Name: array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

At prosedürünün farklı adımlarının geliştirilmesi sırasında verdikleri destekten dolayı Lozan Üniversitesi EM tesisi üyelerine teşekkür etmek istiyoruz. Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O'Brien ve Lindsay Lewellyn'e makalenin hazırlanması ve eleştirel okuma sırasındaki tartışmalar için teşekkür ederiz. Farklı senaryoları göstermek için kullanılan örneklere katkıda bulunan grupları kabul etmek istiyoruz: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat ve Fanny Langlet.

NOT: Örnek hazırlama yöntemleri14,30,31başka bir yerde açıklanmıştır ve bu yayında ele alınmaz. Kısacası, gösterilen örnekler glutaraldehit ile kimyasal olarak sabitlenmiş, % 1 OsO4ile sabitlenmiş, daha sonra gömme reçineye gömülmeden önce% 1 sulu uranil asetat ile tedavi edilmiştir. Alternatif olarak, numuneler yüksek basınçlı dondurma kullanılarak hazırlanabilir, asetonda% 0.1 uranil asetat ile ikame edilebilir ve akrilik reçineye gömülür. Örnek bloklar, numunenin net bir şekilde görülmesine izin veren ve kesit için yönünü kolaylaştıran düz bir gömme yöntemi kullanılarak hazırlanmıştır (Şekil 1B).
1. Dizi oluşturma prosedürü
<ol><li>Katıştırılmış örnek yönlendirme ve kırpma<ol>
<li>Dürbün/mikroskobu kullanarak, bloğun yüzeyini jiletle hafifçe çizerek gömülü blok yüzeyindeki yatırım getirisini tanımlayın ve işaretleyin. Bu, numuneyi ultramikrotom içinde yönlendirmeye yardımcı olacak ve kesit yüzeyini azaltacaktır.</li>
		<li>Numuneyi ultramikrotom tutucuya kelepçeleyin (Şekil 2A).</li>
		<li>Reçineyi numunenin etrafına, önce jiletle (kaba kırpma) kesin ve elmas kırpma aletiyle devam edin (ince kırpma; Şekil 2A). Bloğun üst ve alt yüzeylerinin bıçağın kesici kenarına paralel olduğundan emin olmak için 20° veya 90° kenar eğimli bıçaklar kullanın. NOT: Bu adım seri bölümleme ve düz şeritlerin alınması için kritik öneme sahiptir.</li>
		<li>Ksilen ve tutkalları 3:1 oranında karıştırın. Bir kürdana bağlı bir kirpikle, bu karışımı kesilmiş bloğun üst ve alt kenarlarına uygulayın. İyice kurumasına izin verin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dizi montaj desteğini A (örneğin, silikon gofretler) hazırlayın.<ol>
<li>Gofret parçasını bir gofret kesme aracı (EMS) kullanarak kesin ve boyutunu proje hedefine ayarlayın. 2 cm x 4 cm hem ışık hem de elektron mikroskopi gözlemleri için uygundur.</li>
		<li>Enkazdan kurtulmak için gofretleri damıtılmış suda temizleyin.</li>
		<li>Işıma deşarjı/plazma standart ekipman kullanarak yüzeyi temizler. Kesin parametreler kullanılan makineye bağlı olacaktır. Izgaraların deşarjı için parametrelerle başlayın ve zamanı ampirik olarak ayarlayın. Bu adım, bölümler kururken destekteki bölümlerin iyi bir şekilde yayılması için çok önemlidir ve atlanmamalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>B montaj desteğini (ör. cam kapaklı)<ol>
<li>Multipleks immün etiketleme deneyleri planlıyorsanız, floresan sinyalini daha iyi tespit etmek için örnekleri bir kapak kapağına aktarın. Kapak yapışkanlığını iyileştirmek için, daha önce açıklanan ayrıntılı bir jelatin kaplama prosedürü kullanın9.</li>
		<li>Slaytları indiyum-kalay-oksit (ITO) veya altın ile buharlaşarak kaplayarak iletkenliği artırın. Hazırlanan kapakları temiz bir ortamda saklayın. Işıma deşarjı örnekleri 1.2.3'te açıklandığı gibi boşaltır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Numunenin bölümlenerek
<ol><li>AT bıçak hazırlama NOT: Dizileri oluşturmak için, uzun şeritlerin alınmasını kolaylaştırmak için tasarlanmış değiştirilmiş bir bıçak (ATS) kullanın. Büyük desteklerdeki bölümlerin üretimi için tasarlanan Histo-Jumbo bıçakları veya benzeri bıçaklar AT kesitleme için de hizmet edebilir.<ol>
<li>İğneyi köpüklü yapışkan bandı kullanarak bıçağın dibine takın ve delin (Şekil 2B). ATS bıçağını ultramikrotom tutucuya 0° olarak yerleştirin. Standart prosedürü kullanarak bıçağın kenarını blok yüzeyine paralel olarak ayarlayın.</li>
		<li>Kesilmiş bloğu bıçağın kenarına bölümlenmeye hazır bir pozisyonda getirin.</li>
		<li>Gofreti/örtü kapağını bıçak havzasının içine yerleştirin ve bıçak kenarı ile aynı seviyeye kadar suyla doldurun. Bıçağın elmas kenarının düzgün bir şekilde nemlendirmesine izin verin ve gerekirse, bağlı şırınnayı kullanarak suyu çekin (Şekil 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Dizi bölümleme ve aktarma<ol>
<li>Mikrotomları istenen kesme parametrelerine ayarlayın. ATS bıçağı ile 50-100 nm aralığı ve 0,6-1 mm/s kesme hızı tavsiye edilir. Bölümlemeye başlayın (Şekil 2Di).</li>
		<li>Hedeflenen bir z hacmini kapsayacak ve koleksiyonu durduracak uzunlukta bir şerit edinin. Blok boyutuna, dokunun homojenliğine ve reçine türüne bağlı olarak, şerit nispeten düz olacaktır (Şekil 2D-ii). Birçok örnek, yatırılan çabaya ve bıçak türü kullanılmasına rağmen düz kurdele üretmeyecektir.</li>
		<li>Son hedefe bağlı olarak, yan yana hizalanmış bir uzun veya birkaç kısa şerit yapın. 2 cm x 4 cm destek, 100 ila 1.000 bölümü rahatça tutabilir. Destek adımındaki şeridin düzenlenmesi, el becerisi ve sabit eller gerektiren bir adımdır. Ancak, bu beceri için öğrenme eğrisi hızla kazanilir.</li>
		<li>Kürdan üzerine yapışmış bir kirpiğin temiz, yapışkan olmayan bir ucunu kullanarak şeridi bıçak kenarından ayırın (Şekil 2Diii).</li>
		<li>Kirpik kullanarak, şeridi destek ortamının merkezinin üzerine hafifçe taşıyın. Bu noktada, gerekirse bölümlerin gerilmesi için kloroform veya ısıtma kalemi kullanın. Ancak, bu düzenlemenin şerit kırılmasına ve deformasyona neden olabileceğini unutmayın.</li>
		<li>Şırıngarı çekerek suyu boşaltmaya başlayın. Daha hassas şeritler veya daha yavaş bir su geri çekilmesi için şırınnayı hortumdan ayırarak suyun damlamasına izin verin. Su seviyesi gofret seviyesine indiğinde, şeridi kontrol edin ve gerekirse şeridi yavaşça merkeze iterek yeniden konumlandırın. Şeritleri gofret yüzeye yerledikten sonra, kalan su havzadan tamamen çekilene kadar boşaltmaya devam edin. NOT: Dip su geri çekme ATS bıçağını kullanmıyorsanız, türbülansa neden olmamak için ATS bıçağının yanlarındaki suyu dikkatlice azaltın.</li>
		<li>Tamamen kurumaya bırakın, banyonun içindeki destek bölümlerini bırakın. Desteğin hidrofobikliğine ve çevresel nem seviyesine bağlı olarak, su farklı bir hızda buharlaşacaktır (Şekil 2Div). Numunenin yavaşça kurumasına izin vermek, numunedeki tüm kıvrımları azaltmak veya tamamen önlemek için önemlidir.</li>
		<li>Kir kirlenmesinden korunmak için kuru numuneyi sıkıca kapalı bir kutuya aktarın ve en az 30 dakika boyunca 60 °C fırına yerleştirin. Gerekirse, genel kontrastı artırmak için ağır metaller kullanarak kesitlere karşı koyma.</li>
		<li>İşlemin sonunda, üreticinin talimatlarına uyarak bıçağı dikkatlice temizleyin NOT: Bir gofret üzerindeki birden fazla veya seri bölümün (Şekil 2E) bir yuva ızgarası üzerindeki aktarıma kıyasla (Şekil 2F) aktarılması EM hazırlık deneyimini tamamen değiştirir. Bölümlerin tek destekle kesintisiz bölümlenerek toplanması, seri bölümlemede sık karşılaşıldığı bölümleme ve kesit toplama ile ilgili hataların miktarını azaltır. Bir gofret üzerinde toplanan 1000 μm x 500 μm'lik 100 bölüme eşdeğer 33 yuva ızgarasına karşılık gelir (Şekil 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Örnek gözlem
