Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

تم تمويل هذا البحث من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) Discovery Grants إلى AD و J-PP. حصلت AL و FS على جوائز NSERC CGS-M لدعم أبحاث الدراسات العليا الخاصة بهم.

1. صنع أطباق مبطنة بالسيليكون
ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة قبل التجارب. سيتم إعداد هذه الأطباق لإعداد طبق الفحص للتشريح ، ولتجارب فحص الانكماش.
<ol><li>قم بتحضير السيليكون باستخدام مجموعة مطاط صناعي من السيليكون باتباع توصيات الشركة المصنعة. امزج المكونات السائلة المكونة من ?...

عند تناول وجبة دم ، تواجه حشرات الهيماتوفاغوص تحدي المذابات الزائدة والماء في الهيموليمفاوية 2. للتعامل مع هذا ، لديهم نظام إفراز متخصص ، يتم التحكم فيه بإحكام بواسطة العوامل الهرمونية ، مما يسمح للحشرات بالبدء بسرعة في إدرار البول بعد البرانديال. يسمح فحص رامزي واستخدام الأ?...

إن الحفاظ على مستويات الملح والماء في الحشرات يسمح لها بالنجاح في العديد من المنافذ الإيكولوجية والبيئية ، باستخدام مجموعة متنوعة من استراتيجيات التغذية1. طورت معظم الحشرات آليات لتنظيم تكوين الهيموليمف ضمن حدود ضيقة من أجل تحمل التحديات المختلفة المرتبطة ببيئتها الخاصة2. غالبا ما تواجه الحشرات الأرضية تحدي الحفاظ على المياه ويخضع نظام الإخراج لمضاد لإدرار البول لمنع فقدان الماء وبعض الأملاح الأساسية ، وبالتالي تجنب الجفاف. في المقابل ، يحدث إدرار البول عندما تتغذى الحشرة ويتم تحديها بالماء الزائد والأملاح المحتملة3,4. من خلال نظام الإخراج المتخصص والنشط للغاية ، طورت الحشرات آليات تنظيمية تعمل على مواجهة تحدياتها التنظيمية الأسموزية. في بعوضة الزاعجة المصرية البالغة ، يتكون نظام الإخراج من أنابيب Malpighian (MTs) و hindgut ، والأخيرة تتكون من الدقاق الأمامي والمستقيم الخلفي5. MTs هي المسؤولة عن توليد البول الأولي ، وعادة ما تكون غنية في كلوريد الصوديوم و / أو KCl. ثم يتم تعديل البول الأساسي من خلال العمليات الإفرازية والاستيعابية أثناء انتقاله إلى أسفل مجرى النبيب ودخوله إلى القناة الهضمية الخلفية5. يمكن أن تكون الفضلات النهائية مفرطة أو ناقصة التناضح إلى الهيموليمفاوية، اعتمادا على ظروف التغذية/البيئة، ويتم إثراؤها في النفايات السامة والنيتروجينية2.
تعد MTs مثالية لدراسة العديد من ميزات السائل الظهاري والنقل المذاب لأنها تقوم بمجموعة كبيرة ومتنوعة من وظائف النقل والإخراج2,6. من خلال التنظيم الهرموني2، تعمل MTs عن طريق إفراز الأيونات والمواد المذابة الأخرى من الدم إلى تجويف النبيب7، مما يوفر تدرجا تناضحيا يسمح بنقل المياه بواسطة aquaporins8,9، والذي يخلق بشكل جماعي البول الأساسي، قبل السفر نحو القناة الهضمية الخلفية المعاد امتصاصها2. وبالتالي ، من خلال جمع السائل المفرزة من MTs المعزولة ، يمكن للمرء أن يراقب باستمرار النقل عبر الظهارية للسوائل والأيونات. يوفر قياس معدل الإفراز وتكوين البول نظرة ثاقبة على الآليات المسؤولة عن نقل الأيونات والسوائل عبر الظهارة. إحدى الطرق الشائعة لدراسة معدلات إفراز السوائل هي فحص رامزي ، الذي قدمه رامزي لأول مرة في عام 195310. في هذه الطريقة ، يتم التعامل مع الطرف البعيد (المغلق) للأنبوب بهرمون (أو مركب اختبار / دواء آخر) ، في حين يتم لف النهاية القريبة (المفتوحة) حول دبوس في زيت البارافين المشبع بالماء ، والذي يفرز البول الأساسي ، ويتراكم كقطرة على طرف الدبوس. تستطيع MTs المعزولة البقاء على قيد الحياة والعمل لفترات طويلة (تصل إلى 24 ساعة) في ظل ظروف مختبرية محسنة ، مما يجعلها نماذج مناسبة وفعالة لقياس إفراز السوائل. تحتوي الحشرات على أنظمة دوران مفتوحة ، وبالتالي يتم تشريح MTs وإزالتها بسهولة لأنها عادة ما تطفو بحرية في الهيموليمفاوية 6. بالإضافة إلى ذلك ، باستثناء حشرات المن - التي تفتقر إلى MTs11 - يمكن أن يختلف عدد MTs في نوع معين من الحشرات اختلافا كبيرا من أربعة إلى مئات (خمسة في بعوض الزاعجة) مما يسمح بإجراء قياسات متعددة من حشرة واحدة.
