Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants aan AD en J-PP. AL en FS ontvingen NSERC CGS-M awards ter ondersteuning van hun graduate onderzoek.

1. Met siliconen beklede gerechten maken
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd voorafgaand aan de experimenten. Deze gerechten zullen worden gemaakt om de assay-schotel te bereiden voor dissecties en voor contractie-assay-experimenten.
<ol><li>Bereid de siliconen voor met behulp van een siliconen elastomeerkit volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Meng de tweedelige vloeibare componenten in een verhouding van 10 tot 1. Meng voorzichtig en grondig door om te keren, maar zorg ervoor...

Bij het innemen van een bloedmaaltijd worden hematofagusinsecten geconfronteerd met de uitdaging van overtollige opgeloste stoffen en water in hun hemolymfe2. Om dit het hoofd te bieden, hebben ze een gespecialiseerd uitscheidingssysteem, dat strak wordt gecontroleerd door hormonale factoren, waardoor de insecten snel postprandidese kunnen initiëren. De Ramsay-test en het gebruik van ionselectieve micro-elektroden maken het mogelijk om de vloeistofsecretiesnelheden te meten, samen met ionenconcen...

Handhaving van zout- en waterniveaus bij insecten stelt hen in staat om te slagen in vele ecologische en ecologische niches, met behulp van een verscheidenheid aan voedingsstrategieën1. De meeste insecten hebben mechanismen ontwikkeld om de samenstelling van hun hemolymfe binnen nauwe grenzen te reguleren om de verschillende uitdagingen in verband met hun specifieke omgeving te weerstaan2. Terrestrische insecten worden vaak geconfronteerd met de uitdaging om water te besparen en het uitscheidingssysteem ondergaat anti-diurese om verlies van water en enkele essentiële zouten te voorkomen, waardoor uitdroging wordt vermeden. Diurese treedt daarentegen op wanneer het insect zich voedt en wordt uitgedaagd met overtollig water en mogelijk zouten3,4. Door hun gespecialiseerde en zeer actieve uitscheidingssysteem hebben insecten regulerende mechanismen ontwikkeld die werken om hun osmoregulatoire uitdagingen tegen te gaan. Bij volwassen Aedes aegypti-muggen bestaat het uitscheidingssysteem uit de Malpighian tubuli (MT's) en hindgut, waarvan de laatste bestaat uit het voorste ileum en het achterste rectum5. MT's zijn verantwoordelijk voor het genereren van primaire urine, meestal rijk aan NaCl en / of KCl. De primaire urine wordt vervolgens gemodificeerd door secretoire en reabsorptieve processen terwijl deze stroomafwaarts van de tubulus reist en het achtergut5 binnengaat. De uiteindelijke uitwerpselen kunnen hyper- of hypoosmotisch zijn voor de hemolymfe, afhankelijk van de voedings-/omgevingsomstandigheden, en zijn verrijkt met toxische en stikstofhoudende afvalstoffen2.
MT's zijn ideaal voor het bestuderen van vele kenmerken van epitheelvloeistof en opgeloste stoftransport omdat ze een grote verscheidenheid aan transport- en excretiefuncties uitvoeren2,6. Door hormonale regulatie2 functioneren MT's door ionen en andere opgeloste stoffen uit het bloed af te scheiden in het tubuluslumen7, waardoor een osmotische gradiënt ontstaat waardoor water kan worden getransporteerd door aquaporinen8,9, die gezamenlijk de primaire urine creëren, voordat ze naar het reabsorptieve achtergut2 reizen. Dus, door het verzamelen van de uitgescheiden vloeistof van geïsoleerde MT's, kan men continu het transepitheliale transport van vloeistof en ionen controleren. Het meten van secretiesnelheid en urinesamenstelling geeft inzicht in mechanismen die verantwoordelijk zijn voor transepitheliaal ionen- en vloeistoftransport. Een populaire methode voor het bestuderen van vloeistofsecretiesnelheden is de Ramsay-test, die voor het eerst werd geïntroduceerd door Ramsay in 195310. Bij deze methode wordt het distale (gesloten) uiteinde van de tubulus behandeld met een hormoon (of een ander testmiddel / medicijn), terwijl het proximale (open) uiteinde rond een speld in met water verzadigde paraffineolie wordt gewikkeld, die de primaire urine afscheidt en zich ophoopt als een druppel op de punt van de pin. Geïsoleerde MT's kunnen overleven en functioneren gedurende lange perioden (tot 24 uur) onder geoptimaliseerde in vitro omstandigheden, waardoor ze geschikte en efficiënte modellen zijn voor vloeistofsecretiemeting. Insecten hebben een open bloedsomloop, dus de MT's kunnen gemakkelijk worden ontleed en verwijderd omdat ze meestal vrij in de hemolymfe zweven6. Bovendien, met uitzondering van bladluizen - die geen MT's11 hebben - kan het aantal MT's in een bepaalde insectensoort aanzienlijk variëren van vier tot honderden (vijf in Aedes-muggen) waardoor meerdere metingen van één insect mogelijk zijn.
