden, är det lätt att underskatta effekten: Beroende på vilka bildparametrar som valts kan förvärvstiden för varje avsnitt variera från sekunder till timmar. Kritiska bildparametrar inkluderar storleken på synfältet, upplösningen och uppehållstiden. Om man antar en målupplösning på 10nm per pixel och 1 μs uppehållstid, tar det 4 sekunder, 100 sekunder eller 2 500 μm att registrera ett fält på 20 μm x 20 μm, 100 μm x 100 μm eller 2 500 s. Vi kan multiplicera dessa bildtider per avsnitt med antalet avsnitt för att uppskatta den tid som krävs för hela bildjobbet. Långa bildtider per avsnitt kan vara acceptabla om antalet sektioner är litet eller om mikroskopverktygstiden inte är något problem.
Det är dock nödvändigt att begränsa inspelningstiden till ett nattjobb eller ett helgjobb i de flesta fall. En lika kritisk aspekt av 3D EM som bör beaktas är mängden och strukturen för de resulterande bilddata. Om du registrerar ovannämnda bildfält i 100 avsnitt genereras 400 mb, 10 gb respektive 250 gb bilddata. Bilderna på 500 μm x 500 μm utgör det ytterligare problemet med att vara större än 2 gb vardera. Många av de program som används för datautvärdering kan inte öppna bilder av denna storlek.
För att minska bildtiden är det viktigt att välja pixel uppehållstid för att uppfylla kraven på signal-till-brus-förhållande för efterföljande datautvärdering (t.ex. rekonstruktion, spårning) och begränsa inspelningarna till definierade ROI. AT-förlängningen av programvaran underlättar bildförvärv i små områden i seriella sektioner. Programvaran stöder manuella och automatiska arbetsflöden och många halvautomatiska varianter: bildområden kan placeras manuellt och fokuseras på varje avsnitt, eller användaren kan använda den automatiska sektionssökaren och positionsjusteringsfunktionerna. Beroende på vilken automatiseringsnivå som valts och stöds av exempeltypen eller bild avbildningsmålen kan den tid som krävs för att konfigurera bildförvärv i hundratals avsnitt ta en hel arbetsdag (görs manuellt) eller bara några minuter. I princip gör Array Tomography det mer utmanande än andra 3D EM-metoder att förvärva små ROIs; oprecis regionplacering på på varandra följande avsnitt måste kompenseras genom förvärv av större arealer. Om avkastningen till exempel är 20 μm x 20 μm i storlek och sektion-till-sektion-positionsvariationen för bildfält är 10 μm, måste man skaffa 40 μm x 40 μm bilder för att vara säker på att ROI är helt fångad i varje bild, på varje avsnitt. Den verkliga bildpositionsvariationen varierar från 100 μm till <10 μm beroende på tillgängligheten eller kvaliteten på programvarufunktioner för positionsjustering eller användarens tålamod. Med denna programvara kan 10 μm uppnås utan för mycket manuell intervention i de flesta prover.
Liksom alla tekniker har AT flera svaga punkter som kan påverka framgångsrikt datainsamling, och många liknar andra sektionsbaserade metoder. Brist på homogen fördelning av tomt harts kontra vävnad kan resultera i böjda eller trasiga matriser. I extrema fall kan sektioner lossna från stödet (figur 6A). Variabel komprimering eller sträckning under skärprocessen kan skapa veck som kan störa provet i variabla områden på efterföljande sektioner (bild 6B). Knivmärken kan förekomma på ytan av de insamlade sektionerna med en skadad kniv (figur 6C). Skillnader i sektionsförhållanden kan inducera tillfälliga sektionskomprimerings- och tjockleksskillnader. Damm- eller smutspartiklar kan landa på en sektion och delvis skymma intressezonen(figur 6D). Bildförvärv kan misslyckas på grund av ofullständiga funktioner för automatisk kontrast, autofokus och auto-stigmator. Placeringen av automatiskt skapade bildområden kan vara variabel och kan misslyckas med att fånga avkastningen i alla avsnitt.
Flera problem kan uppstå vid söm- och inriktningsstadiet. Den automatiska sömmen av mosaikplattor förvärv kan misslyckas, till exempel på grund av det stora tomma utrymmet inuti provet. På grund av en drastisk förändring i form i 3D kan bildstackar vara utmanande att registrera sig. Specialutvecklade program (t.ex. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB eller MAPS-AT) kan underlätta halvautomatisk inriktning32,38,39,40. Mer utmanande avsnitt kan justeras manuellt med hjälp av fotoredigeringsprogram. Tyvärr kan vissa data uppsättningar vara omöjliga att justera korrekt.
Stora prover är utmanande för TEM-seriella sektioner som monteras på rutnät. Å andra sidan motiverar många projekt inte ett långt automatiskt förvärv med FIB/SEM eller SBF-SEM. AT är ett enkelt alternativ till en tråkig seriesektion TEM där insamling och manipulering av seriella sektioner på en wafer är enklare än med slitsrutnäten. Flera strategier utvecklades för att underlätta insamlingen av matriserna, och vi delar vår metod för att utöka den befintliga verktygslådan. I de fall där identifieringen av roi är utmanande ger AT-SEM en grundläggande fördel, med effektiv screening av proverna där organellskalans upplösning krävs över 50 till 500 sektioner. För större volymer kan de automatiska insamlings-AT-strategierna samlas in effektivt om fler avsnitt krävs. AT-prover kan avbildas flera gånger, vilket underlättar riktad avbildning av högupplösta områden baserat på tidigare förvärvade översiktsbilder. Vi tror att den riktade analysen och den minskade översamplingen av AT/SEM som föreslås här minskar arbets- och datalagringskraven. I slutändan kan bibliotek med sektioner samlas in och underhållas för senare återanvändning och samråd. För volymförvärv erbjuder FIB- eller SBF-SEM-metoder en utmärkt lösning när avkastningen är lätt att identifiera på blockytan eller om stora 3D-volymer behövs för analysen. FIB/SBF-SEM är dock mindre effektiva när den högupplösta stackbilden måste samlas in från en definierad ROI på ett riktat sätt. Sammanfattningsvis gör de föreslagna metoderna för screening av AT-prover och användningen av bilder med medelupplösningsöversikt det möjligt att begränsa bildförvärvet till de relevanta delarna av avsnittsmatrisen. Exakt mål för bildregioner påskyndar tid till data och förenklar datautvärderingen.
Sammanfattningsvis, även om begreppet AT/SEM inte är nytt, är dess användning fortfarande inte så utbredd som dess fördelar skulle antyda. På det hela taget ger det ett kompletterande förfarande till andra befintliga EM-metoder. AT/SEM är kompatibel med det bredaste utbudet av provberedningsprotokoll och bildarbetsflöden och kan göras på alla FIB/SEM- eller SBF-SEM-mikroskop som en medföljande teknik. I det här dokumentet har vi koncentrerat oss på AT för att registrera strukturella data från prover som är mindre benägna att hanteras framgångsrikt med andra metoder. Vi hoppas att det beskrivna förfarandet för bekväm insamling av sektioner och avsevärt automatiserade förvärvsstrategier kommer att hjälpa till i de första försöken för dem som aldrig har stött på metoden och kommer att bidra till att fullända den för dem som redan har viss erfarenhet.