تتكون MTs في بعوض الزاعجة ، بالاشتراك مع الحشرات الأخرى endopterygote ، من نوعين من الخلايا التي تشكل ظهارة بسيطة2,12 ؛ الخلايا الرئيسية الكبيرة ، التي تسهل النقل النشط للكاتيونات (أي Na + و K +) إلى التجويف ، والخلايا النجمية الرقيقة ، والتي تساعد في إفراز Cl- عبر الظهارة 13. لا يتم تعصيب MTs 2 ، وبدلا من ذلك يتم تنظيمها بواسطة العديد من الهرمونات بما في ذلك العوامل المدرة للبول والمضادة لإدرار البول ، مما يسمح بالتحكم في نقل الأيونات (بشكل رئيسي Na + و K + و Cl-) والمياه الملزمة بالتناضح2. درست العديد من الدراسات التنظيم الهرموني ل Aedes MTs لفهم دور عوامل الغدد الصماء في النقل عبر الظهارة14،15،16،17،18. كما هو موضح في النتائج التمثيلية ، توضح البروتوكولات الواردة هنا آثار العوامل الهرمونية المختلفة على MTs المعزولة من إناث البعوض A. aegypti البالغة ، بما في ذلك كل من مدر للبول ومكافحة مدر للبول (الشكل 1). يستخدم فحص رامزي لإثبات كيف أن الهرمون المضاد لإدرار البول ، AedaeCAPA-1 ، يمنع إفراز السوائل من MTs الذي يحفزه هرمون مدر للبول 31 (DH31) (الشكل 1).
وقد تطلب الحجم الأصغر للحشرات تطوير طرق دقيقة لقياس النشاط الأيوني والتركيزات في عينات السوائل، أو بالقرب من سطح الأنسجة المعزولة مثل MTs والأمعاء. وقد نفذت طرق مختلفة، بما في ذلك استخدام النظائر المشعة للأيونات(19)، التي تتطلب جمع قطرات السوائل المفرزة لقياس تركيزات الأيونات(20). عادة ما تفرز أنابيب الزاعجة المحفزة في المختبر ~ 0.5 nL / min21 ، وبالتالي فإن التعامل مع هذه الأحجام الصغيرة يمكن أن يشكل تحديا وربما يؤدي إلى خطأ عند النقل. ونتيجة لذلك ، تم استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات (ISMEs) على نطاق واسع لقياس تركيزات الأيونات في قطرات مفرزة من MTs في المختبر. في هذه الطريقة ، يتم وضع قطب مرجعي و ISME ، مملوء بمحلول الردم المناسب والأيونوفور ، في قطرة البول المفرزة لتحديد تركيزات الأيونات22. يستخدم هذا البروتوكول الحالي، المقتبس من دونيني وزملائه(23)، أيونوفور انتقائي Na+لقياس النشاط الأيوني في القطرات المفرزة من MTs المحفزة في بعوض الزاعجة البالغ. وبما أن الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات تقيس النشاط الأيوني، يمكن التعبير عن هذه البيانات على أنها تركيزات أيون بعد افتراض أن محاليل المعايرة والعينات التجريبية تشترك في نفس معامل النشاط الأيوني21 (الشكل 1B,C).
تستخدم تقنية القطب الكهربائي الانتقائي للأيونات (SIET) أيضا ISMEs لقياس تدرجات تركيز الأيونات في الطبقة غير المتحركة المجاورة للأعضاء أو الأنسجة أو الخلايا التي تنقل الأيونات. تقيس ISMEs تدرجات الجهد التي يمكن استخدامها بعد ذلك لحساب تدرجات تركيز الأيونات واتجاه وحجم تدفق الأيونات عبر العضو أو الأنسجة أو الخلية20. في هذه التقنية ، يتم تركيب ISME على مناور ثلاثي المحاور يتم التحكم فيه بواسطة محركات محوسبة صغيرة السائر بحيث يتم التحكم في موقعه ثلاثي الأبعاد إلى مستوى الميكرومتر 20. يتم قياس الفولتية عند نقطتين داخل الطبقة غير المتحركة باستخدام بروتوكول أخذ العينات المبرمج والتحكم فيه بواسطة برامج الكمبيوتر. عادة ما يتم فصل النقطتين بمسافة 20-100 ميكرومتر مع نقطة واحدة داخل 5-10 ميكرومتر من سطح العضو أو النسيج أو الخلية والنقطة الثانية على بعد 20-100 ميكرومتر إضافي. يتم حساب الفرق في حجم الجهد بين النقطتين للحصول على تدرج الجهد24,25,26 ، والذي يستخدم بعد ذلك لحساب تدرج التركيز وبالتالي