Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants til AD og J-PP. AL og FS modtog NSERC CGS-M-priser til støtte for deres kandidatforskning.

1. Fremstilling af silikoneforede retter
BEMÆRK: Dette trin skal udføres inden forsøgene. Disse retter vil blive lavet til at forberede assayskålen til dissektioner og til sammentrækningsanalyseeksperimenter.
<ol><li>Forbered silikonen ved hjælp af et silikoneelastomersæt efter producentens anbefalinger. Bland de todelte flydende komponenter i et forhold på 10 til 1. Bland forsigtigt og grundigt ved at vende om, men sørg for at minimere bobledannelsen.</li>
	<li>Hæld silikoneelasto...

Når de indtager et blodmåltid, står hæmatofaginsekter over for udfordringen med overskydende opløste stoffer og vand i deres hæmolymfe2. For at klare dette har de et specialiseret udskillelsessystem, som er tæt kontrolleret af hormonelle faktorer, så insekterne hurtigt kan starte post-prandial diurese. Ramsay-analysen og anvendelsen af ionselektive mikroelektroder gør det muligt at måle væskesekretionshastigheder sammen med ionkoncentrationer og transporthastigheder i isolerede insekt-M...

Vedligeholdelse af salt- og vandstanden i insekter giver dem mulighed for at få succes i mange økologiske og miljømæssige nicher ved hjælp af en række fodringsstrategier1. De fleste insekter har udviklet mekanismer til at regulere sammensætningen af deres hæmolymfe inden for snævre grænser for at modstå de forskellige udfordringer, der er forbundet med deres særlige miljø2. Terrestriske insekter står ofte over for udfordringen med at bevare vand, og udskillelsessystemet gennemgår antidiurese for at forhindre tab af vand og nogle vigtige salte og derfor undgå udtørring. I modsætning hertil opstår diurese, når insektet fodrer og udfordres med overskydende vand og potentielt salte3,4. Gennem deres specialiserede og meget aktive udskillelsessystem har insekter udviklet reguleringsmekanismer, der virker for at imødegå deres osmoregulerende udfordringer. Hos voksne Aedes aegypti myg består udskillelsessystemet af malpighiske tubuli (MT'er) og bagtarm, hvoraf sidstnævnte består af den forreste ileum og bageste endetarm5. MT'er er ansvarlige for at generere primær urin, normalt rig på NaCl og / eller KCl. Den primære urin modificeres derefter gennem sekretoriske og reabsorptive processer, når den bevæger sig nedstrøms for tubuli og kommer ind i bagtarme5. Den endelige udskillelse kan være hyper- eller hypoosmotisk i forhold til hæmolymfen afhængigt af fodrings-/miljøforholdene og er beriget med giftigt og nitrogenholdigt affald2.
MT'er er ideelle til at studere mange funktioner i epitelvæske og opløst transport, da de udfører et stort udvalg af transport- og udskillelsesfunktioner2,6. Gennem hormonel regulering2 fungerer MT'er ved at udskille ioner og andre opløste stoffer fra blodet i tubulilumen7, hvilket giver en osmotisk gradient, der gør det muligt at transportere vand af aquaporiner8,9, som samlet skaber den primære urin, inden de rejser mod den reabsorptive bagtarm2. Ved at opsamle den udskillede væske fra isolerede MT'er kan man således kontinuerligt overvåge transepiteltransport af væske og ioner. Måling af sekretionshastighed og urinsammensætning giver indsigt i mekanismer, der er ansvarlige for transepitelion og væsketransport. En populær metode til at studere væskesekretionshastigheder er Ramsay-analysen, som først blev introduceret af Ramsay i 195310. I denne metode behandles den distale (lukkede) ende af tubuli med et hormon (eller anden testforbindelse / lægemiddel), mens den proksimale (åbne) ende vikles rundt om en stift i vandmættet paraffinolie, som udskiller den primære urin og akkumuleres som en dråbe på spidsen af stiften. Isolerede MT'er er i stand til at overleve og fungere i lange perioder (op til 24 timer) under optimerede in vitro-forhold, hvilket gør dem til egnede og effektive modeller til måling af væskesekretion. Insekter har åbne kredsløbssystemer, så MT'erne dissekeres let og fjernes, da de normalt er frit flydende i hæmolymfen6. Derudover, med undtagelse af bladlus - som mangler MT'er11 - kan antallet af MT'er i en given insektart variere betydeligt fra fire til hundreder (fem i Aedes-myg), hvilket giver mulighed for flere målinger fra et insekt.