NOT: Bu bölümde, ticari olarak kullanılabilen bir yazılım kullanılarak uygulanan iş akışı adımları açıklanmaktadır (bkz. Malzeme Tablosu). Doğru dedektörlerle donatılmış herhangi bir SEM'deki herhangi bir görüntü alma yazılımı kullanılabilir, ancak belirli kullanıcı eylemleri farklı olacaktır ve genellikle daha manuel olacaktır.
<ol><li>Gofretteki bölüm konumlarını gösteren SEM görüntülerinin genel bir haritasını alın. Yerleşik optik kamera görüntüsü, bölümlerden veya tüm bölümlerden oluşan bir şeridi kapsayan bir SEM görüntü mozaiği tanımlamaya yardımcı olur. Örneğin kamera görüntüsünde fareyle tıklatıp sürükleyerek mozaiği oluşturun ve Otomatik Alım'ı başlatın. NOT: Çok kaba görüntüleme ayarları, yani 1-2 μm piksel boyutu ve 1 μs durma süresi yeterlidir. Bu işlem Tamamlayıcı Materyalde (sayfa 2-7) gösterilmiştir.</li>
	<li>Bölüm Bulucu Otomatik Algılama işlevine sahip bölümleri bulun veya el ile bulun. Bölüm konumları ve anahatlar, görüntü eşleştirmeye göre bu yazılımla otomatik olarak alınır. Bu işlemin çizimi için bkz.</li>
	<li>Genel bakış görüntülerinin ROI'leri net bir şekilde göstermemesi durumunda, bölümlerin daha yüksek çözünürlüklü görüntülerini alın. Görüntüleri otomatik olarak oluşturmak ve elde etmek için Bölüm Önizleme işlevini kullanın. Bu işlem Ek Malzeme, sayfa 16-18'de gösterilmiştir. Görüntüleme ayarları, kullanıcının aradığı yatırım getirisinin niteliğine ve boyutuna göre seçilmelidir.<ol>
<li>En uygun ayarları bulmak için mikroskop kontrol yazılımında Canlı Görüntüleme'yi etkinleştirin ve tek bir yatırım getirisine gidin. Görüntüler ROI'leri net bir şekilde gösterene kadar görüntüleme ayarlarını değiştirin, ancak görüntü alma aşırı uzun değildir.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntüleme bölgelerini tanımlama NOT: Birkaç farklı strateji önerilmektedir.<ol>
<li>Yalnızca birkaç bölümün görüntülenebilmesi gerekiyorsa, ilgili bölümlere gitmek için şimdiye kadar oluşturulan bölümlerin görüntülerini kullanın ve tüm bölümlere bakmak için elde edilen tüm görüntüleri orijinal göreli konumlarında gösteren Yakınlaştırılabilir Görüntüleyici'yi kullanın. Yüksek çözünürlükte görüntülenmesi gereken bir bölüm bulunduktan sonra, tıklatıp sürükleyerek bir görüntüleme bölgesi oluşturun. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ayarlarını seçin ve ayarları bir şablonda depolayın. Diğer bölümler için bu şablonu yeniden kullanın.</li>
		<li>Özellikle küçük veya tespit etmesi zor nadir olayları bulmak için Yanal Tarama yaklaşımını kullanın. Her onuncu bölümde veya şerit başına bir bölümde yüksek çözünürlüklü görüntüleme ayarlarına sahip bir görüntüleme bölgesini el ile oluşturun ve görüntüleri alın. Yazılımdaki yatırım getirisini içeren görüntüleri gözden geçirin ve bölümleri işaretleyin veya not alın.<ol>
<li>Yatırım getirisini içeren bölümlerden başlayarak, bölüm kümesinde ileri ve geri gidin ve yapı bölümde hala görünür olduğu sürece aynı göreli konumlarda yüksek çözünürlüklü görüntüleme bölgeleri oluşturun. Bu, el ile veya sonraki adımlarda açıklanan yordam kullanılarak yapılabilir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ondan fazla ardışık bölümde görüntü alın. El kitabı içinde açıklandığı gibi kayıtlı bölüm konumlarının duyarlılığını artırmak için görüntüyü yakınlaştırdıktan sonra Konum İyileştirmeyi Başlat'ı tıklatın. Bunu yapmak görüntü serilerinin konum değişkenliğini azaltır. Prosedür Ek Materyal sayfaları 19-21'de gösterilmiştir ve açıklanmıştır.</li>
		<li>Alt tuşunu basılı tutarken görüntüleme bölgesi tanımlamak için herhangi bir bölümü tıklatıp sürükleyin ve fare düğmesi serbest bırakıldığında açılan bağlam menüsünden Döşeme Kümesi Dizisi Oluştur'u seçin. Yazılım daha sonra daha önce bulunan veya işaretlenen tüm bölümlerde aynı göreli konumda görüntüleme bölgeleri oluşturur. Bölüm Yayılma Alanı kaydırıcısıyla görüntülemeyi belirli bir bölüm aralığıyla sınırlamak mümkündür. NOT: Bu prosedür herhangi bir sayıda görüntüleme bölgesiyle tekrarlanabilir ve bu nedenle her bölüme tek bir büyük görüntü kaydetmek yerine birçok küçük yüksek çözünürlüklü görüntünün kaydedilmesine izin verir.</li>
		<li>Oluşturulduktan sonra, gerektiğinde her görüntü serisinde piksel sayısı, piksel boyutu, döşeme düzeni, piksel yerleşim süresi vb. Görüntüleme serileri oluşturulduktan ve kurulduktan sonra, hepsi bir iş ipucunda listelenir.</li>
	</ol></li>
	<li>Otomatik işlevleri yapılandırma ve görüntü almayı başlatma<ol>
<li>Önceki adımda açıkladığı yöntemi kullanarak otomatik işlevler için ayrı bir görüntü serisi oluşturun. Görüntü serisini, bölümde yüksek karşıtlık yapıları içeren bir konuma taşıyın.</li>
		<li>Görüntü serisini 1024 x 884 piksel olarak ayarlayın ve önceki adımlarda ayarlanan görüntü serisinde kullanılan en yüksek çözünürlüğe karşılık gelen bir piksel boyutu seçin. Otomatik fonksiyonlar listesinde, Otomatik Odaklama ve Otomatik Damgalama.</li>
		<li>Alım sırası denetimlerinde Bölüme Göre'yi seçin ve otomatik işlevler görüntüsünün listedeki ilk öğe olduğundan emin olun. İş ipucunun yanındaki Çalıştır düğmesini tıklatarak görüntü alımını başlatın. Bu prosedürler Ek Materyal, sayfa 22-23'te gösterilmiştir. NOT: Her bölüme manuel olarak önceden odaklanmak gerekli değildir. Kayıt oturumu sırasında, mikroskop yeni bir bölüme ilerlediği zaman, diğer tüm görüntüler bu bölüme kaydedilmeden önce otomatik işlevler yürütülür.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Veri hizalaması ve analizi
<ol><li>Veri verme<ol>
<li>Verilerin .tif biçimde kaydedildiklerine emin olun, böylece özel bir dışa aktarma işlevine gerek yoktur. Verileri, Katman Ağacı'ndaki katmanlara ve öğelere doğrudan karşılık gelen bir klasör yapısına sıralayın.</li>
		<li>Görüntü mozaikleri kaydedildikten sonra, tüm döşemeleri otomatik olarak dikmek için StitchAll işlevini kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fiji'de yığın hizalama ve kırpma NOT. Dizi Tomografi verileriyle çalışmak için birçok yazılım paketi (ücretsiz ve ticari) kullanılabilir. Aşağıdaki adımlar açık kaynaklı program Fiji32 ile gösterilmiştir, çünkü yaygın olarak kullanılabilir ve gerekli tüm işlevleri içerir.<ol>
<li>Fiji'ye sanal yığın olarak bir görüntü yığını (veya dikişli görüntüler) içe aktarın.</li>
		<li>Kontrast/parlaklık normalleştirilmesi gerekiyorsa, Gelişmiş Karşıtlık 'ıseçin ... işlem menüsünden seçin. Doymuş Pikselleri 0,1 veya daha az olarak ayarlayın ve Tüm Dilimleri İşle 'yi denetleyin.</li>
		<li>Eklentiler menüsünden Kayıt | SIFT ile Doğrusal Yığın Hizalaması.</li>
		<li>Beklenen Dönüşüm açılır menüsünden Rijit veya Affine'i seçin. Aksi takdirde, varsayılan ayarları saklayın. Tamam 'ı tıklatarak hizalamayı başlatın. NOT: Verileri Sanal Yığın olarak yüklemek, Fiji'nin herhangi bir boyuttaki yığınları işlemesine izin verir. Hizalamanın çıktısı RAM'de oluşturulur; ancak, bu işlenebilen yığınların en büyük boyutunu sınırlayabilir. Bu durumda, sanal yığın dilimleri kaydedinaynı kayıt algoritmasının klasörden klasöre uygulamasıdır. Kayıt tamamlandıktan sonra, çıktı verilerini sanal yığın olarak yükleyin.</li>