De MT's in Aedes-muggen zijn, net als andere endopterygote-insecten, samengesteld uit twee celtypen die een eenvoudig epitheel vormen2,12; grote hoofdcellen, die actief transport van kationen (d.w.z. Na + en K +) naar het lumen vergemakkelijken, en dunne stellaatcellen, die helpen bij transepitheliale Cl-secretie13. De MT's worden niet geïnnerveerd2, maar worden in plaats daarvan gereguleerd door verschillende hormonen, waaronder zowel diuretische als antidiuretische factoren, waardoor de controle van ionentransport (voornamelijk Na +, K + en Cl-) en osmotisch verplicht water2 mogelijk is. Talrijke studies hebben de hormonale regulatie van Aedes MT's onderzocht om de rol van endocriene factoren op transepitheliaal transport14,15,16,17,18 te begrijpen. Zoals te zien is in de representatieve resultaten, tonen de protocollen hierin de effecten aan van verschillende hormonale factoren op geïsoleerde MT's van volwassen vrouwelijke A. aegypti-muggen, waaronder zowel diuretische als antidiuretische controle (figuur 1). De Ramsay-test wordt gebruikt om aan te tonen hoe een antidiuretisch hormoon, AedaeCAPA-1, de vochtafscheiding van MT's remt die worden gestimuleerd door diureticumhormoon 31 (DH31) (figuur 1).
De kleinere omvang van insecten heeft de ontwikkeling van micromethoden vereist voor het meten van ionische activiteit en concentraties in vloeistofmonsters, of in de buurt van het oppervlak van geïsoleerde weefsels zoals de MT's en de darm. Er zijn verschillende methoden geïmplementeerd, waaronder het gebruik van radio-isotopen van ionen19, waarvoor het verzamelen van de uitgescheiden vloeistofdruppels nodig is voor het meten van ionenconcentraties20. Gestimuleerde Aedes-tubuli scheiden in vitro meestal ~ 0,5 nL / min21 af, dus het verwerken van dergelijke kleine volumes kan een uitdaging vormen en mogelijk fouten veroorzaken bij overdracht. Als gevolg hiervan zijn ionselectieve micro-elektroden (ISME's) op grote schaal gebruikt om ionenconcentraties in uitgescheiden druppels VAN MT's in vitro te meten. Bij deze methode worden een referentie-elektrode en ISME, gevuld met de juiste opvuloplossing en ionofoor, in de uitgescheiden urinedruppel geplaatst om de ionenconcentraties te bepalen22. Aangepast van Donini en collega's23, gebruikt dit huidige protocol een Na + -selectieve ionofoor om ionenactiviteit te meten in uitgescheiden druppels van gestimuleerde MT's bij volwassen Aedes-muggen. Aangezien ionselectieve micro-elektroden de ionenactiviteit meten, kunnen deze gegevens worden uitgedrukt als ionconcentraties na de veronderstelling dat de kalibratieoplossingen en experimentele monsters dezelfde ionenactiviteitscoëfficiënt delen21 (figuur 1B,C).
De Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) maakt ook gebruik van ISME's om ionenconcentratiegradiënten te meten in de niet-gestirreerde laag naast organen, weefsels of cellen die ionen transporteren. De ISME's meten spanningsgradiënten die vervolgens kunnen worden gebruikt om de ionenconcentratiegradiënten en richting en grootte van ionenflux over het orgaan, weefsel of cel20 te berekenen20. Bij deze techniek wordt de ISME gemonteerd op een manipulator met drie assen die wordt bestuurd door geautomatiseerde microstapmotoren, zodat de 3D-positie wordt geregeld tot op micrometerniveau20. Spanningen worden gemeten op twee punten binnen de niet-gestirreerde laag met behulp van een bemonsteringsprotocol dat is geprogrammeerd in en bestuurd door computersoftware. De twee punten worden meestal gescheiden door een afstand van 20-100 μm met één punt binnen 5-10 μm van het oppervlak van het orgaan, weefsel of cel en het tweede punt nog eens 20-100 μm afstand. Het verschil in grootte van de spanningen tussen de twee punten wordt berekend om een spanningsgradiënt24,25,26 