MT'erne i Aedes-myg, i lighed med andre endopterygoteinsekter, består af to celletyper, der danner et simpelt epitel2,12; store hovedceller, som letter aktiv transport af kationer (dvs. Na+ og K+) ind i lumen, og tynde stellatceller, som hjælper med transepitelial Cl-sekretion13. MT'erne er ikke innerverede2 og reguleres i stedet af flere hormoner, herunder både diuretiske og antidiuretiske faktorer, hvilket muliggør kontrol af iontransport (hovedsageligt Na+, K+ og Cl-) og osmotisk forpligtet vand2. Talrige undersøgelser har undersøgt den hormonelle regulering af Aedes MT'er for at forstå rollen som endokrine faktorer på transepiteltransport14,15,16,17,18. Som det fremgår af de repræsentative resultater, viser protokollerne heri virkningerne af forskellige hormonelle faktorer på isolerede MT'er fra voksne kvindelige A. aegypti myg, herunder både diuretisk og antidiuretisk kontrol (figur 1). Ramsay-analysen bruges til at demonstrere, hvordan et antidiuretisk hormon, AedaeCAPA-1, hæmmer væskesekretionen af MT'er stimuleret af diuretisk hormon 31 (DH31) (figur 1).
Den mindre størrelse af insekter har krævet udvikling af mikrometoder til måling af ionisk aktivitet og koncentrationer i væskeprøver eller nær overfladen af isolerede væv som MT'er og tarm. Der er anvendt forskellige metoder, herunder anvendelse af radioisotoper af ioner19, som kræver indsamling af de udskillede væskedråber til måling af ionkoncentrationer20. Stimulerede Aedes-tubuli in vitro udskiller typisk ~0,5 nL/min21, og håndtering af så små mængder kan derfor udgøre en udfordring og potentielt medføre fejl ved overførsel. Som følge heraf er ionselektive mikroelektroder (IME'er) blevet anvendt i vid udstrækning til at måle ionkoncentrationer i udskillede dråber af MT'er in vitro. I denne metode placeres en referenceelektrode og ISME, fyldt med den passende genopfyldningsopløsning og ionofor, i den udskillede urindråbe for at bestemme ionkoncentrationer22. Tilpasset fra Donini og kolleger23 bruger denne nuværende protokol en Na+-selektiv ionofor til at måle ionaktivitet i udskillede dråber fra stimulerede MT'er hos voksne Aedes-myg. Da ionselektive mikroelektroder måler ionaktivitet, kan disse data udtrykkes som ionkoncentrationer efter antagelsen om, at kalibreringsopløsningerne og forsøgsprøverne har samme ionaktivitetskoefficient21 (figur 1B,C).
Scanning Ion-selektiv elektrodeteknik (SIET) gør også brug af IME'er til at måle ionkoncentrationsgradienter i det ustirrede lag ved siden af organer, væv eller celler, der transporterer ioner. IME'erne måler spændingsgradienter, som derefter kan bruges til at beregne ionkoncentrationsgradienterne og retningen og størrelsen af ionfluxen over organet, vævet eller cellen20. I denne teknik er ISME monteret på en manipulator med tre akser, der styres af computerstyrede mikrosteppermotorer, så dens 3D-position styres til mikrometerniveauet20. Spændinger måles på to punkter i det urørte lag ved hjælp af en prøveudtagningsprotokol programmeret ind i og styret af computersoftware. De to punkter er typisk adskilt af en afstand på 20-100 μm med et punkt inden for 5-10 μm fra overfladen af organet, vævet eller cellen og det andet punkt yderligere 20-100 μm væk. Forskellen i spændingsstørrelse mellem de to punkter beregnes for at opnå en