التدفق الصافي باستخدام قانون فيك 24,27. هذه الطريقة مفيدة لتقييم نقل أيونات محددة عبر مناطق مختلفة من أمعاء الحشرات و MTs ، أو في نقاط زمنية محددة بعد التعرض لدقيق الدم أو العلاج. على سبيل المثال، يمكن استخدام SIET لفهم كيفية تنظيم العمليات الاستيعابية والإفرازية في نظام إفراز البعوض بواسطة الهرمونات28 بالإضافة إلى سلوكيات التغذية المختلفة وظروف التربية25. وكشفت الأعمال السابقة التي استخدمت فيها SIET عن مواقع تشارك في نقل الأيونات على طول الحليمات الشرجية ومستقيم اليرقات والبعوض البالغ24،28. ويقيس البروتوكول الحالي، الذي وصفه بالوزي وزملاؤه سابقا(26)، تدفق Na+ عبر ظهارة وسادة المستقيم في المستقيم الأنثوي البالغ (الشكل 2).
يتطلب الجزء الأخير من نظام إفراز البعوض حركة عضلية منسقة للمساعدة في خلط الطعام وإفراز النفايات26. يتم تمرير المنتجات غير القابلة للامتصاص من الهضم من الأمعاء الوسطى ، إلى جانب البول الأولي الذي تفرزه MTs ، عبر الصمام البوابي وتسليمها إلى القناة الهضمية الخلفية2. تبدأ تقلصات الأمعاء الخلفية التلقائية عند الصمام البوابي وتحدث في موجات تمعجية، والتي يتم نقلها فوق الدقاق من خلال التقلص المنسق للعضلات الدائرية والطولية المحيطة بالسطح القاعدي للخلايا الظهارية26. وأخيرا ، تساعد العضلات داخل المستقيم على دفع النفايات والقضاء عليها من خلال القناة الشرجية. على الرغم من أن حركة الأمعاء الخلفية للحشرات هي عضلية المنشأ ، تتطلب Ca2 + خارج الخلية لإنتاج تقلصات تلقائية ، يمكن أيضا تنظيم هذه العمليات عصبيا26،29،30. هذا التنظيم الخارجي من قبل الجهاز العصبي مهم بعد التغذية ، حيث يجب على الحيوان طرد النفايات من الأمعاء واستعادة توازن اللمف الدموي31. ونتيجة لذلك ، فإن إجراء الفحوصات الحيوية في المختبر لتحديد الببتيدات العصبية المحفزة للعضل أو المثبطة للعضل مفيد في تقييم كيفية تأثير المواد الكيميائية العصبية على حركة الأمعاء الخلفية. يستخدم البروتوكول الحالي ، الذي أجراه Lajevardi و Paluzzi28 ، تسجيلات الفيديو لفحص الحركة اللفائفية استجابة للببتيدات العصبية (الشكل 3). وبالمثل، يمكن أيضا استخدام محول القوة أو محول المعاوقة لمراقبة آثار الانقباضات من خلال برنامج الحصول على البيانات32،33. ومع ذلك ، فإن استخدام تقنية الفيديو يسمح لنا بتقييم العضو بصريا ومواصلة التحليل باستخدام مجموعة فرعية من المعلمات لتحديد دور الهرمونات على حركة الأمعاء الخلفية.
يمكن أن يساعد استخدام هذه التقنيات في توصيف العوامل التي تنظم وتنسق نقل السوائل والأيونات على طول نظام الإخراج إلى جانب حركية الأمعاء الخلفية. الأهم من ذلك ، يتم دعم وجود صلة وظيفية بين استجابة مدر للبول بواسطة MTs وحركية الأمعاء الخلفية ، حيث تم العثور على هرمونات مدرة للبول ، مثل DH31 و 5HT ، والتي تتميز بقدرتها على تحفيز إفراز السوائل بواسطة MTs ، لإظهار إجراءات myotropic على طول البعوض hindgut21,34,35 . تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية التنسيق الصارم بين MTs و hindgut خلال أحداث مثل إدرار البول بعد الأكل في الحشرات التي تتطلب التخلص السريع من النفايات.
هنا ، يتم وصف النهج التفصيلي وراء تقنية فحص رامزي لقياس معدل إفراز السوائل في البعوض ، A. aegypti ، واستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات لتحديد تركيزات Na + داخل السائل المفرز ل MTs ، والذي يسمح عند دمجه بتحديد معدلات نقل الأيونات عبر الظهارة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف تقنية القطب الكهربائي الانتقائي للأيونات وفحوصات تقلص الأمعاء الخلفية لقياس تدفق الأيونات وحركيتها ، على التوالي ، مما يساعد على توضيح التنظيم الهرموني للأمعاء الخلفية (الشكل 4).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