		<li>Görüntü yığınını, yalnızca yatırım getirisini içermesi için Kırp'ı tıklatarak kırpın.</li>
		<li>Yığını tek bir .tif görüntü veya .tif görüntü serisi olarak kaydedin. NOT: Dizi Tomografisinin kritik adımları Şekil 3'te gösterilmiştir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Luckner, M., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+light+microscopy+to+analytical+scanning+electron+microscopy+(SEM)+and+focused+ion+beam+(FIB)/SEM+in+biology:+Fixed+coordinates,+flat+embedding,+absolute+references.">From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+electron+microscopy+volume+of+the+brain+of+adult+Drosophila+melanogaster.">A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster.</a> Cell. 174 (3), 730-743 (2018).</li><li>Mulcahy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+volume+electron+microscopy+of+the+caenorhabditis+elegans+nervous+system.">A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system.</a> Frontiers in Neural Circuits. 12, 94 (2018).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li><li>Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+molecules+and+cells.">Electron tomography of molecules and cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).</li><li>Hoog, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+interphase+microtubules+in+fission+yeast+analyzed+by+electron+tomography.">Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography.</a> Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).</li><li>Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+structural+studies+of+eukaryotic+cells+by+cryo-electron+tomography.">Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography.</a> Cells. 8 (1), 57 (2019).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+(S3EM)+on+silicon+wafers+for+ultra-structural+volume+imaging+of+cells+and+tissues.">Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues.</a> PLoS One. 7 (4), 35172 (2012).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).</li><li>Kubota, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+nanotube+tape+for+serial-section+electron+microscopy+of+brain+ultrastructure.">A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure.</a> Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).</li><li>Wacker, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+Hierarchical+Imaging+of+Serial+Sections+for+Finding+Specific+Cellular+Targets+within+Large+Volumes.">Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57059 (2018).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Templier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MagC,+magnetic+collection+of+ultrathin+sections+for+volumetric+correlative+light+and+electron+microscopy.">MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy.</a> Elife. 8, 45696 (2019).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).</li><li>Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+EM-based+reconstruction+of+the+interglomerular+projectome+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).</li><li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology:+Applications+and+technology.">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).</li><li>Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIB-SEM+tomography+in+biology.">FIB-SEM tomography in biology.</a> Methods in Molecular Biology. 1117, 541-558 (2014).</li><li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging.">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, 25916 (2017).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+cluster+ion+beam+SEM+for+imaging+of+large+tissue+samples+with+10+nm+isotropic+resolution.">Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution.</a> Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).</li><li>Maco, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+in+vivo+2+photon+and+focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+of+cortical+neurons.">Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons.</a> PLoS One. 8 (2), 57405 (2013).</li><li>Russell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+microscopes:+3D+correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+of+complex+biological+structures.">Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures.</a> Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).</li><li>Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+for+observing+the+three-dimensional+ultrastructure+of+membranous+cell+organelles+in+relation+to+their+molecular+components.">Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).</li><li>Peddie, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+and+integrated+light+and+electron+microscopy+of+in-resin+GFP+fluorescence,+used+to+localise+diacylglycerol+in+mammalian+cells.">Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).</li><li>Markert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+subcellular+localization+with+superresolution+array+tomography+on+ultrathin+sections+of+various+species.">3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species.</a> Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).</li><li>Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+precise+and+rapid+mapping+protocol+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+small+invertebrate+organisms.">A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms.</a> Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).</li><li>Kolotuev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+correlative+anatomy+of+invertebrate+model+organisms+increases+efficiency+of+TEM+data+production.">Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).</li><li>Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+acetylcholine+signaling+through+a+muscarinic+receptor+regulates+cell+migration.">Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster.">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li><li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis.">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+asymmetric+stem+cell+division.">Mechanisms of asymmetric stem cell division.</a> Cell. 132 (4), 583-597 (2008).</li><li>Daniel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+septate+junctions+assembly+and+completion+of+cytokinesis+in+proliferative+epithelial+tissues.">Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues.</a> Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).</li><li>Pasquettaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peculiar+protrusions+along+tanycyte+processes+face+diverse+neural+and+non-neural+cell+types+in+the+hypothalamic+parenchyma.">Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2020).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+image+browser:+A+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets.">Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).</li></ol>