spændingsgradient24,25,26, som derefter bruges til at beregne koncentrationsgradienten og efterfølgende nettofluxen ved hjælp af Ficks lov24,27. Denne metode er nyttig til vurdering af transport af specifikke ioner på tværs af forskellige områder af insekttarmen og MT'erne eller på bestemte tidspunkter efter en blodmel- eller behandlingseksponering. SIET kan f.eks. bruges til at forstå, hvordan absorberende og sekretoriske processer i myggeudskillelsessystemet reguleres af hormoner28 samt forskellig fodringsadfærd og opdrætsforhold25. Tidligere arbejde med at udnytte SIET afslørede steder, der var involveret i iontransport langs analpapiller og endetarm af larve og voksne myg24,28. Den nuværende protokol, der tidligere er beskrevet af Paluzzi og kolleger26, måler Na+ flux på tværs af rektalpudeepitel i den voksne kvindelige endetarm (figur 2).
Det sidste segment af myggeudskillelsessystemet kræver koordineret muskelbevægelse for at hjælpe med at blande mad og udskille affald26. Ikke-absorberbare fordøjelsesprodukter fra midgut sammen med primær urin udskilt af MT'erne føres gennem pylorventilen og leveres til bagtargut2. Spontane baggutkontraktioner begynder ved pylorventilen og forekommer i peristaltiske bølger, som videresendes over ileum gennem den koordinerede sammentrækning af cirkulære og langsgående muskler, der omgiver epitelcellernes basale overflade26. Endelig hjælper musklerne i endetarmen med at drive og eliminere affald gennem analkanalen. Selvom insekt bagtarm motilitet er myogen, hvilket kræver ekstracellulær Ca2+ for at producere spontane sammentrækninger, kan disse processer også reguleres neuronalt26,29,30. Denne eksogene regulering af nervesystemet er vigtig efter fodring, da dyret skal udvise affald fra tarmen og genoprette hæmolymfebalancen31. Som følge heraf er det nyttigt at udføre in vitro-bioassays for at identificere myostimulerende eller myoinhibitoriske neuropeptider til at vurdere, hvordan neurokemikalier påvirker bagtarmtiliteten. Den nuværende protokol, udført af Lajevardi og Paluzzi28, bruger videooptagelser til at undersøge ileal motilitet som reaktion på neuropeptider (figur 3). Tilsvarende kan en krafttransducer eller impedanskonverter også anvendes til at observere spor af sammentrækninger gennem en dataindsamlingssoftware32,33. Brug af videoteknologi giver os imidlertid mulighed for visuelt at vurdere organet og yderligere analysere ved hjælp af en delmængde af parametre for at identificere hormonernes rolle på bagtarmsmotiliteten.
Brug af disse teknikker kan hjælpe med at karakterisere faktorer, der regulerer og koordinerer væske- og iontransport langs udskillelsessystemet sammen med bagtarmsmotilitet. Det er vigtigt, at en funktionel forbindelse mellem MT'ernes diuretiske respons og baggutmotilitet understøttes, da diuretiske hormoner, såsom DH31 og 5HT, der er kendetegnet ved deres evne til at stimulere væskesekretion af MT'erne, også har vist sig at udvise myotrope virkninger langs myggenes baggut21,34,35 . Disse resultater understreger betydningen af streng koordinering mellem MT'erne og bagtargut under begivenheder som post-prandial diurese hos insekter, der kræver hurtig eliminering af affald.
Heri beskrives den detaljerede tilgang bag Ramsay-analyseteknikken til måling af væskesekretionshastighed i myggen, A. aegypti, og brugen af ionselektive mikroelektroder til bestemmelse af Na+ -koncentrationer inden for MT'ernes udskillede væske, som ved kombination gør det muligt at bestemme transepiteliontransporthastigheder. Derudover beskrives scanningsionselektiv elektrodeteknik og bagtarmskontraktionsassays for at måle henholdsvis ionflux og bevægelighed, hvilket hjælper med at belyse hormonel regulering af bagtarden (figur 4).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

