Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
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Cette recherche a été financée par des subventions de découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) à AD et J-PP. AL et FS ont reçu des prix CGS-M du CRSNG du CRSNG à l’appui de leurs recherches aux cycles supérieurs.

1. Faire des plats doublés de silicone
REMARQUE: Cette étape doit être effectuée avant les expériences. Ces plats seront préparés pour préparer le plat d’essai pour les dissections et pour les expériences de dosage de contraction.
<ol><li>Préparez le silicone à l’aide d’un kit d’élastomère de silicone en suivant les recommandations du fabricant. Mélanger les composants liquides en deux parties dans un rapport de 10 à 1. Mélanger doucement et soigneusement en inversant...

Lors de l’ingestion d’un repas de sang, les insectes hématophages sont confrontés au défi de l’excès de solutés et d’eau dans leur hémolymphe2. Pour faire face à cela, ils ont un système excréteur spécialisé, qui est étroitement contrôlé par des facteurs hormonaux, permettant aux insectes d’initier rapidement une diurèse post-prandiale. Le test de Ramsay et l’utilisation de microélectrodes sélectives d’ions permettent de mesurer les taux de sécrétion de liquide ain...

Le maintien des niveaux de sel et d’eau chez les insectes leur permet de réussir dans de nombreuses niches écologiques et environnementales, en utilisant une variété de stratégies d’alimentation1. La plupart des insectes ont développé des mécanismes pour réguler la composition de leur hémolymphe dans des limites étroites afin de résister aux différents défis associés à leur environnement particulier2. Les insectes terrestres sont souvent confrontés au défi de conserver l’eau et le système excréteur subit une antidiaurèse pour prévenir la perte d’eau et de certains sels essentiels, évitant ainsi la dessiccation. En revanche, la diurèse se produit lorsque l’insecte se nourrit et est confronté à un excès d’eau et potentiellement de sels3,4. Grâce à leur système excréteur spécialisé et très actif, les insectes ont développé des mécanismes de régulation agissant pour contrer leurs défis de scorrégulation. Chez les moustiques adultes Aedes aegypti, le système excréteur est composé des tubules de Malpighian (MT) et de l’intestin postérieur, ce dernier étant constitué de l’iléon antérieur et du rectum postérieur5. Les MT sont responsables de la génération d’urine primaire, généralement riche en NaCl et / ou KCl. L’urine primaire est ensuite modifiée par des processus sécrétoires et réabsorptifs lorsqu’elle se déplace en aval du tubule et pénètre dans l’intestin postérieur5. Les excréments finaux peuvent être hyper- ou hypoosmotiques à l’hémolymphe, selon les conditions alimentaires/environnementales, et sont enrichis en déchets toxiques et azotés2.
Les MT sont idéales pour étudier de nombreuses caractéristiques du liquide épithélial et du transport du soluté, car elles remplissent une grande variété de fonctions de transport et d’excrétion2,6. Grâce à la régulation hormonale2, les MT fonctionnent en sécrétant des ions et d’autres solutés du sang dans la lumière du tubule7, fournissant un gradient osmotique permettant à l’eau d’être transportée par des aquaporines8,9, qui créent collectivement l’urine primaire, avant de se déplacer vers l’intestin postérieur réabsorptif2. Ainsi, en collectant le fluide sécrété à partir de MT isolés, on peut surveiller en permanence le transport transépithélial du liquide et des ions. La mesure du taux de sécrétion et de la composition de l’urine donne un aperçu des mécanismes responsables du transport transépithélial des ions et des fluides. Une méthode populaire pour étudier les taux de sécrétion de liquide est le test de Ramsay, qui a été introduit pour la première fois par Ramsay en 195310. Dans cette méthode, l’extrémité distale (fermée) du tubule est traitée avec une hormone (ou un autre composé / médicament de test), tandis que l’extrémité proximale (ouverte) est enroulée autour d’une épingle dans de l’huile de paraffine saturée d’eau, qui sécrète l’urine primaire, s’accumulant sous forme de gouttelette sur le bout de l’épingle. Les MT isolés sont capables de survivre et de fonctionner pendant de longues périodes (jusqu’à 24 h) dans des conditions in vitro optimisées, ce qui en fait des modèles appropriés et efficaces pour la mesure de la sécrétion de fluide. Les insectes ont des systèmes circulatoires ouverts, de sorte que les MT sont facilement disséqués et enlevés car ils flottent généralement librement dans l’hémolymphe6. De plus, à l’exception des pucerons, qui n’ont pas de MT11, le nombre de MT dans une espèce d’insecte donnée peut varier considérablement de quatre à cent (cinq chez les moustiques Aedes), ce qui permet plusieurs mesures d’un insecte.