Trots vikten av EM-relaterade tekniker håller den ansträngning som krävs för att behärska dem hela fältet begränsat till ett litet antal specialister. En betydande svårighet är identifieringen och hämtningen av en intresseregion (ROI) i de prover som bevarats för EM. Utseendet på samma prov skiljer sig avsevärt när det analyseras av optisk mikroskopi och efter bearbetning för EM-observation. Ändringarna för kemiskt förberedda prover inkluderar anisotropa provkrympning efter uttorkningsstegen (~ 10% i varje dimension) och förlust av fluorescens vid användning av osmium i fixerings- och färgningsprotokollet(figur 1A). För ultrathinsektionen är proverna inbäddade i epoxi- eller akrylhartser med olika strategier (figur 1B). För att detta preparat ska lyckas skall hela provet fraktioneras i bitar som inte överstiger 1 mm x 1 mm. För att uppfylla standardkraven för transmissionselektronmikroskopi (TEM) är denna lilla del av provet ytterligare sektionerad till 50-150 nm tjocka skivor. De resulterande gråskalebilderna visar vävnadsorganisation och organellstruktur på en minut bråkdel av hela provet mer detaljerat än någon annan mikroskopiteknik (figur 1C). En typisk TEM-datauppsättning ger 2D-information, teoretiskt extrapolerad för att förstå de processer som förekommer naturligt i ett 3D-utrymme i celler och vävnader. Figur 1D innebär utmaningen med förvärvet av strukturella volymer: om en kub på sidan 1 000 μm är sektionerad vid 50 nm tjocklek krävs 20 000 sektioner för att täcka hela volymen; för en 500 μm sidokuk blir det 10 000 sektioner. För att täcka en volym på 50 μm x 50 μm x 50 μm kan 1 000 sektioner "endast" vara nödvändiga. Att få denna volym manuellt är praktiskt taget omöjligt och extremt utmanande att utföra med automatisering. Om vi, förutom provdjup, behöver täcka hela ytan av sådana hypotetiska kuber, blir täckningen av 1 μm2 yta vid rimlig upplösning ett allvarligt logistiskt problem (figur 1E). Även om det stora antalet avsnitt är avgörande för de extraordinära storskaliga projekten, såsom anslutningsmetoder, är det avgörande för de flesta av de "vardagliga" EM-projekten, vilket innebär en betydande nackdel att generera fler avsnitt som krävs för observationen.
Det finns flera metoder för att förvärva 3D-ultrastrukturell information: seriell sektion transmission elektronmikroskopi (TEM), TEM-tomografi, Array Tomography (AT), Serial Block Face Imaging Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) och Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM). De viktigaste skillnaderna mellan dessa metoder är sektionsstrategin och om bildförvärvet är kopplat till avsnittsgeneration1. I seriell avsnitt TEM samlas sekventiella sektioner in på kortplatsrutnät, TEM-bilder genereras från dessa sekvenser och justeras2,3,4,5. I TEM-tomografi ger tiltserier från 150-300 nm sektioner på ett rutnät, och när de är kopplade till seriell sektionering, en mycket hög upplösning, men relativt små volymer6,7,8. AT-metoden använder fysisk sektion med olika manuella och halvautomatiska sätt för sektionsuppsamling på relativt stort stöd, till exempel glasöverdrag, kiselplattor eller ett speciellt tejp. För bildförvärv analyseras stödet i SEM, med olika bildförvärvsstrategier finnstillgängliga 9,10,11,12,13,14,15 . För SBF-SEM uppnås fysisk sektion med hjälp av en minimikrotom med en diamantkniv som är inställd direkt inuti SEM-kammaren, med SEM-bilden genererad från ytan av hartsblocket16,17,18,19. För FIB-SEM avlägsnar jonkällan tunna lager av provet, följt av automatisk avbildning av den exponerade ytan med SEM20,21. TEM-tomografi och AT genererar fysiska sektioner, som kan avbildas om det behövs, medan FSBF-SEM och FIB-SEM eliminerar avsnittet efter avbildning. En ny kombination av fysiska sektioner avbildade av en multi-beam SEM ger en kombination av metoder som löser "flaskhals" frågan om hastigheten på bildförvärv22. Var och en av dessa tekniker har revolutionerat hur EM-data kan erhållas och analyseras, och varje metod har sina praktiska effekter relaterade till en viss forskningsfråga.