te verkrijgen, die vervolgens wordt gebruikt om de concentratiegradiënt en vervolgens de nettoflux te berekenen met behulp van de Wet van Fick24,27. Deze methode is nuttig voor het beoordelen van het transport van specifieke ionen over verschillende regio's van de insectendarm en MT's, of op specifieke tijdstippen na blootstelling aan bloedmeel of behandeling. De SIET kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te begrijpen hoe absorberende en secretoire processen in het uitscheidingssysteem van muggen worden gereguleerd door hormonen28, evenals verschillende voedingsgedragingen en opfokomstandigheden25. Eerder werk met behulp van de SIET onthulde locaties die betrokken zijn bij ionentransport langs de anale papillen en het rectum van larvale en volwassen muggen24,28. Het huidige protocol, eerder beschreven door Paluzzi en collega's26, meet de Na+ flux over de rectale pad epithelia van het volwassen vrouwelijke rectum (figuur 2).
Het laatste segment van het uitscheidingssysteem van de mug vereist gecoördineerde spierbewegingen om voedsel te mengen en afval af te scheiden26. Niet-absorbeerbare producten van de spijsvertering uit het middendarm, samen met primaire urine die door de MT's wordt uitgescheiden, worden door de pylorusklep geleid en aan het achtergut afgegeven2. Spontane achterbeencontracties beginnen bij de pylorusklep en komen voor in peristaltische golven, die over het ileum worden doorgegeven door de gecoördineerde samentrekking van cirkelvormige en longitudinale spieren rond het basale oppervlak van epitheelcellen26. Ten slotte helpen de spieren in het rectum om afvalstoffen door het anale kanaal voort te stuwen en te elimineren. Hoewel de beweeglijkheid van het achterdarm van insecten myogeen is en extracellulaire Ca2+ nodig heeft om spontane weeën te produceren, kunnen deze processen ook neuronaal worden gereguleerd26,29,30. Deze exogene regulatie door het zenuwstelsel is belangrijk na het voeden, omdat het dier afvalstoffen uit de darm moet verdrijven en het hemolymfeevenwicht moet herstellen31. Als gevolg hiervan is het uitvoeren van in vitro bioassays om myostimulerende of myoinhibitory neuropeptiden te identificeren nuttig bij het beoordelen van hoe neurochemicaliën de beweeglijkheid van hindgut beïnvloeden. Het huidige protocol, uitgevoerd door Lajevardi en Paluzzi28, maakt gebruik van video-opnames om de ileale motiliteit in reactie op neuropeptiden te onderzoeken (figuur 3). Evenzo kan een krachtomvormer of impedantieomvormer ook worden gebruikt om sporen van samentrekkingen te observeren via een data-acquisitiesoftware32,33. Het gebruik van videotechnologie stelt ons echter in staat om het orgaan visueel te beoordelen en verder te analyseren met behulp van een subset van parameters om de rol van hormonen op de beweeglijkheid van het achterbeen te identificeren.
Het gebruik van deze technieken kan helpen bij het karakteriseren van factoren die het vloeistof- en ionentransport langs het uitscheidingssysteem reguleren en coördineren, samen met de beweeglijkheid van het achterdarm. Belangrijk is dat een functioneel verband tussen de diuretische respons door de MT's en de beweeglijkheid van het achterdarm wordt ondersteund, aangezien diuretische hormonen, zoals DH31 en 5HT, gekenmerkt door hun vermogen om vochtafscheiding door de MT's te stimuleren, ook myotrope acties langs de muggenachterdarm vertonen21,34,35 . Deze bevindingen benadrukken het belang van strikte coördinatie tussen de MT's en hindgut tijdens gebeurtenissen zoals postprandiese bij insecten die een snelle afvalverwijdering vereisen.
Hierin wordt de gedetailleerde benadering achter de Ramsay-testtechniek beschreven om de vloeistofsecretiesnelheid in de mug, A. aegypti, te meten en het gebruik van ionselectieve micro-elektroden om Na + -concentraties in de uitgescheiden vloeistof van de MT's te bepalen, waardoor in combinatie transepitheliale ionentransportsnelheden kunnen worden bepaald. Daarnaast worden de Scanning Ion-selective Electrode Technique en hindgut contraction assays beschreven om respectievelijk ionenflux en motiliteit te meten, wat helpt om de hormonale regulatie van het achterbeen op te helderen (figuur 4).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