Yazar Tilman Franke, makalede kullanılan elektron mikroskopları ve pilot programları üreten Thermo Fisher'ın bir çalışanıdır.

Elektron mikroskopisi, hücrelerin ve organizmaların ultrayapısına ilişkin fikir verir, bunun için genellikle 3 boyutlu bağlamlarında ilgi çekici yapıları görüntünün istenmesi istenir. Ultrayapısal analiz için çok sayıda EM taktiğine rağmen, hala "altın standart" bir çözüm yoktur. Ana neden, sık sık özel bir yaklaşım gerektiren çok çeşitli numuneler, birçok biyolojik sorudur. Önerilen AT iş akışı, örnek işleme, veri toplama, değerlendirme ve depolama için gereken süreyi en aza indirmek için tasarlanmıştır. Ayrıca, değiştirilmiş bıçak dizi alımını basitleştirmek için yararlı bir araç sağlar. Gofretlerdeki bölümlerin kompakt düzeni, hem gözlem hem de numunelerin sonraki depolaması için uygundur. Bu düzenleme, şeritten şereğe yatay olarak geçerek ve her birinde yalnızca bir bölümü tarayarak örneklerin "Yanal Taramasını" etkinleştirir ve bir yatırım getirisini yerelleştirmek için gereken süreyi önemli ölçüde azaltır. Önerilen veri toplama senaryoları, küçük ve rastgele dağıtılmış alanların hedef alınmasını kolaylaştırır. Bulunduktan sonra, AT/SEM, manuel olarak veya otomatik işlev yardımıyla gerçekleştirilse de, yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi tam olarak ilgi hacmiyle sınırlar. Sınırlı hacimler için AT, operatör numunede gezinerek ve görüntüleme bölgelerini tek tek tanımlayarak manuel olarak tamamlanabilir. Yazılımın otomatik modülü, küçük alanların geniş bölümlerde görüntülenmesi için esnek bir görüntü alma stratejisi sağlar. Bu yazılımdaki otomasyon, yüzlerce bölüme büyük yüksek çözünürlüklü görüntüler kaydetmeye izin verir ve SBFI ile benzer hacimlere sahiptir. Tüm bölümlerin genel bakış görüntülerini kaydetmek yatırım getirisi yerelleştirmesini basitleştirir ve mikroskopta harcanan süreyi azaltır. Genel bakışların ve daha yüksek çözünürlüklü Önizlemelerin kaydı sırasında bölümlere zarar veilmediğinden, AT/SEM, diğer ROI'lerin daha fazla verisini toplamak için veya daha yüksek çözünürlükte örneği yeniden kullanır.
Görüntü alma süresi, 3D EM'nin en önemli (ve en pahalı) yönlerinden biridir ve bu nedenle deney tasarımında dikkate alınmalıdır. Geniş alanların görüntülenmesinin küçük alanları görüntülemekten daha uzun sürmesi şaşırtıcı olmasa da, etkiyi az tahmin etmek kolaydır: Seçilen görüntüleme parametrelerine bağlı olarak, her bölümdeki edinme süresi saniyelerden saatlere kadar değişebilir. Kritik görüntüleme parametreleri görüş alanının boyutunu, çözünürlüğü ve çalışma süresini içerir. Piksel başına 10nm hedef çözünürlük ve 1 μs durma süresi varsayarsak, 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm veya 500 μm x500 μm'lik bir alanı görüntülemek 4 saniye, 100 saniye veya 2.500 sn sürer. Tüm görüntüleme işi için gereken süreyi tahmin etmek için bu bölüm başına görüntüleme sürelerini bölüm sayısıyla çarpabiliriz. Bölüm sayısı azsa veya mikroskop takım süresi önemli değilse, bölüm başına uzun görüntüleme süreleri kabul edilebilir.
Ancak, kayıt süresini çoğu durumda bir gecelik iş veya hafta sonu işi ile sınırlamak gerekir. 3D EM'nin dikkate alınması gereken eşit derecede kritik bir yönü, elde edilen görüntü verilerinin miktarı ve yapısıdır. Yukarıda belirtilen görüntüleme alanlarını 100 bölüm halinde kaydetmek sırasıyla 400 mb, 10 gb veya 250 gb görüntü verisi oluşturur; 500 μm x 500 μm görüntüler, her biri 2 GB'den büyük olmanın ek sorununu oluşturur. Veri değerlendirmesi için kullanılan yazılım programlarının çoğu bu boyuttaki görüntüleri açamaz.
Görüntüleme süresini azaltmak için, sonraki veri değerlendirmesi (örneğin, yeniden yapılandırma, izleme) için sinyal-gürültü oranı gereksinimlerini karşılamak ve kayıtları tanımlanmış ROI'lerle sınırlamak için piksel bekleme süresini seçmek önemlidir. Yazılımın AT uzantısı, seri bölümlerdeki küçük alanlarda görüntü alımını kolaylaştırır. Yazılım manuel ve otomatik iş akışlarını ve birçok yarı otomatik varyantı destekler: görüntüleme alanları manuel olarak konumlandırılabilir ve her bölüme odaklanabilir veya kullanıcı otomatik bölüm bulucu ve konum hizalama özelliklerini kullanabilir. Örnek tür veya görüntüleme hedefleri tarafından seçilen ve desteklenen otomasyon düzeyine bağlı olarak, yüzlerce bölümde görüntü alımını ayarlamak için gereken süre tüm bir iş günü (el ile yapılır) veya yalnızca birkaç dakika sürebilir. Prensip olarak, Dizi Tomografisi küçük ROI'ler elde etmeyi diğer 3D EM yöntemlerinden daha zor hale getirir; ardışık bölümlere kesin olmayan bölge yerleşimi, daha geniş alanlar elde edilerek telafi edilmelidir. Örneğin, yatırım getirisi 20 μm x 20 μm boyutlardaysa ve görüntüleme alanlarının kesit-kesit konum değişkenliği 10μm ise, yatırım getirisinin her görüntüde, her bölümde tam olarak yakalandığından emin olmak için 40 μm x 40 μm görüntü elde edilmesi gerekir. Gerçek dünyadaki görüntü konumu değişkenliği, konum hizalaması veya kullanıcının sabrı için yazılım özelliklerinin kullanılabilirliğine veya kalitesine bağlı olarak 100 μm ile 10 μm < arasında değişir. Bu yazılımla, çoğu numunede çok fazla manuel müdahale olmadan 10 μm elde edilebilir.