وتوفر دراسات فسيولوجيا الحشرات، ولا سيما في الأنواع التي هي ناقلات لمسببات الأمراض التي تسبب الأمراض في البشر والفقاريات الأخرى، الأساس لوضع استراتيجيات جديدة لمكافحة الآفات. هنا ، يتم وصف سلسلة من الطرق التي تستخدم بشكل روتيني لتحديد الأدوار الوظيفية للببتيدات العصبية والعوامل العصبية الأخرى (أي الأمينات الحيوية المنشأ) على نظام إفراز البعوض ، الزاعجة المصرية. يمكن أن تستمر أنابيب Malpighian (MTs) ، المسؤولة عن تكوين البول الأولي ، في العمل لساعات عند إزالتها من البعوض ، مما يسمح بقياسات إفراز السوائل بعد العلاجات الهرمونية. على هذا النحو ، فإن اختبار رامزي هو تقنية مفيدة لقياس معدلات الإفراز من MTs المعزولة. يمكن استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات (ISME) بالتتابع لقياس تركيزات الأيونات (أي Na + و K +) في السائل المفرز. يسمح هذا الفحص بقياس العديد من MTs في وقت معين ، وتحديد آثار الهرمونات والأدوية المختلفة. تستخدم تقنية القطب الكهربائي الانتقائي للأيونات المسح ISME لقياس الجهد التمثيلي للنشاط الأيوني في الطبقة غير المتحركة المجاورة لسطح الأعضاء الناقلة للأيونات لتحديد النقل عبر الظهارة للأيونات في الوقت الفعلي تقريبا. يمكن استخدام هذه الطريقة لفهم دور الهرمونات وغيرها من المنظمين على امتصاص الأيونات أو إفرازها عبر الظهارة. تعد فحوصات تقلص الأمعاء الهندية أيضا أداة مفيدة لتوصيف الببتيدات العصبية النشطة عضليا ، والتي قد تعزز أو تقلل من قدرة هذا العضو على إزالة السوائل الزائدة والنفايات. بشكل جماعي ، توفر هذه الطرق نظرة ثاقبة حول كيفية تنظيم نظام الإخراج في البعوض البالغ. هذا مهم لأن التنسيق الوظيفي للأعضاء الإخراجية أمر بالغ الأهمية في التغلب على التحديات مثل إجهاد الجفاف بعد الإغلاق وقبل العثور على مضيف فقاري مناسب للحصول على وجبة دم.