Studies van insectenfysiologie, met name in die soorten die vectoren zijn van pathogenen die ziekte veroorzaken bij mensen en andere gewervelde dieren, bieden de basis om nieuwe strategieën voor ongediertebestrijding te ontwikkelen. Hier wordt een reeks methoden beschreven die routinematig worden gebruikt om de functionele rollen van neuropeptiden en andere neuronale factoren (d.w.z. biogene aminen) op het uitscheidingssysteem van de mug, Aedes aegypti, te bepalen. De Malpighian tubuli (MT's), verantwoordelijk voor de primaire urinevorming, kunnen urenlang blijven functioneren wanneer ze uit de mug worden verwijderd, waardoor vloeistofsecretiemetingen na hormoonbehandelingen mogelijk zijn. Als zodanig is de Ramsay-test een nuttige techniek om secretiesnelheden te meten van geïsoleerde MT's. Ionselectieve micro-elektroden (ISME) kunnen achtereenvolgens worden gebruikt om ionconcentraties (d.w.z. Na + en K +) in de uitgescheiden vloeistof te meten. Deze test maakt het mogelijk om op een bepaald moment verschillende MT's te meten en de effecten van verschillende hormonen en geneesmiddelen te bepalen. De Scanning Ion-selective Electrode Technique maakt gebruik van ISME om spanning te meten die representatief is voor ionische activiteit in de ongestirreerde laag naast het oppervlak van iontransporterende organen om transepitheliaal transport van ionen in bijna realtime te bepalen. Deze methode kan worden gebruikt om de rol van hormonen en andere regulatoren op ionabsorptie of secretie over epithelia te begrijpen. Hindgut contractie assays zijn ook een nuttig hulpmiddel om myoactieve neuropeptiden te karakteriseren, die het vermogen van dit orgaan om overtollig vocht en afval te verwijderen kunnen verbeteren of verminderen. Gezamenlijk geven deze methoden inzicht in hoe het uitscheidingssysteem wordt gereguleerd bij volwassen muggen. Dit is belangrijk omdat functionele coördinatie van de uitscheidingsorganen cruciaal is bij het overwinnen van uitdagingen zoals uitdrogingsstress na eclosie en voor het vinden van een geschikte gewervelde gastheer om een bloedmeel te verkrijgen.