Les MT chez les moustiques Aedes, en commun avec d’autres insectes endoptérygotes, sont composés de deux types de cellules formant un épithélium simple2,12; les grandes cellules principales, qui facilitent le transport actif des cations (c.-à-d. Na+ et K+) dans la lumière, et les cellules stellaires minces, qui aident à la sécrétion transépithéliale de Cl13. Les MT ne sont pas innervés2, mais sont régulés par plusieurs hormones, y compris des facteurs diurétiques et anti-diurétiques, permettant le contrôle du transport ionique (principalement Na+, K+ et Cl-) et de l’eau imposée par osmotique2. De nombreuses études ont examiné la régulation hormonale des MT d’Aedes pour comprendre le rôle des facteurs endocriniens sur le transport transépithélial14,15,16,17,18. Comme le montrent les résultats représentatifs, les protocoles présentés ici démontrent les effets de différents facteurs hormonaux sur les MT isolées des moustiques A. aegypti femelles adultes, y compris le contrôle diurétique et antidiatétique (figure 1). Le test de Ramsay est utilisé pour démontrer comment une hormone anti-diurétique, AedaeCAPA-1, inhibe la sécrétion liquidienne des MT stimulée par l’hormone diurétique 31 (DH31) (Figure 1).
La plus petite taille des insectes a nécessité le développement de microméthodes pour mesurer l’activité ionique et les concentrations dans les échantillons de liquide, ou près de la surface de tissus isolés tels que les MT et l’intestin. Diverses méthodes ont été mises en œuvre, y compris l’utilisation de radio-isotopes d’ions19, ce qui nécessite la collecte des gouttes de fluide sécrétées pour la mesure des concentrations d’ions20. Les tubules d’Aedes stimulés in vitro sécrètent généralement environ 0,5 nL / min21, de sorte que la manipulation de si petits volumes peut poser un défi et potentiellement introduire une erreur lors du transfert. En conséquence, les microélectrodes sélectives d’ions (SMSI) ont été largement utilisées pour mesurer les concentrations d’ions dans les gouttelettes sécrétées de MT in vitro. Dans cette méthode, une électrode de référence et un ISME, remplis de la solution de remblayage et de l’ionophore appropriés, sont positionnés dans la gouttelette d’urine sécrétée pour déterminer les concentrations d’ions22. Adapté de Donini et de ses collègues23, ce protocole actuel utilise un ionophore sélectif Na+ pour mesurer l’activité ionique dans les gouttelettes sécrétées par les MT stimulées chez les moustiques Aedes adultes. Étant donné que les microélectrodes sélectives d’ions mesurent l’activité ionique, ces données peuvent être exprimées sous forme de concentrations d’ions en supposant que les solutions d’étalonnage et les échantillons expérimentaux partagent le même coefficient d’activité ionique21 (figure 1B, C).
La technique d’électrode sélective d’ions à balayage (SIET) utilise également des SMSI pour mesurer les gradients de concentration d’ions dans la couche non excitée adjacente aux organes, tissus ou cellules qui transportent des ions. Les ISME mesurent des gradients de tension qui peuvent ensuite être utilisés pour calculer les gradients de concentration d’ions et la direction et l’ampleur du flux d’ions à travers l’organe, le tissu ou la cellule20. Dans cette technique, l’ISME est monté sur un manipulateur à trois axes contrôlé par des moteurs micro-pas à pas informatisés afin que sa position 3D soit contrôlée au niveau micrométrique20. Les tensions sont mesurées en deux points de la couche non stimulée à l’aide d’un protocole d’échantillonnage programmé et contrôlé par un logiciel informatique. Les deux points sont généralement séparés par une distance de 20 à 100 μm avec un point à moins de 5 à 10 μm de la surface de l’organe, du tissu ou de la cellule et le deuxième point à 20 à 100 μm de distance. La différence de magnitude des tensions entre les deux points est calculée pour obtenir un gradient de tension24,25,26, qui est ensuite utilisé pour calculer le gradient de concentration et par la suite le flux net en utilisant la loi de Fick24,27. Cette méthode est utile pour évaluer le transport d’ions spécifiques à travers différentes régions de l’intestin de l’insecte et des MT, ou à des moments spécifiques après une exposition à la farine de sang ou à un traitement. Par exemple, le SIET peut être utilisé pour comprendre comment les processus absorbants et sécrétoires dans le système excréteur des moustiques sont régulés par les hormones28 ainsi que par différents comportements alimentaires et conditions d’élevage25. Des travaux antérieurs utilisant le SIET ont révélé des sites impliqués dans le transport d’ions le long des papilles anales et du rectum des larves et des moustiques adultes24,28. Le protocole actuel, décrit précédemment par Paluzzi et ses collègues26, mesure le flux de Na+ à travers l’épithélium rectal du rectum féminin adulte (Figure 2).