Med tanke på preparatets art och de strukturella dimensionernas omfattning är det inte enkelt att förutsäga var en specifik målstruktur finns i provblocket(figur 1D,E). En lösning för ROI-lokaliseringen är att spela in bilderna från hela blocket med önskad upplösning från början. Strukturerna av intresse kan vara i den förvärvade datavolymen när de är borta från mikroskopet. Förvärvstid och datahantering i samband med denna strategi är problematiska. Det är önskvärt att minska mängden registrerade data, särskilt om ROI är mycket mindre än vävnadsblocket, dvs. om föremålen av intresse är specifika typer av celler (inte hela organ). Olika korrelativa ljus- och elektronmikroskopitekniker (CLEM) kan lyckas när fluorescensen bevaras och lokaliseras före eller efter beredningen inom samma prov23,24,25,26,27,28,29. Ändå är många cellulära strukturer igenkännliga även utan fluorescenskorrelation, endast baserat på den kända ultrastrukturen. För dessa fall tror vi att lateral screening Array Tomography ger en balans kompromiss mellan den ansträngning som investeras i ROI lokalisering och den strukturella informationskvaliteten. Med hjälp av denna strategi screenas en delmängd av sektionerna på skivan med jämna mellanrum, som kan fastställas baserat på AVKASTNINGEN storlek och natur. När roI har hittats ställs datainsamling in i en kontinuerlig serie avsnitt som börjar före och slutar efter ankarsektionen och samlar in relevant information på ett riktat sätt.
Vi presenterar protokoll för AT som förenklar och påskyndar förvärv av regioner eller händelser av intresse i många avsnitt och ger bättre anpassade bildvolymer. Sidoscreening och multistep-förvärv producerar data med mycket hög upplösning i exakt riktade regioner. Förfarandet vi beskriver tar upp flera utmaningar med 3D EM-datainsamling, eftersom det föreskriver: kompatibilitet med ett brett spektrum av exemplar utan att i grunden ändra arbetsflödet för provberedning; Riktad lokalisering för sektionering och SEM-förvärv. minskad tid och ansträngning under installationen; Bildframställning av regioner i flera sektioner med bättre anpassning av de resulterande volymerna. och en smidig sömnads- och justeringsprocedur för att sammanställa olika bilder till en sydd mosaikbild. Vi valde att visa styrkan i vår metod med flera prover från publicerade och pågående projekt. Vi tror att detta tillvägagångssätt avsevärt kan underlätta generering och förvärv av riktade EM-data, även för utredare med begränsad EM-erfarenhet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AT sectioning knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUATS3530</td>
			<td>Diatome Jumbo knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td>Diatome trimming 20&#176; 
			Glass knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16015</td>
			<td>Resistance: 1-30 Ohms 
			Type P: (Boron) (1 primary flat) 
			Roughness: 2 nm 
			No SiO2 top coating 
			TTV: = &#60;20 &#181;m 
			Wafer is polished on one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer cleaving kit</td>
			<td>EMS</td>
			<td>7642</td>
			<td>EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Thermo Fischer Helios</td>
			<td>1072419</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maps 3 for SEM with Correlative Workflow &#38; Array Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1135932</td>
			<td>Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira x.y</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131599</td>
			<td>Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td>IMOD, MIB (See text for refferences)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy

Elektronmikroskopi används inom biologi och medicin för avbildning av cellulära och strukturella detaljer vid nanometerupplösning. Historiskt sett har Transmission Electron Microscopy (TEM) gett insikt i cellens ultrastruktur, men under det senaste decenniet har utvecklingen av moderna scanningelektronmikroskop (SEM) förändrat sättet att se inuti cellerna. Även om upplösningen av TEM är överlägsen när proteinnivå strukturella detaljer behövs, är SEM-upplösning tillräcklig för majoriteten av organelle-nivå cellbiologi-relaterade frågor. Teknikutvecklingen möjliggjorde automatiska volymförvärvslösningar som Serial block-face imaging (SBF-SEM) och Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Men än i dag är dessa metoder ineffektiva när identifiering och navigering till intressanta områden är avgörande. Utan medel för exakt lokalisering av målområden före avbildning måste operatörerna skaffa mycket mer data än de behöver (i SBF-SEM), eller ännu värre, förbereda många rutnät och avbilda dem alla (i TEM). Vi föreslår strategin för "lateral screening" med arraytomografi i SEM, vilket underlättar lokalisering av intresseområden, följt av automatiserad avbildning av den relevanta delen av den totala provvolymen. Matristomografiprover sparas under avbildningen och kan ordnas i avsnittsbibliotek som är redo för upprepad avbildning. Flera exempel visas där lateral screening gör det möjligt för oss att analysera strukturella detaljer som är otroligt utmanande att komma åt med någon annan metod.

Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Vi beskriver beredningen av band av seriella sektioner och deras samling på stora överföringsstöd för användning som Array Tomography prover, tillsammans med automatiserade bildbehandling förfaranden i en scanning elektronmikroskop. Protokollet tillåter screening, hämtning och riktad avbildning av lokala, sällsynta händelser och förvärv av stora data volymer.

Matristomografiarbetsflöde för riktad förvärv av volyminformation med scanningelektronmikroskopi

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Elektronmikroskopianalys är ofta komplex. Vi tror att vårt protokoll underlättar bearbetning och förvärv av EM-data från den stora provytan och mellanvolymen. Vårt protokoll hjälper till att hitta målstrukturer i seriella avsnitt.Datainspelning är begränsad till vad som är nödvändigt. Jämfört med datainsamling i helvävnadsblock minskar inspelningstiden och dataanalysen enklare. Med tanke på den övergripande lättheten i tillvägagångssättet tror vi att det kan användas för att ta itu med inte bara vetenskapliga frågor utan också som ett diagnostiskt verktyg.För att generera en matris för analys, kläm först provet på en ultramicrotomhållare och använd ett rakblad för att grovt trimma hartset runt provet. Använd ett diamantlistningsverktyg för att finklippa provet och använd trimknivar med 20 eller 90 graders lutning för att säkerställa att blockets övre och nedre ytor är parallella med knivens skäregg. Blanda xylen och limma i en 3:1-proportion och använd en ögonfrans fäst vid en tandpetare för att applicera blandningen på toppen och bottenkanterna på det trimmade blocket.Medan blandningen torkar, använd ett wafer klyvningsverktyg för att skära en bit wafer till lämplig storlek för analysen. Rengör skivan i destillerat vatten för att skölja bort skräp och rengör ytan med plasma efter att skivan är torr. För att förbereda en matristomografikniv, använd skummande tejp för att fästa en nål på botten av en histo jumbokniv och placera kniven i ultramikrotomhållaren vid noll grader.Justera knivens kant parallellt med blockytan och för det trimmade blocket till knivens kant i ett läge redo för sektionering. Placera den rena skivan i knivbassängen och fyll handfatet med vatten till samma nivå som knivkanten och låt sedan knivens diamantkant fukta ordentligt med den bifogade sprutan för att tillsätta eller dra ut vatten vid behov. För matrissektion ställer du in mikrotomen på ett skärområde på 50 till 100 nanometer och en skärhastighet på 6 till 1 millimeter per sekund och börjar dela upp för att få ett band tillräckligt länge för att täcka en riktad Z-volym.Beroende på blockstorleken, homogeniteten hos vävnaden och typen av harts kommer bandet att vara ungefär rakt. Använd en ren, icke-klibbig spets på en ögonfrans för att lossa banden från knivkanten. Använd ögonfransen för att försiktigt flytta bandet över till mitten av stödmediet.Kloroform eller en värmepenna kan användas för att sträcka ut sektionen vid behov. Dra tillbaka sprutan efter sträckning för att börja tömma vattnet. För mer känsliga band, eller en långsammare vattenupprullning, ta bort sprutan från slangen för att låta vattnet droppa.När vattennivån når wafernivån, tryck försiktigt bandet till mitten av bassängen och fortsätt att dränera tills allt återstående vatten är helt borttaget från bassängen. Låt skivan torka i en ren miljö. Torkningen tar cirka 30 minuter.När provet är helt torkat överför du matrisen till en tätt stängd låda för att skydda den mot smutsförorening. Och placera lådan i en 60 grader Celsius ugn i minst 30 minuter. För att få en översiktskarta över SEM-bilder som avslöjar sektionsplatser på skivan, använd den inbyggda optiska kameran för att skaffa en SEM-bild som täcker ett band av sektioner.Om du vill skapa en mosaik klickar du på och drar kamerabilden av exemplet och startar den automatiska förvärvet. Skaffa översikter med högre upplösning för att hitta målstrukturer. Om bara ett fåtal avsnitt behöver avbildas använder du zoombar visning för att visa förvärvade bilder på sina ursprungliga platser.När ett avsnitt som ska avbildas med hög upplösning har identifierats klickar du och drar för att skapa en bildområde, väljer sedan Högupplösta bildinställningar och lagrar inställningarna i en mall För att hitta särskilt små eller svårupptäckta sällsynta händelser använder du de högupplösta bildinställningarna i vart tionde avsnitt eller på ett avsnitt per menyfliksområde för att manuellt skapa en bildområde och hämta bilderna. Granska sedan bilderna och markera avsnitt som innehåller den intresseregion. Om du vill hämta mer än 10 på varandra följande avsnitt använder du avsnittssökaren för att hitta alla avsnitt automatiskt.Om översiktsbilderna inte visar tydliga intresseområden skaffar du bilder med högre upplösning av avsnitten och använder funktionen förhandsgranskning av avsnittet för att skapa och hämta bilderna automatiskt. För att bestämma de optimala bildinställningarna aktiverar du liveavbildningen