Undersøgelser af insektfysiologi, især hos de arter, der er vektorer af patogener, der forårsager sygdom hos mennesker og andre hvirveldyr, danner grundlag for at udvikle nye strategier for bekæmpelse af skadegørere. Her beskrives en række metoder, der rutinemæssigt anvendes til at bestemme neuropeptidernes og andre neuronale faktorers funktionelle roller (dvs. biogene aminer) på myggens udskillelsessystem, Aedes aegypti. De malpighiske tubuli (MT'er), der er ansvarlige for primær urindannelse, kan fortsætte med at fungere i timevis, når de fjernes fra myggen, hvilket muliggør væskesekretionsmålinger efter hormonbehandlinger. Som sådan er Ramsay-analysen en nyttig teknik til måling af sekretionshastigheder fra isolerede MT'er. Ionselektive mikroelektroder (ISME) kan sekventielt anvendes til at måle ionkoncentrationer (dvs. Na + og K +) i den udskillede væske. Dette assay gør det muligt at måle flere MT'er på et givet tidspunkt og bestemme virkningerne af forskellige hormoner og lægemidler. Scanningsionselektiv elektrodeteknik bruger ISME til at måle spænding, der er repræsentativ for ionisk aktivitet i det ustirrede lag ved siden af overfladen af iontransporterende organer for at bestemme transepiteltransport af ioner i næsten realtid. Denne metode kan bruges til at forstå hormoners og andre regulatorers rolle på ionabsorption eller sekretion på tværs af epitel. Hindgut sammentrækningsassays er også et nyttigt redskab til at karakterisere myoaktive neuropeptider, der kan forbedre eller reducere dette organs evne til at fjerne overskydende væske og affald. Samlet set giver disse metoder indsigt i, hvordan udskillelsessystemet reguleres hos voksne myg. Dette er vigtigt, fordi funktionel koordinering af udskillelsesorganerne er afgørende for at overvinde udfordringer som udtørringsstress efter eklosion og før man finder en passende hvirveldyrvært for at opnå et blodmel.