يؤدي تطبيق DH31 ضد MTs غير المحفز إلى زيادة كبيرة في معدل إفراز السوائل ، مما يؤكد دوره كهرمون مدر للبول في بعوض الزاعجة (الشكل 1A). عندما يتم التعامل مع الأنابيب باستخدام AedaeCAPA-1 ، لوحظ انخفاض في معدل الإفراز في MTs المحفزة ب DH31. يوضح الشكل 1B اس...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

يحدد هذا البروتوكول المنهجيات الكامنة وراء فحص رامزي ، والأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات ، وتقنية القطب الكهربائي الانتقائي للأيونات (SIET) ومقايسات الانكماش في المختبر ، المطبقة لدراسة نظام إفراز البعوض البالغ ، المكون من أنابيب Malpighian و hindgut ، لقياس معدلات إفراز الأيونات والسوائل بشكل جماعي ، والنشاط الانقباضي ، ونقل الأيونات عبر الظهارة.

دراسة نشاط الببتيدات العصبية وغيرها من منظمات نظام الإخراج في البعوض البالغ

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

يصف هذا البروتوكول التقنيات التي يمكن استخدامها من قبل علماء فسيولوجيا الحيوانات الصغيرة لتوضيح دور الببتيدات العصبية والعوامل الهرمونية الأخرى التي تنظم الجهاز الهضمي و / أو الإخراجي. تسمح هذه التقنيات بقياسات العينات البيولوجية ذات الحجم الجزئي التي لن تكون ممكنة باستخدام تقنيات مصممة خصيصا للنماذج الحيوانية الأكبر ، بما في ذلك ، على سبيل المثال ، القوارض والتيليوس. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على تنظيم الغدد الصماء في الأمعاء ، بما في ذلك نقل العضلات الظهارية ، وكذلك العضلات الملساء المرتبطة بالجهاز الهضمي في الحشرات وفي الأنواع غير الحشرية ذات الحجم المماثل.ستوضح إجراءات البوق الكلوي للحشرات فروة سجادي ، مرشحة الدكتوراه من مختبري. بالإضافة إلى ذلك ، سيقوم طالب دراسات عليا سابق من مختبري آريان لاجيفاردي بعرض البروتوكولات التي تركز على الأمعاء الخلفية. ابدأ بإعداد أطباق رامزي وفحوصات الانكماش للتجارب.استخدم ماصة واملأ الآبار بما يصل إلى 20 ميكرولتر من المحلول. للحصول على عناصر تحكم غير محفزة ، املأ الآبار ب 20 ميكرولتر من وسط شنايدر المالحة الزاعجة. بمجرد ملء جميع الآبار ، صب الزيت المعدني المائي في طبق الفحص حتى يتم غمر الآبار ودبابيس Minutien.بعد غمر النبيب في البئر ، التقط الطرف القريب من النبيب باستخدام ملقط ، وقم بإزالته من قطرة الاستحمام ، ولف النهاية حول الدبوس. لف النبيب حول الدبوس مرتين مع الحفاظ على طول النبيب المتبقي في قطرة الاستحمام بما يتفق مع الأنابيب الأخرى. لصنع قطب دقيق انتقائي للصوديوم ، استخدم حقنة ملليلتر واحدة لردم القطب الكهربائي بكلوريد الصوديوم 100 ملليمولار.تأكد من ملء محلول الردم حتى طرف القطب الكهربائي. إذا ظهرت فقاعات الهواء ، فقم بتحريك القطب الدقيق بلطف أو قم بإزالة المحلول وإعادة تعبئته. اغمس طرف ماصة 10 ميكرولتر في محلول الأيونوفور الانتقائي للصوديوم.اصطف القطب عموديا على الماصة ، ثم ضع إصبعا قفازا فوق الجزء السفلي من الطرف لخلق ضغط وطرد قطرة صغيرة من الأيونوفور. المس بعناية قطرة الأيونوفور إلى طرف القطب الدقيق ، مع التأكد من عدم كسرها. املأ دورقا صغيرا في منتصف الطريق بكلوريد الصوديوم 100 ملليمولار وضع بعض طين النمذجة في الداخل في الجزء العلوي من الدورق.بعد أخذ الأيونوفور ، ضع طرف القطب الكهربائي على جدار الكأس ، واترك الأطراف داخل كلوريد الصوديوم. احتفظ ب ISME في الكأس حتى يصبح جاهزا للاستخدام. لجعل القطب المرجعي ISME ، ردم قطب كهربائي مع كلوريد البوتاسيوم 500 ملليمولار وتخزينه في دورق.