i mikroskopkontrollprogramvaran och navigerar till en region av intresse och justerar sedan bildinställningarna tills bilderna visar tydliga områden av intresse, men utan ett alltför långt bildförvärv, enligt tillverkarens riktlinjer. Om du vill optimera placeringen av bildregionerna i på varandra följande avsnitt zoomar du till bilden av intresse och klickar på Starta position förfining för att öka precisionen för registrerade avsnittsplatser.Om du vill definiera ett bildområde klickar du på och drar på valfritt avsnitt medan du håller ned Alt-tangenten och väljer Skapa paneluppsättningsmatris på snabbmenyn. Programvaran kommer att skapa bildområden på samma relativa plats i alla avsnitt som har hittats eller tidigare markerats. Ställ sedan in pixelantal, pixelstorlek, plattsättningslayout och pixelboendetid i varje bildserie efter behov.Om du vill konfigurera den automatiska funktionen skapar du en separat bildserie för automatiska funktioner som demonstreras och flyttar bildserien till en position i avsnittet som innehåller strukturer med hög kontrast. Ställ in bildserien på 1 024 x 884 pixlar och välj en pixelstorlek som motsvarar den högsta upplösningen som används i bildserien. I listan över automatiska funktioner kontrollerar du Autofokus och Auto stigmator.Välj Bisection i anskaffningssekvenskontrollerna och bekräfta att autofunktionens bild är det första objektet i listan och klicka sedan på Hämta alla för att starta bildförvärvet. När alla bild avbildningsserier har skapats och konfigurerats visas serien i en jobbkö. Lågupplöst förvärv kan utföras manuellt eller automatiskt direkt på utvalda delar av sektionen eller en hel sektion med hjälp av en- eller mosaikavbildning, följt av sömmar.Bilder från det valda området kan sedan förvärvas med hjälp av högupplösta parametrar för att visualisera mitokondrier, atomkärnor och mikrovilli, till exempel Efter det automatiska förvärvet av lösta mosaikkartor har valts, kan flera regioner av intresse beskäras eller användas för att definiera ytterligare lokala bildområden inom regionerna. Även om olika specialiserade celltyper i Drosophila tarmen distribueras slumpmässigt, kan de visuellt särskiljas efter screening av bilderna med hjälp av högupplösta parametrar, antingen från enstaka sektioner eller som en samling seriella bilder. Efter justeringen kan staplarna återges med olika programvarulösningar.Matristomografianalys gör att många sekventiella avsnitt kan genereras på den enda skivan och att screenas med lågupplösta parametrar för att lokalisera de allmänna intresseområdena. Dessa områden kan riktas mot ytterligare analys med hjälp av avancerade förvärvsparametrar. Till exempel är mytotiska uppdelningar i notum inte lätta att lokalisera på ultrastruktural nivå, eftersom cellerna är relativt stora jämfört med abscissionszonen.Med den här metoden kan dock de automatiska bilder med medelupplösningsöversikt av sprången på 20 till 40 avsnitt användas för att lokalisera delningscellerna. Matristomografiproceduren ger en enklare elektronmikroskopidataanalys. Vi uppmuntrar tittarna att investera i att behärska regenereringen och bekanta sig med det kartrelaterade arbetsflödet Enligt vår erfarenhet kräver få forskningsämnen ultrastruktural analys av hela djur eller hela organ.Vår metod hjälper till med snabb lokalisering av celler och deras interaktionspartners i vävnader.

Research

JoVE Journal

Biology

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

En standardiserad metod för analys av lever Sinusformig endotelceller och deras fenestrationer genom svepelektronmikroskopi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Svepelektronmikroskopi av uppblötta Tissue att visualisera den extracellulära matrisen

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Studera den supramolekylära organisationen av foto membran i Freeze-brutna bladvävnader av Cryo-svepelektronmikroskopi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Svepelektronmikroskopi (SEM) Protokoll för Problematiskt Plant, Algsvampar, och Svamp Prover

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Beredning och övervakning av Thick Biologiska Prover av Scanning transmissionselektronmikroskopi Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Utreda skadliga effekter av låg trycket Plasma sterilisering på överlevnaden för Bacillus subtilis sporer med Live Cell mikroskopi

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Beredning av prokaryota och eukaryota organismer använder kemisk torkning för Morfologisk analys i svepelektronmikroskopi (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiska provberedning genom högtrycks frysning, mikrovågsugn-assisted kontrastförbättring, och Minimal harts inbäddning för volym Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

Riktade studier med Serial block Face och fokuserad Jon beam Scan Electron Microscopy

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) av biologiska vävnadsprover

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...