Toepassing van DH31 tegen niet-gestimuleerde MT's resulteert in een significante toename van de vochtsecretiesnelheid, wat de rol ervan als diuretisch hormoon bij Aedes-muggen bevestigt (figuur 1A). Wanneer tubuli worden behandeld met AedaeCAPA-1, wordt een vermindering van de secretiesnelheid waargenomen in DH31-gestimuleerde MT's. Figuur 1B toont het gebruik van ionselectieve elektroden om Na + -concentraties ...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Dit protocol schetst methodologieën achter de Ramsay-assay, ionselectieve micro-elektroden, Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) en in vitro contractie-assays, toegepast om het uitscheidingssysteem van volwassen muggen te bestuderen, bestaande uit de Malpighian tubuli en hindgut, om gezamenlijk ionen- en vloeistofsecretiesnelheden, contractiele activiteit en transepitheliaal ionentransport te meten.

Het bestuderen van de activiteit van neuropeptiden en andere regulatoren van het uitscheidingssysteem in de volwassen mug

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Dit protocol beschrijft technieken die kunnen worden gebruikt door fysiologen van kleine dieren om de rol van neuropeptiden en andere hormonale factoren die het spijsverterings- en of uitscheidingssysteem reguleren, op te helderen. Deze technieken maken het mogelijk om biologische monsters van microformaat te meten die anders niet mogelijk zouden zijn met behulp van technieken die speciaal zijn ontworpen voor grotere diermodellen, waaronder bijvoorbeeld knaagdieren en teleus. Deze methode kan inzicht geven in de endocriene regulatie van de darm, inclusief het transporteren van epitheel, evenals gladde spieren geassocieerd met het maagdarmkanaal bij insecten en bij niet-insectensoorten van vergelijkbare grootte.Farwa Sajadi, een promovendus uit mijn laboratorium, demonstreert de renale tubale procedures van insecten. Daarnaast zal een voormalige afgestudeerde student van mijn lab Aryan Lajevardi de op hindgut gerichte protocollen demonstreren. Begin met het bereiden van de Ramsay- en contractie-assays-gerechten voor de experimenten.Gebruik pipet en vul putjes met maximaal 20 microliter oplossing. Voor niet-gestimuleerde controles vult u de putten met 20 microliter Aedes zoutoplossing Schneider's medium. Zodra alle putten zijn gevuld, giet u gehydrateerde minerale olie in de testschaal totdat de putten en Minutien-pinnen zijn ondergedompeld.Nadat u de tubulus in de put hebt ondergedompeld, pakt u het proximale uiteinde van de tubulus met een tang op, verwijdert u deze van de baddruppel en wikkelt u het uiteinde rond de pin. Wikkel de tubulus tweemaal rond de pen en houd de lengte van de tubulus die in de baddruppel achterblijft consistent met de andere tubuli. Om een natriumselectieve micro-elektrode te maken, gebruikt u een spuit van één milliliter om de elektrode op te vullen met 100 millimolair natriumchloride.Zorg ervoor dat de opvuloplossing zich vult tot de punt van de elektrode. Als er luchtbellen verschijnen, veegt u voorzichtig met de micro-elektrode of verwijdert u de oplossing en vult u deze opnieuw. Dompel een pipetpunt van 10 microliter in de natriumselectieve ionofooroplossing.Lijn de elektrode loodrecht op de pipet en plaats vervolgens een gehandschoende vinger over de onderkant van de punt om druk te creëren en een kleine druppel ionofoor te verdrijven. Raak de druppel ionofoor voorzichtig aan op de micro-elektrodepunt en zorg ervoor dat u deze niet breekt. Vul een klein bekerglas halverwege met 100 millimolnatriumchloride en plaats wat boetseerklei aan de binnenkant aan de bovenkant van het bekerglas.Nadat de ionofoor is opgenomen, plaatst