Her teknik gibi, AT'nin de başarılı veri toplamayı etkileyebilecek birkaç zayıf noktası vardır ve birçoğu diğer bölümleme tabanlı yöntemlere benzer. Boş reçinenin dokuya karşı homojen dağılımının olmaması kavisli veya kırık dizilere neden olabilir. Aşırı durumlarda, bölümler destekten ayrılabilir (Şekil 6A). Kesme işlemi sırasında değişken sıkıştırma veya germe, sonraki bölümlerde değişken bölgelerde numuneyi bozabilecek kıvrımlar oluşturabilir (Şekil 6B). Bıçak izleri, hasarlı bir bıçak kullanılarak toplanan bölümlerin yüzeyinde görünebilir (Şekil 6C). Kesit koşullarındaki farklılıklar zaman zaman kesit sıkıştırma ve kalınlık farklılıklarına neden olabilir. Toz veya kir parçacıkları bir bölüme inebilir ve ilgi alanını kısmen gizleyebilir (Şekil 6D). Kusurlu otomatik kontrast, otomatik odaklama ve otomatik damgalama işlevleri nedeniyle görüntü alma başarısız olabilir. Otomatik olarak oluşturulan görüntüleme alanlarının konumlandırılması değişken olabilir ve tüm bölümlerde yatırım getirisini yakalayamayabilir.
Dikiş ve hizalama aşamasında çeşitli sorunlar ortaya çıkabilir. Mozaik karo alımlarının otomatik dikişi, örneğin numunenin içindeki geniş boş alan nedeniyle başarısız olabilir. 3D'deki köklü bir şekil değişikliği nedeniyle, görüntü yığınlarının kaydedilmesi zor olabilir. Özel olarak geliştirilen programlar (örneğin, IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB veya MAPS-AT) yarı otomatik hizalama32 , 38,39,40'ıkolaylaştırabilir. Daha zorlu bölümler, fotoğraf düzenleme yazılımı kullanılarak manuel olarak hizalanabilir. Ne yazık ki, bazı veri kümelerinin doğru hizalaması imkansız olabilir.
Büyük numuneler, ızgaralara uyan TEM seri bölümleri için zorludur; öte yandan, birçok proje FIB/SEM veya SBF-SEM kullanılarak uzun otomatik satın almayı haklı çıkarmaz. AT, bir gofret üzerindeki seri bölümlerin toplanması ve manipülasyonunun yuva ızgaralarından daha basit olduğu sıkıcı bir seri bölüm TEM'e basit bir alternatiftir. Dizilerin toplanmasını kolaylaştırmak için çeşitli stratejiler geliştirildi ve mevcut araç setini genişletme yöntemimizi paylaşıyoruz. Yatırım getirisinin tanımlanmasının zor olduğu durumlarda AT-SEM, 50 ila 500 bölümde organel ölçeğinde çözünürlüğün gerekli olduğu numunelerin verimli bir şekilde taranmasını sağlayarak temel bir avantaj sağlar. Daha büyük birimler için, daha fazla bölüm gerekiyorsa otomatik toplama AT stratejileri verimli bir şekilde toplanabilir. AT örnekleri birden çok kez yeniden görüntülenebilir ve daha önce elde edilen genel bakış görüntülerine dayanarak yüksek çözünürlüklü alanların hedefli görüntülenmesini kolaylaştırır. Burada önerilen AT/SEM tarafından hedeflenen analizin ve azaltılmış aşırı örneklemenin işgücü ve veri depolama gereksinimlerini azalttığına inanıyoruz. Sonuç olarak, bölüm kitaplıkları daha sonra yeniden kullanım ve danışma için toplanabilir ve korunabilir. Hacim alımı için FIB veya SBF-SEM yaklaşımları, yatırım getirisinin blok yüzünde tanımlanması kolay olduğunda veya analiz için büyük 3B hacimlere ihtiyaç duyulduğunda mükemmel bir çözüm sunar. Ancak, fib/SBF-SEM, yüksek çözünürlüklü yığın görüntüsünün tanımlanmış bir yatırım getirisinden hedeflenen bir şekilde toplanması gerektiğinde daha az verimlidir. Sonuç olarak, AT örneklerinin taranmesi ve orta çözünürlüklü genel bakış görüntülerinin kullanılması için önerilen yöntemler, görüntü alımını bölüm dizisinin ilgili bölümleriyle sınırlamaya izin verir. Görüntüleme bölgelerinin hassas bir şekilde hedef alınması, veriye olan süreyi hızlandırır ve veri değerlendirmesini kolaylaştırır.
Özetle, AT/SEM kavramı yeni olmasa da, kullanımı hala esaslarının önereceği kadar yaygın değildir. Genel olarak, diğer mevcut EM yöntemlerine tamamlayıcı bir prosedür sağlar. AT/SEM, en geniş numune hazırlama protokolleri ve görüntüleme iş akışları ile uyumludur ve eşlik eden bir teknik olarak herhangi bir FIB/SEM veya SBF-SEM mikroskopunda yapılabilir. Bu yazıda, diğer yöntemlerle başarıyla ele alınma olasılığı daha düşük olan örneklerden ultrayapısal verilerin kaydedilmek üzere AT'ye odaklandık. Bölümlerin ve önemli ölçüde otomatik satın alma stratejilerinin uygun bir şekilde toplanması için açıklanan prosedürün, yöntemle hiç karşılaşmamış olanlar için ilk denemelerde yardımcı olacağını ve zaten bazı deneyime sahip olanlar için mükemmelleştirmeye yardımcı olacağını umuyoruz.