قم بتغطية أطراف القطب باستخدام محلول يحتوي على حوالي 3.5٪ من كلوريد البولي فينيل ، المذاب في رباعي هيدروفوران ، لتجنب إزاحة الأيونوفور عند غمره في زيت البارافين. لمعايرة قطب الصوديوم ، ضع 10 قطرات ميكرولتر من تركيزات كلوريد الصوديوم القياسية على حافة طبق Ramsey مع أنابيب Malpighian المحتضنة. ضع القطرات القياسية على بعد سنتيمترين مع التركيز العالي في الأعلى.أدخل كل من القطب المرجعي والقطب الانتقائي الأيوني فوق أسلاك فضة الكلوريد واربطها بإحكام باستخدام حوامل الأقطاب الكهربائية المتصلة بالمتلاعبين الصغار. قم بالتنقل بين كلا القطبين نحو قطرة كلوريد الصوديوم التي تبلغ سعتها 200 ملليمولار باستخدام المتلاعبين الدقيقين ، مما يضمن عدم لمس الأطراف الكهربائية لأسفل الطبق. قم بتشغيل المقياس الكهربائي لبدء التسجيل واسمح للقراءة بالاستقرار.سجل القراءة واستمر إلى المعيار التالي. بعد الحصول على قياسات لمعدل إفراز السائل ، حرك بعناية الأقطاب الكهربائية الانتقائية المرجعية والأيونية إلى القطرة المفرزة باستخدام المتلاعبين الصغار. قم بتشغيل التسجيل واسمح للقراءة بالاستقرار، ثم قم بالتسجيل.قم بتشغيل مكبر الصوت IPA-2 Ion/Polarographic ومجهر الضوء وأجهزة الكمبيوتر. ضع القطب الدقيق الانتقائي للصوديوم على حامل يتكون من سلك كلوريد الفضة وقم بتوصيله بمقبس الموصل الأنثوي. قم بإزالة قطب مرجعي واحد من الكأس باستخدام كلوريد البوتاسيوم ، ووضع إصبع واحد في أحد طرفيه وإمالة الشعيرات الدموية الزجاجية نحو هذا الإصبع لمنع سقوط الآجار.ضع جانبا بعناية في الحامل ، مع ضمان عدم تشكل فقاعات. إذا كانت هناك فقاعة ، فقم بإزالة القطب المرجعي ، وأعد ملء الحامل بثلاثة كلوريد بوتاسيوم مولي وكرر. ضع حامل القطب الكهربائي في مقبس الموصل الأنثوي.بعد المعايرة ، تشريح الجهاز. ضع طبق بولي-إل-ليسين مع العينة المشوهة على مرحلة المجهر وأدخل طرف القطب المرجعي داخل المحلول الملحي. اغمر طرف القطب الدقيق الانتقائي الأيوني في المحلول الملحي ، مع الحرص على عدم كسر الطرف.استخدم مقابض الضبط اليدوية لضبط موضع القطب الدقيق أثناء النظر تحت المجهر الضوئي. اضبط الوضع الرأسي للقطب الدقيق بحيث يكون طرفه على نفس مستوى العضو أو النسيج ، ثم أدر مفتاح المحرك للتمكين. باستخدام مفاتيح أسهم الكمبيوتر، حرك القطب الدقيق أفقيا إلى موضع يبعد ثلاثة ملليمترات عن الأنسجة لقياس تسجيلات الخلفية.عندما تكون جاهزا، ابدأ التسجيل بالضغط على F5، واحصل على خمسة قياسات لنشاط الخلفية. حرك طرف القطب الدقيق بالقرب من الأنسجة مع الحرص على عدم اختراق العضو. قلل من حساسية الضربة الرئيسية لوضع طرف القطب الدقيق على بعد ميكرومترين مباشرة إلى اليمين ، عموديا على الأنسجة.احصل على ثلاثة تسجيلات في الموقع على طول لوحة المستقيم لتحديد موقع أكبر نشاط أيوني ، ثم احصل على قياسات ملحية أساسية في الموقع الذي يعرض أكبر نشاط. لتسجيل تقلصات الأمعاء الخلفية ، املأ أحد الآبار في الطبق بحجم معروف من الزاعجة المالحة. بعد التشريح ، انقل بعناية القناة الهضمية الخلفية المشوهة المرتبطة بالأمعاء الوسطى إلى بئر في طبق آخر ، مع التأكد من عدم قرصة الدقاق.