u de elektrodepunt op de wand van het bekerglas en laat u de uiteinden in het natriumchloride. Bewaar ISME in het bekerglas totdat het klaar is voor gebruik. Om de ISME-referentie-elektrode te maken, vult u een elektrode op met 500 millimolar kaliumchloride en slaat u deze op in een bekerglas.Coat de elektrodepunten met een oplossing van ongeveer 3,5% polyvinylchloride, opgelost in tetrahydrofuraan, om verplaatsing van de ionofoor te voorkomen wanneer ondergedompeld in paraffineolie. Om de natriumelektrode te kalibreren, plaatst u 10 microliter druppeltjes natriumchloride standaardconcentraties op de rand van de Ramsey schotel met de geïncubeerde Malpighian tubuli. Plaats de standaard druppels twee centimeter uit elkaar met de hogere concentratie erop.Plaats zowel de referentie-elektrode als de ionselectieve elektrode over de chloridezilverdraden en bevestig ze stevig met behulp van elektrodehouders die aan micromanipulatoren zijn bevestigd. Navigeer beide elektroden naar de 200 millimolaire natriumchloridedruppel met behulp van de micromanipulatoren, zodat de elektrotips de bodem van de schotel niet raken. Schakel de elektrometer in om de opname te starten en laat de meting stabiliseren.Neem de meting op en ga verder met de volgende standaard. Na het verkrijgen van metingen van de vloeistofsecretiesnelheid, verplaatst u voorzichtig de referentie- en ionselectieve elektroden in de uitgescheiden druppel met behulp van de micromanipulatoren. Schakel de opname in en laat de meting stabiliseren en neem vervolgens op.Schakel de IPA-2 ionen-/polarografische versterker, de lichtmicroscoop en de computers in. Plaats de natriumselectieve micro-elektrode op een houder bestaande uit een zilverchloridedraad en bevestig deze in de vrouwelijke connectoraansluiting. Verwijder één referentie-elektrode uit het bekerglas met het kaliumchloride, plaats één vinger aan het ene uiteinde en kantel het glazen capillair naar deze vinger om te voorkomen dat de agar eruit valt.Plaats voorzichtig het ene uiteinde in de houder en zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan. Als er een bel is, verwijdert u de referentie-elektrode, vult u de houder met drie kiezen kaliumchloride en herhaalt u dit. Plaats de elektrodehouder in de vrouwelijke connectoraansluiting.Ontleed na de kalibratie het orgel. Plaats de poly-L-lysineschaal met het ontlede monster op het microscoopstadium en plaats de punt van de referentie-elektrode in de zoutoplossing. Dompel de punt van de ionselectieve micro-elektrode onder in de zoutoplossing en zorg ervoor dat de punt niet breekt.Gebruik de handmatige instelknoppen om de micro-elektrodepositie aan te passen terwijl u onder de lichtmicroscoop kijkt. Pas de verticale positie van de micro-elektrode zodanig aan dat de punt zich op hetzelfde vlak bevindt als het orgaan of weefsel en draai vervolgens aan de motorschakelaar om in te schakelen. Gebruik de pijltjestoetsen van de computer om de micro-elektrode horizontaal te verplaatsen naar een positie op drie millimeter afstand van het weefsel om achtergrondopnamen te meten.Wanneer u klaar bent, begint u met opnemen door op F5 te drukken en vijf metingen van achtergrondactiviteit te verkrijgen. Beweeg de micro-elektrodepunt dicht bij het weefsel en zorg ervoor dat u het orgaan niet doorboort. Verminder de gevoeligheid voor het indrukken van de toets om de micro-elektrodepunt twee micrometer direct naar rechts te plaatsen, loodrecht op het weefsel.Verkrijg drie opnames op de plaats langs het rectale pad om de plaats van de grootste ionenactiviteit te identificeren en verkrijg vervolgens baseline zoutmetingen op de site met de grootste activiteit. Om