EM ile ilgili tekniklerin önemine rağmen, onlara hakim olmak için gereken çaba, tüm alanı az sayıda uzmanla sınırlı tutar. Önemli bir zorluk, EM için korunan örneklerde bir İlgi Alanı'nın (ROI) tanımlanması ve alınmasıdır. Optik mikroskopi ile analiz edildiğinde ve EM gözlemi için işlendikten sonra aynı numunenin görünümü önemli ölçüde farklılık gösterir. Kimyasal olarak hazırlanmış numuneler için yapılan değişiklikler arasında dehidrasyon adımlarından sonra anizotropik numune büzülmesi (her boyutta ~%10) ve fiksasyon ve boyama protokolünde osmium kullanırken floresan kaybı(Şekil 1A)sayılabilir. Ultra ince kesit için, numuneler farklı stratejiler kullanılarak epoksi veya akrilik reçinelere gömülüdür (Şekil 1B). Bu preparatın başarılı sonuçları için, numunenin tamamı 1 mm x 1 mm'yi geçmeyen parçalara kesilmelidir. Standart İletim Elektron Mikroskopisi (TEM) gözlem koşullarının gereksinimlerini karşılamak için, numunenin bu küçük kısmı 50-150 nm kalınlığında dilimlere daha fazla bölümlenmiştir. Elde eden gri tonlamalı görüntüler, tüm numunenin bir dakikalık kısmının doku organizasyonunu ve organel yapısını diğer mikroskopi tekniklerinden daha ayrıntılı olarak göstermektedir (Şekil 1C). Tipik bir TEM veri kümesi, hücre ve dokularda 3D alanda doğal olarak meydana gelen süreçleri anlamak için teorik olarak tahmin edilen 2D bilgiler sağlar. Şekil 1D, ultrayapısal hacimlerin elde edilmesi zorluğunu ortaya getirmektedir: 50 nm kalınlığında 1.000 μm'lik bir küp kesitlenirse, tüm hacmi kapsayacak şekilde 20.000 bölüm gerekecektir; 500 μm yan küp için 10.000 bölüm olacaktır. 50 μm x 50 μm x 50 μm hacmi kapsayacak şekilde "yalnızca" 1.000 bölüm gerekebilir. Bu hacmi manuel olarak elde etmek neredeyse imkansızdır ve otomasyonla gerçekleştirilmesi son derece zordur. Numune derinliğine ek olarak, bu tür varsayımsal küplerin tüm yüzeyini kaplamamız gerekirse, makul çözünürlükte 1 μm2 yüzeyin kapsama alanı ciddi bir lojistik sorun haline gelir (Şekil 1E). Bağlaç yaklaşımları gibi olağanüstü büyük ölçekli projeler için, çok sayıda bölüm çok önemlidir, ancak "sıradan" EM projelerinin çoğu için, gözlem için gereken daha fazla bölüm üretmek önemli bir dezavantaj yaratmaktadır.
3D ultrayapısal bilgi edinmenin çeşitli yöntemleri vardır: seri kesit iletim elektron mikroskopisi (TEM), TEM tomografisi, Dizi Tomografisi (AT), Seri Blok Yüz Görüntüleme Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM) ve Odaklanmış İyon Işın TaramaLı Elektron Mikroskopisi (FIB-SEM). Bu yöntemler arasındaki temel farklar bölümleme stratejisi ve görüntü alımının bölüm oluşturma1ile birleşip birleşmediğidir. Seri kesit TEM'de, yuva ızgaralarında sıralı bölümler toplanır, TEM görüntüleri bu dizilerden oluşturulur ve2, 3,4,5hizalanır. TEM tomografisinde, bir ızgara üzerinde 150-300 nm bölümler arasında eğim serisi ve seri bölümleme ile birleştiğinde, nispeten küçük hacimler 6 ,7,8olsa da çok yüksek bir çözünürlük sağlar. AT yaklaşımı, cam kapaklı, silikon gofretler veya özel bir bant gibi nispeten büyük destekte çeşitli manuel ve yarı otomatik bölümler toplama ile fiziksel bölümleme kullanır. Görüntü alımı için, destek SEM'de analiz edilir, çeşitli görüntü alma stratejileri mevcuttur9,10,11,12,13,14,15 . SBF-SEM için, reçinebloğu16, 17 , 18,19yüzeyinden oluşturulan SEM görüntüsü ile doğrudan SEM odasının içine yerleştirilmiş elmas bıçaklı bir mini mikrotom kullanılarak fiziksel kesit elde edilir. FIB-SEM için, iyon kaynağı numunenin ince katmanlarını temizler, ardından maruz kalan yüzeyin SEM20,21tarafından otomatik olarak görüntülenmesini izler. TEM-tomografi ve AT, gerekirse yeniden görüntülenebilen fiziksel bölümler oluştururken, FSBF-SEM ve FIB-SEM görüntülemeden sonra bölümü ortadan kaldırır. Çok ışınlı bir SEM tarafından görüntülenen fiziksel bölümlerin yeni bir kombinasyonu, görüntü alma hızının "darboğaz" sorununu çözen yöntemlerin bir kombinasyonunu sağlar22. Bu tekniklerin her biri EM verilerinin elde edilebilme ve analiz edilebilme biçiminde devrim yaratmıştır ve her yaklaşımın belirli bir araştırma sorusuyla ilgili pratik etkileri vardır.
Hazırlığın doğası ve ultrayapısal boyutların ölçeği göz önüne alındığında, örnek blokta belirli bir hedef yapının nerede bulunduğunu tahmin etmek kolay değildir (Şekil1D,E). Yatırım getirisi yerelleştirmesi için bir çözüm, tüm bloktaki görüntüleri en baştan istenen çözünürlükte kaydetmektir. İlgi çekici yapılar mikroskoptan uzaktayken elde edilen veri hacminde olabilir. Bu stratejiyle ilişkili edinme süresi ve veri işleme sorunludur. Kaydedilen veri miktarını azaltmak istenir, özellikle ROI'ler doku bloğundan çok daha küçükse, yani ilgi çekici nesneler belirli hücre türleriyse (tüm organlar değil). Farklı korelatif ışık ve elektron mikroskopi teknikleri (CLEM), floresan aynı örnek 23 , 24 , 25 ,26 ,27,28,29içinde hazırlanmadan önce veya sonra korunup lokalize edildiğinde başarılı olabilir. Bununla birlikte, birçok hücresel yapı floresan korelasyon olmadan bile, sadece bilinen ultrayapıya dayanarak tanınabilir. Bu durumlarda, yanal tarama Dizi Tomografisi'nin yatırım getirisi yerelleştirmeye yatırılan çaba ile ultrayapısal bilgi kalitesi arasında bir denge sağladığına inanıyoruz. Bu strateji kullanılarak, gofretteki bir alt bölüm kümesi, yatırım getirisinin boyutuna ve doğasına göre kurulabilen düzenli aralıklarla taranır. ROI'ler bulunduktan sonra, veri toplama, bağlantı bölümünden önce başlayıp sonra biten ve ilgili bilgileri hedeflenen bir şekilde toplayan sürekli bir bölüm serisinde ayarlanır.
AT için çok sayıda bölümde ilgi çekici bölgelerin veya olayların edinimini basitleştiren ve hızlandıran ve daha iyi hizalanmış görüntü hacimleri sağlayan protokoller sunuyoruz. Yanal tarama ve çok hızlı alım, tam olarak hedeflenen bölgelerde çok yüksek çözünürlüğe sahip veriler üretir. Tarif ettiğimiz prosedür, 3D EM veri toplamanın sağladığı gibi çeşitli zorlukları ele almaktadır: numune hazırlama iş akışını temelden değiştirmeden çok çeşitli örneklerle uyumluluk; bölümleme ve SEM alımları için hedeflenen yerelleştirme; kurulum sırasında daha az zaman ve çaba; elde eden birimlerin daha iyi hizalanmasıyla birden fazla bölümdeki bölgelerin görüntülenmesi; ve dikişli mozaik resmin içinde farklı görüntüleri derlemek için pürüzsüz bir dikiş ve hizalama prosedürü. Yayınlanan ve devam eden projelerden aldığımız birkaç örnekle yöntemimizin gücünü göstermeyi seçtik. Bu yaklaşımın, sınırlı EM deneyimine sahip araştırmacılar için bile hedeflenen EM verilerinin üretilmesini ve edinimini önemli ölçüde kolaylaştırabileceğine inanıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AT sectioning knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUATS3530</td>
			<td>Diatome Jumbo knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td>Diatome trimming 20&#176; 
			Glass knife</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16015</td>
			<td>Resistance: 1-30 Ohms 
			Type P: (Boron) (1 primary flat) 
			Roughness: 2 nm 
			No SiO2 top coating 
			TTV: = &#60;20 &#181;m 
			Wafer is polished on one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer cleaving kit</td>
			<td>EMS</td>
			<td>7642</td>
			<td>EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Thermo Fischer Helios</td>
			<td>1072419</td>
			<td>Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maps 3 for SEM with Correlative Workflow &#38; Array Tomography</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1135932</td>
			<td>Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira x.y</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1131599</td>
			<td>Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td>IMOD, MIB (See text for refferences)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