Anvendelse af DH31 mod ustimulerede MT'er resulterer i en signifikant stigning i væskesekretionshastigheden, hvilket bekræfter dets rolle som et diuretisk hormon i Aedes-myg (figur 1A). Når tubuli behandles med AedaeCAPA-1, observeres en reduktion i sekretionshastigheden i DH31-stimulerede MT'er. Figur 1B viser brugen af ionselektive elektroder til måling af Na+ -koncentrationer i de udskillede dråber. Beha...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Denne protokol skitserer metoder bag Ramsay-assayet, ionselektive mikroelektroder, scanningsionselektiv elektrodeteknik (SIET) og in vitro-kontraktionsassays, der anvendes til at studere det voksne myggeudskillelsessystem, der består af malpighiske tubuli og bagtarm, til kollektivt at måle ion- og væskesekretionshastigheder, kontraktil aktivitet og transepiteliontransport.

Undersøgelse af aktiviteten af neuropeptider og andre regulatorer af udskillelsessystemet i den voksne myg

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Denne protokol beskriver teknikker, der kan bruges af smådyrsfysiologer til at belyse neuropeptidernes rolle og andre hormonelle faktorer, der regulerer fordøjelsessystemet og eller udskillelsessystemet. Disse teknikker gør det muligt at måle biologiske prøver i mikrostørrelse, som ellers ikke ville være mulige, ved hjælp af teknikker, der er designet specielt til større dyremodeller, herunder f.eks. gnavere og teleus. Denne metode kan give indsigt i tarmens endokrine regulering, herunder transport af epitel, samt glatte muskler forbundet med mave-tarmkanalen hos insekter og i lignende størrelse ikke-insektarter.Farwa Sajadi, en ph.d.-kandidat fra mit laboratorium, demonstrerer insektets nyretubalprocedurer. Derudover vil en tidligere kandidatstuderende fra mit laboratorium Aryan Lajevardi demonstrere de bagtarmsfokuserede protokoller. Begynd med at forberede Ramsay- og sammentrækningsanalyseretterne til eksperimenterne.Brug pipette og fyld brønde med op til 20 mikroliter opløsning. For ustimulerede kontroller skal brøndene fyldes med 20 mikroliter Aedes saltvand Schneiders medium. Når alle brønde er fyldt, hældes hydreret mineralolie i assayskålen, indtil brøndene og Minutien-stifterne er nedsænket.Efter nedsænkning af tubuli i brønden skal du hente den proksimale ende af tubuli med tang, fjerne den fra badedråben og vikle enden rundt om stiften. Pak tubuli rundt om stiften to gange, så længden af tubuli, der er tilbage i badedråben, er i overensstemmelse med de andre rør. For at fremstille en natriumselektiv mikroelektrode skal du bruge en sprøjte på en milliliter til at genopfylde elektroden med 100 millimolært natriumchlorid.Sørg for, at genopfyldningsopløsningen fyldes, indtil spidsen af elektroden. Hvis der vises luftbobler, skal du forsigtigt svirpe mikroelektroden eller fjerne opløsningen og genopfylde. Dyp en 10 mikroliter pipettespids i den natriumselektive ionophoropløsning.Stil elektroden vinkelret på pipetten, og læg derefter en behandsket finger over bunden af spidsen for at skabe tryk og udvise en lille dråbe ionofor. Rør forsigtigt dråben af ionofor til mikroelektrodespidsen, og sørg for ikke at bryde den. Fyld et lille bægerglas halvvejs med 100 millimolært natriumchlorid og læg noget modellervoks på indersiden øverst på bægerglasset.Når iioforen er taget op, anbringes elektrodespidsen ned på bægerglasvæggen, så spidserne i natriumchloridet slippes. Opbevar ISME i bægerglasset, indtil det er klar til brug. For at fremstille ISME-referenceelektroden skal du fylde en elektrode med 500 millimolært kaliumchlorid og opbevare den i et bægerglas.Belæg elektrodespidserne ved hjælp af en opløsning af ca. 3,5% polyvinylchlorid, opløst i tetrahydrofuran, for at undgå forskydning af ionoforen, når den nedsænkes i paraffinolie. For at kalibrere natriumelektroden skal du placere 10 mikroliterdråber natriumchloridstandardkoncentrationer på kanten af Ramsey-skålen med de inkuberede malpighiske tubuli. Placer standarddråberne to centimeter fra hinanden med den højere koncentration ovenpå.Indsæt både referenceelektroden og den ionselektive elektrode over kloridsølvtrådene, og fastgør dem sikkert ved hjælp af elektrodeholdere, der er fastgjort til mikromanipulatorer. Naviger begge elektroderne mod den 200 millimolære natriumchloriddråbe ved hjælp af mikromanipulatorerne, hvilket sikrer, at elektrospidserne ikke rører bunden af skålen. Tænd for elektrometeret for at starte optagelsen, og lad aflæsningen stabilisere sig.Optag læsningen, og fortsæt til næste standard. Efter at have opnået målinger af væskesekretionshastigheden, skal du forsigtigt flytte reference- og ionselektive elektroderne ind i den udskillede dråbe ved hjælp af mikromanipulatorerne. Tænd for optagelsen, og lad læsningen stabilisere sig, og optag derefter.Tænd for IPA-2 Ion/Polarographic Amplifier, lysmikroskopet og computerne. Anbring den natriumselektive mikroelektrode på en holder bestående af en sølvchloridtråd, og fastgør den i det kvindelige stikstik. Fjern en referenceelektrode fra bægerglasset