غمر الأمعاء في المياه المالحة داخل البئر ووضع دبابيس Minutien في الأمعاء الوسطى والمستقيم. لا ينبغي أن يكون الدقاق تحت التوتر ويجب ملاحظة الانقباضات التلقائية التي تنشأ في صمام البواب في الدقاق الأمامي. قم بتوصيل كاميرا الفيديو بالمجهر المجسم.ثم ضع الطبق الذي يحتوي على العضو التشريحي تحت المجهر وسجل مقطع فيديو لمدة دقيقتين. يؤدي تطبيق DH31 ضد أنابيب Malpighian غير المحفزة إلى زيادة كبيرة في معدل إفراز السوائل ، مما يؤكد دوره كهرمون مدر للبول في بعوض الزاعجة. عندما يتم التعامل مع الأنابيب باستخدام AedaeCAPA-1 ، لوحظ انخفاض في معدل الإفراز في أنابيب Malpighian المحفزة DH31.تم استخدام أقطاب كهربائية انتقائية أيونية لقياس تركيزات الصوديوم في القطرات المفرزة. لم يكن لعلاج DH31 على MTs أي تأثير على تركيز الصوديوم في القطرة المفرزة. ومع ذلك ، مع تطبيق AedaeCAPA-1 ، زاد تركيز الصوديوم في السائل المفرز بشكل كبير.بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع الضوابط غير المحفزة ، أدى DH31 إلى معدل نقل صوديوم أكبر بكثير ، في حين ألغى AedaeCAPA-1 هذه الزيادة في الأنابيب المحفزة DH31. تم استخدام SIET لتقييم التغيرات في نقل الصوديوم على طول ظهارة وسادة المستقيم لإناث البعوض البالغة. تم استخدام تناظرية ليوكوكينين لفحص التغيرات في امتصاص الصوديوم ، مما أدى إلى انخفاض أربعة أضعاف في امتصاص الصوديوم مقارنة بالتحكم في محلول ملحي.لتقييم دور بيروكينين نيوروببتيد 2 على الحركة اللفائفية ، تم استخدام نظير رودنيوس بروليكسوس ، والذي ثبت سابقا أنه ينشط مستقبل A.aegypti PK2 المخصب في دقاق البعوض. بالنسبة لمستويات خط الأساس ، يمنع PK2 بشكل كبير الانقباضات اللفائفية. عند إجراء فحص رامزي باستخدام أنابيب Malpighian وقياس معدلات إفراز الأيونات أو السوائل ، من الضروري عدم تلف الأنابيب أثناء التشريح أو أثناء النقل إلى طبق الفحص.بعد فحص رامزي ، يمكن استهداف ناقلات غشائية محددة إما دوائيا أو جزيئيا باستخدام تقنيات وراثية عكسية لتمييز مساهمتها المحددة في النقل عبر الظهارة للمذابات في الظهارة البسيطة.

Research

JoVE Journal

Biology

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

حقن داخل الصفاق الى اسماك الزرد الكبار

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

النظائر مستقرة من التنميط التمويه الاستقلابية المتوسطة في مرحلة تطوير والكبار انواع معينة ايليجانس</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

افعل ذلك بنفسك جهاز لاستخراج العينات Cryopreserved سقطت سهوا في صهاريج التخزين المبردة

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging اسماك الزرد الكبار

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض،<em&gt; بحمى الضنك</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

الفسيولوجية تسجيلات وRNA تسلسل الزوائد ذوقي من البعوض الحمى الصفراء<em&gt; الزاعجة المصرية</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

قياس اليرقات آخر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مراقبة النشاط

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

التصوير إعادة التنظيم المكاني لMAPK اشارة المسار باستخدام نظام التعبير عابر التبغ

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

نظام مراسل الحرب البيولوجية لدراسة التفاعلات مستقبلات-يجند

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...