array tomography workflow for the targeted acquisition of volume information using scanning electron microscopy

Elektron mikroskopisi, hücresel ve yapısal detayların nanometre çözünürlüğünde görüntülenmesi için biyoloji ve tıpta uygulanır. Tarihsel olarak, İletim Elektron Mikroskopisi (TEM) hücre ultrayapısına dair fikir verdi, ancak son on yılda modern Taramalı Elektron Mikroskoplarının (SEM) gelişimi hücrelerin içine bakış şeklini değiştirdi. Protein düzeyinde yapısal detaylara ihtiyaç duyulduğunda TEM'in çözünürlüğü üstün olsa da organel düzeyinde hücre biyolojisi ile ilgili soruların çoğunluğu için SEM çözünürlüğü yeterlidir. Teknolojideki ilerleme, Seri blok yüz görüntüleme (SBF-SEM) ve Odaklanmış iyon ışını SEM (FIB-SEM) gibi otomatik hacim alma çözümlerini etkinleştirdi. Bununla birlikte, bugüne kadar, ilgi alanlarına kimlik ve navigasyon çok önemli olduğunda bu yöntemler verimsiz kalmaktadır. Görüntülemeden önce hedef alanların kesin olarak yerelleştirilmesi için araçlar olmadan, operatörlerin ihtiyaç duyduklarından çok daha fazla veri elde etmeleri gerekir (SBF-SEM'de) veya daha da kötüsü, birçok ızgara hazırlamaları ve hepsini (TEM'de) görüntülemeleri gerekir. İlgi alanlarının lokalizasyonunu kolaylaştıran SEM'de Array Tomografi'yi kullanarak "yanal tarama" stratejisini ve ardından toplam örnek hacminin ilgili kısmının otomatik olarak görüntülenmesini öneriyoruz. Dizi tomografi örnekleri görüntüleme sırasında korunur ve tekrarlanan görüntülemeye hazır bölüm kitaplıkları halinde düzenlenebilir. Yanal taramanın, başka herhangi bir yöntemle erişmesi inanılmaz derecede zor olan yapısal ayrıntıları analiz etmemizi sağladığı birkaç örnek gösterilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Seri bölümlerin şeritlerinin hazırlanmasını ve taramalı elektron mikroskobundaki otomatik görüntüleme prosedürleriyle birlikte Dizi Tomografi örnekleri olarak kullanılmak üzere büyük aktarım desteği üzerine toplanmasını açıklıyoruz. Protokol, yerel, nadir olayların taranmalarına, alınmasına ve hedeflenen görüntülemesine ve büyük veri birimlerinin alınmasına izin verir.

TaramaLı Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Hacim Bilgilerinin Hedefli Edinimi için Dizi Tomografi İş Akışı