hindgut-weeën op te nemen, vult u een van de putten in het gerecht met een bekend volume Aedes-zoutoplossing. Breng na de dissectie het ontleede achterbeen dat aan de middelste darm is bevestigd voorzichtig over in een put in een ander gerecht, zorg ervoor dat u het ileum niet knijpt.Dompel de darm onder in de zoutoplossing in de put en plaats Minutien-pinnen in de middelste darm en het rectum. Het ileum mag niet onder spanning staan en spontane samentrekkingen afkomstig van de pylorische klep bij het voorste ileum moeten worden waargenomen. Sluit de videocamera aan op de stereoscopische microscoop.Plaats vervolgens de schaal met het ontleedde orgaan onder de microscoop en neem twee minuten lang een video op. Toepassing van DH31 tegen niet-gestimuleerde Malpighian tubuli resulteert in een significante toename van de secretiesnelheid van vloeistoffen, wat de rol ervan als een diuretisch hormoon bij Aedes-muggen bevestigt. Wanneer tubuli worden behandeld met AedaeCAPA-1, wordt een vermindering van de secretiesnelheid waargenomen in DH31 gestimuleerde Malpighian tubuli.Ionselectieve elektroden werden gebruikt om natriumconcentraties in de uitgescheiden druppels te meten. Behandeling van DH31 op de MT's had geen effect op de natriumconcentratie in de uitgescheiden druppel. Met de toepassing van AedaeCAPA-1 was de natriumconcentratie in de uitgescheiden vloeistof echter aanzienlijk verhoogd.Bovendien leidde DH31, in vergelijking met niet-gestimuleerde controles, tot een significant hogere natriumtransportsnelheid, terwijl AedaeCAPA-1 deze toename van DH31-gestimuleerde tubuli afschafte. De SIET werd gebruikt om veranderingen in natriumtransport langs het rectale padepitheel van volwassen vrouwelijke muggen te beoordelen. Een leucokinine-analoog werd gebruikt om veranderingen in natriumabsorptie te onderzoeken, wat resulteerde in een viervoudige afname van de natriumabsorptie in vergelijking met zoutoplossingcontrole.Om de rol van een neuropeptide pyrokinine2 op de ileale motiliteit te beoordelen, werd een Rhodnius prolixus-analoog gebruikt, waarvan eerder werd aangetoond dat het de A.aegypti PK2-receptor verrijkt in het muggenileum activeert. Ten opzichte van de uitgangswaarden remt PK2 de ileale contracties significant. Bij het uitvoeren van een Ramsay-test met Malpighian-tubuli en het meten van ionen- of vloeistofsecretiesnelheden, is het noodzakelijk dat tubuli niet worden beschadigd tijdens dissectie of tijdens de overdracht in de testschaal.Na de Ramsay-test kunnen specifieke membraantransporters farmacologisch of moleculair worden gericht met behulp van omgekeerde genetische technieken om hun specifieke bijdrage aan transepitheliaal transport van opgeloste stoffen in het eenvoudige epitheel te onderscheiden.

Research

JoVE Journal

Biology

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabiele Isotopen Profilering van Intermediair metabole flux in het ontwikkelen en volwassen stadium Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Doe-het-zelf-Inrichting voor Herstel van gecryopreserveerde monsters per ongeluk laat vallen in cryogene opslagtanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Adult zebravis

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Gebruik<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fysiologische Recordings en RNA Sequencing van de Smaak Appendages van de Gele-koorts Mosquito<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Meting van larvale activiteit in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Een systeem van de BW verslaggever voor het bestuderen van de Receptor-Ligand interacties

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...