med kaliumchloridet, anbring en finger i den ene ende og vip glaskapillæren mod denne finger for at forhindre, at agaren falder ud.Placer forsigtigt den ene ende i holderen, og sørg for, at der ikke dannes bobler. Hvis der er en boble, skal du fjerne referenceelektroden, genopfylde holderen med tre molære kaliumchlorid og gentage. Anbring elektrodeholderen i det kvindelige stikstik.Efter kalibrering dissekeres organet. Anbring poly-L-lysindskålen med den dissekerede prøve på mikroskoptrinnet, og indsæt spidsen af referenceelektroden inde i saltvandet. Nedsænk spidsen af den ionselektive mikroelektrode i saltvandet, og pas på ikke at bryde spidsen.Brug de manuelle justeringsknapper til at justere mikroelektrodepositionen, mens du kigger under lysmikroskopet. Juster mikroelektrodens lodrette position, så dens spids er på samme plan som organet eller vævet, og drej derefter motorkontakten for at aktivere. Brug computerens piletaster til at flytte mikroelektroden vandret til en position tre millimeter væk fra vævet for at måle baggrundsoptagelser.Når du er klar, skal du begynde at optage ved at trykke på F5, få fem målinger af baggrundsaktivitet. Flyt mikroelektrodespidsen tæt på vævet, og pas på ikke at gennembore organet. Reducer følsomheden for tastehit for at placere mikroelektrodespidsen to mikrometer direkte til højre, vinkelret på vævet.Få tre optagelser på stedet langs rektalpuden for at identificere stedet for den største ionaktivitet, og få derefter baseline saltvandsmålinger på det sted, der viser størst aktivitet. For at registrere bagtarmskontraktioner skal du fylde en af brøndene i fadet med et kendt volumen Aedes saltvand. Efter dissektion skal du forsigtigt overføre den dissekerede bagtarm, der er fastgjort til den midterste tarm, til en brønd i en anden skål, og sørg for ikke at klemme ileum.Nedsænk tarmen i saltvandet inde i brønden og læg Minutien stifter i midten af tarmen og endetarmen. Ileum bør ikke være under spænding, og spontane sammentrækninger med oprindelse i pylorventilen ved det forreste ileum skal observeres. Tilslut videokameraet til det stereoskopiske mikroskop.Placer derefter skålen, der indeholder det dissekerede organ under mikroskopet, og optag en video i to minutter. Anvendelse af DH31 mod ustimulerede malpighiske tubuli resulterer i en signifikant stigning i væskesekretionshastigheden, hvilket bekræfter dets rolle som et diuretisk hormon i Aedes myg. Når tubuli behandles med AedaeCAPA-1, observeres en reduktion i sekretionshastigheden i DH31-stimulerede malpighiske tubuli.Ionselektive elektroder blev brugt til at måle natriumkoncentrationer i de udskillede dråber. Behandling af DH31 på MT'erne havde ingen effekt på natriumkoncentrationen i den udskillede dråbe. Ved anvendelse af AedaeCAPA-1 blev natriumkoncentrationen i den udskillede væske imidlertid signifikant forøget.Sammenlignet med ustimulerede kontroller førte DH31 desuden til en signifikant større natriumtransporthastighed, mens AedaeCAPA-1 afskaffede denne stigning i DH31-stimulerede tubuli. SIET blev brugt til at vurdere ændringer i natriumtransport langs rektalpudeepitelet hos voksne kvindelige myg. En leucokininanalog blev brugt til at undersøge ændringer i natriumabsorption, hvilket resulterede i et firedobbelt fald i natriumabsorptionen sammenlignet med saltvandskontrol.For at vurdere rollen som et neuropeptid pyrokinin2 på ileal motilitet blev der anvendt en Rhodnius prolixus-analog, som tidligere viste sig at aktivere A.aegypti PK2-receptoren beriget i myggeileum. I forhold til baseline-niveauer hæmmer PK2 signifikant ileale sammentrækninger. Når du udfører et Ramsay-assay med malpighiske tubuli og måler ion- eller væskesekretionshastigheder, er det bydende nødvendigt, at tubuli ikke beskadiges under dissektion eller under overførslen til assayskålen.Efter Ramsay-analysen kan specifikke membrantransportører målrettes enten farmakologisk eller molekylært ved hjælp af omvendte genetiske teknikker til at skelne deres specifikke bidrag til transepiteltransport af opløste stoffer i det enkle epitel.

Research

JoVE Journal

Biology

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gør-det-selv enhed for inddrivelse af Kryopræserverede Prøver uheld faldt i Kryogene lagertanke

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Voksen Zebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

En eksperimentel og Bioinformatik Protokol for RNA-seq Analyser af Fotoperiodisk diapause i den asiatiske Tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fysiologiske Recordings og RNA-sekventering af smags- Vedhæng i gul-feber Mosquito<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Måling af Larve aktivitet i<em&gt; Drosophila</em&gt; Aktivitetsovervågning

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Rumlig Reorganisering af et MAPK signalvej Brug af tobak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

En BW Reporter System for at studere Receptor-Ligand interaktioner

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...