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Elektron mikroskopisi analizi sıklıkla karmaşıktır. Protokolümüzün EM verilerinin büyük numune yüzeyinden ve orta hacimden işlenmesini ve edinimini kolaylaştırdığına inanıyoruz. Protokolümüz seri bölümlerde hedef yapıları bulmaya yardımcı olur.Veri kaydı gerekli olanla sınırlıdır. Tam doku bloklarında veri toplama ile karşılaştırıldığında, kayıt süresi azalır ve veri analizi daha kolaydır. Yaklaşımın genel kolaylığı göz önüne alındığında, sadece bilimsel soruları değil, aynı zamanda bir tanı aracı olarak da kullanılabileceğine inanıyoruz.Analiz için bir dizi oluşturmak için, önce numuneyi bir ultramikrotom tutucuya kelepçeleyin ve reçineyi numunenin etrafına kabaca kırpmak için bir jilet kullanın. Numuneyi ince kırpmak için bir elmas kırpma aracı kullanın ve bloğun üst ve alt yüzeylerinin bıçağın kesme kenarına paralel olduğundan emin olmak için 20 veya 90 derecelik eğimli kesme bıçakları kullanın. Ksilen ve tutkalları 3:1 oranında karıştırın ve karışımı kesilmiş bloğun üst ve alt kenarlarına uygulamak için kürdana bağlı bir kirpik kullanın.Karışım kururken, bir gofret parçasını analiz için uygun boyuta kesmek için bir gofret sıkma aracı kullanın. Herhangi bir döküntünü durulamak için gofretleri damıtılmış suda temizleyin ve gofret kurudıktan sonra yüzeyi plazma ile temizleyin. Bir dizi tomografi bıçağı hazırlamak için, bir histo jumbo bıçağın altına bir iğne takmak için köpüklü yapışkan bant kullanın ve bıçağı ultra mikrotom tutucuya sıfır derecede yerleştirin.Bıçağın kenarını blok yüzeyine paralel olarak ayarlayın ve kesilmiş bloğu kesit için hazır bir konumda bıçağın kenarına getirin. Temiz gofreti bıçak havzasına yerleştirin ve havzayı bıçak kenarı ile aynı seviyeye kadar suyla doldurun, ardından bıçağın elmas kenarının gerektiği gibi su eklemek veya çekmek için ekli şırınnayı kullanarak düzgün bir şekilde nemlendirmesine izin verin. Dizi bölümleme için mikrotomeyi 50 ila 100 nanometre kesme aralığına ve saniyede 6 ila 1 milimetre kesme hızına ayarlayın ve hedeflenen bir Z hacmini kaplayacak kadar uzun bir şerit elde etmek için bölümlere başlayın.Blok boyutuna, dokunun homojenliğine ve reçine türüne bağlı olarak, şerit yaklaşık olarak düz olacaktır. Şeritleri bıçak kenarından ayırmak için kirpiğin temiz, yapışkan olmayan bir ucunu kullanın. Şeridi destek ortamının ortasına hafifçe taşımak için kirpik kullanın.Gerekirse bölümü germek için kloroform veya ısıtma kalemi kullanılabilir. Gerdikten sonra, suyu boşaltmaya başlamak için şırınnayı geri çek. Daha hassas şeritler veya daha yavaş bir su geri çekilmesi için şırınnayı hortumdan ayırarak suyun damlamasını sağlar.Su seviyesi gofret seviyesine ulaştığında, şeridi yavaşça havzanın ortasına itin ve kalan suyun tamamı havzadan tamamen çıkarılana kadar tahliyeye devam edin. Gofret temiz bir ortamda kurusun. Kurutma yaklaşık 30 dakika sürer.Numune tamamen kuruduğunda, kir kirlenmesinden korumak için diziyi sıkıca kapatılan bir kutuya aktarın. Ve kutuyu en az 30 dakika boyunca 60 santigrat derecelik bir fırına yerleştirin. Gofretteki bölüm konumlarını gösteren SEM görüntülerinin genel bir haritasını elde etmek için, bölümler şeridini kapsayan bir SEM görüntüsü elde etmek için yerleşik optik kamerayı kullanın.Mozaik oluşturmak için, örneğin kamera görüntüsünü tıklatıp sürükleyin ve otomatik alımı başlatın. Hedef yapıları bulmak için daha yüksek çözünürlükte genel bakışlar alın. Yalnızca birkaç bölümün görüntülenmesi gerekiyorsa, edinilen görüntüleri orijinal konumlarında görüntülemek için yakınlaştırılabilir görüntüleyiciyi kullanın.Yüksek çözünürlükte görüntülenmesi gereken bir bölüm belirlendikten sonra, görüntüleme bölgesi oluşturmak için tıklatın ve sürükleyin, ardından Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Ayarları'nı seçin ve ayarları bir şablonda depolayın Özellikle küçük veya tespit edilmesi zor nadir olayları bulmak için, her 10. Ardından görüntüleri gözden geçirin ve ilgi çekici bölgeyi içeren bölümleri işaretleyin. 10'dan fazla ardışık bölüm elde etmek için, tüm bölümleri otomatik olarak bulmak için bölüm bulucuyu kullanın.Genel bakış görüntüleri net ilgi alanları göstermiyorsa, bölümlerin daha yüksek çözünürlüklü görüntülerini alıp görüntüleri otomatik olarak oluşturmak ve almak için bölüm önizleme işlevini kullanın. En uygun görüntüleme ayarlarını belirlemek için mikroskop kontrol yazılımındaki canlı görüntülemeyi etkinleştirin ve ilgi çekici bir bölgeye gidin, ardından görüntüler net ilgi alanları gösterene kadar görüntüleme ayarlarını ayarlayın, ancak üreticinin yönergelerine göre aşırı uzun bir görüntü alımı olmadan. Görüntüleme bölgelerinin ardışık bölümlerdeki konumunu en iyi duruma getirmek için, ilgi alanı görüntüsüne yakınlaştırın ve kayıtlı bölüm konumlarının duyarlılığını artırmak için Konum İyileştirmeyi Başlat'ı tıklatın.Görüntüleme bölgesi tanımlamak için, Alt tuşunu basılı tutarken herhangi bir bölümü tıklatıp sürükleyin ve açılır bağlam menüsünden Döşeme Kümesi Dizisi Oluştur'u seçin. Yazılım, bulunan veya daha önce işaretlenmiş tüm bölümlerde aynı göreli konumda görüntüleme bölgeleri oluşturur. Ardından her görüntü serisinde gerektiğinde piksel sayısı, piksel boyutu, döşeme düzeni ve piksel durma süresini ayarlayın.Otomatik işlevi yapılandırmak için, gösterildiği gibi otomatik işlevler için ayrı bir görüntü serisi oluşturun ve görüntü serisini bölümde yüksek karşıtlık yapıları içeren bir konuma taşıyın. Görüntü serisini 1024 x 884 piksel olarak ayarlayın ve görüntü serisinde kullanılan en yüksek çözünürlüğe karşılık gelen bir piksel boyutu seçin. Otomatik işlevler listesinde Otomatik odaklama ve Otomatik damgalamayı kontrol edin.Edinme sırası denetimlerinde İki Bölüm'ü seçin ve otomatik işlevin görüntüsünün listedeki ilk öğe olduğunu onaylayın, ardından görüntü alımını başlatmak için Tümlerini Al'ı tıklatın. Tüm görüntüleme serileri oluşturulduğunda ve ayarlandığında, seri bir iş kuyruğunda listelenir. Düşük çözünürlüklü alım, tek veya mozaik görüntüleme kullanılarak bölümün seçilen kısımlarına veya tüm bölüme manuel veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir ve ardından dikiş atılabilir.Seçilen alandan görüntüler daha sonra mitokondri, çekirdek ve mikrovilliyi görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü parametreler kullanılarak elde edilebilir, örneğin, çözümlenmiş mozaik haritaların otomatik olarak alınması seçildikten sonra, birkaç ilgi alanı kırpılabilir veya bölgeler içinde ek yerel görüntüleme alanları tanımlamak için kullanılabilir. Drosophila bağırsağındaki farklı özel hücre tipleri rastgele dağıtılsa da, görüntüleri tek bölümlerden veya seri görüntüler topluluğu olarak yüksek çözünürlüklü parametreler kullanarak taradıktan sonra görsel olarak ayırt edilebilirler. Hizalamadan sonra, yığınlar farklı yazılım çözümleri kullanılarak işlenebilir.Dizi tomografi analizi, tek gofret üzerinde birçok sıralı bölüm oluşturulmasına ve genel ilgi alanlarını yerelleştirmek için düşük çözünürlüklü parametreler kullanılarak taranmasını sağlar. Bu alanlar, gelişmiş alım parametreleri kullanılarak daha fazla analiz için hedeflenebilir. Örneğin, notumdaki mitotik bölünmelerin ultra yapısal düzeyde lokalize etmesi kolay değildir, çünkü hücreler çekimser bölgeye göre nispeten büyüktür.Ancak bu yöntem kullanılarak, 20 ila 40 bölümlük sıçramaların otomatik orta çözünürlüklü genel bakış görüntüleri, bölünen hücreleri yerelleştirmek için kullanılabilir. Dizi tomografi prosedürü daha basit bir elektron mikroskopisi veri analizi sağlar. İzleyicileri yenilenmede ustalaşmaya ve haritalarla ilgili iş akışına aşina olmaya yatırım yapmaya teşvik ediyoruz Deneyimlerimize göre, çok az araştırma konusu tüm hayvanların veya tüm organların ultra yapısal analizini gerektirir.Yöntemimiz, hücrelerin ve dokulardaki etkileşim ortaklarının hızlı lokalizasyonuna yardımcı olur.

Research

JoVE Journal

Biology

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize&#39;a

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Zararlı etkileri, düşük basınç plazma sterilizasyon Bacillus subtilis sporlar kullanarak canlı cep mikroskobu sağkalıma soruşturma

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Elektron mikroskobu (SEM) tarama morfolojik analiz için kimyasal kurutma kullanarak prokaryotik ve ökaryotik organizmaların hazırlanması

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

Seri Blok Yüz ve Odaklanmış Iyon ışını Scan Elektron Mikroskobu Kullanılarak Yapılan Hedefli Çalışmalar

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Biyolojik Doku Örneklerinin Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...