Le dernier segment du système excréteur de moustiques nécessite un mouvement musculaire coordonné pour aider à mélanger les aliments et à sécréter des déchets26. Les produits non absorbables de la digestion de l’intestin moyen, ainsi que l’urine primaire sécrétée par les MT, sont passés à travers la valve pylorique et livrés à l’intestin postérieur2. Les contractions spontanées de l’intestin postérieur commencent au niveau de la valve pylorique et se produisent dans les ondes péristaltiques, qui sont relayées sur l’iléon par la contraction coordonnée des muscles circulaires et longitudinaux entourant la surface basale des cellules épithéliales26. Enfin, les muscles du rectum aident à propulser et à éliminer les déchets à travers le canal anal. Bien que la motilité de l’intestin postérieur des insectes soit myogénique, nécessitant du Ca2+ extracellulaire pour produire des contractions spontanées, ces processus peuvent également être régulés par voie neuronale26,29,30. Cette régulation exogène par le système nerveux est importante après l’alimentation, car l’animal doit expulser les déchets de l’intestin et rétablir l’équilibre de l’hémolymphe31. Par conséquent, la réalisation de tests biologiques in vitro pour identifier les neuropeptides myostimulants ou myoinhibitory est utile pour évaluer comment les neurochimiques influencent la motilité de l’intestin postérieur. Le protocole actuel, réalisé par Lajevardi et Paluzzi28, utilise des enregistrements vidéo pour examiner la motilité iléale en réponse aux neuropeptides (Figure 3). De même, un capteur de force ou un convertisseur d’impédance peut également être utilisé pour observer des traces de contractions via un logiciel d’acquisition de données32,33. Cependant, l’utilisation de la technologie vidéo nous permet d’évaluer visuellement l’organe et d’analyser davantage en utilisant un sous-ensemble de paramètres pour identifier le rôle des hormones sur la motilité de l’intestin postérieur.
L’utilisation de ces techniques peut aider à caractériser les facteurs qui régulent et coordonnent le transport des fluides et des ions le long du système excréteur ainsi que la motilité de l’intestin postérieur. Il est important de noter qu’un lien fonctionnel entre la réponse diurétique des MT et la motilité de l’intestin postérieur est soutenu, car les hormones diurétiques, telles que DH31 et 5HT, caractérisées par leur capacité à stimuler la sécrétion de liquide par les MT, présentent également des actions myotropes le long de l’intestin postérieur du moustique21,34,35 . Ces résultats soulignent l’importance d’une coordination rigoureuse entre les MT et l’intestin postérieur lors d’événements tels que la diurèse post-prandiale chez les insectes nécessitant une élimination rapide des déchets.
Ici, l’approche détaillée derrière la technique de dosage de Ramsay pour mesurer le taux de sécrétion de liquide chez le moustique, A. aegypti, et l’utilisation de microélectrodes sélectives d’ions pour déterminer les concentrations de Na + dans le fluide sécrété des MT sont décrites, ce qui, lorsqu’il est combiné, permet de déterminer les taux de transport transépithélial des ions. De plus, la technique d’électrode sélective d’ions à balayage et les tests de contraction de l’intestin postérieur sont décrits pour mesurer respectivement le flux ionique et la motilité, ce qui aide à élucider la régulation hormonale de l’intestin postérieur (Figure 4).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

Les études sur la physiologie des insectes, en particulier chez les espèces qui sont vecteurs d’agents pathogènes causant des maladies chez les humains et d’autres vertébrés, fournissent la base pour développer de nouvelles stratégies de lutte antiparasitaire. Ici, une série de méthodes sont décrites qui sont couramment utilisées pour déterminer les rôles fonctionnels des neuropeptides et d’autres facteurs neuronaux (c’est-à-dire les amines biogènes) sur le système excréteur du moustique, Aedes aegypti. Les tubules de Malpighian (MT), responsables de la formation primaire d’urine, peuvent continuer à fonctionner pendant des heures lorsqu’ils sont retirés du moustique, ce qui permet de mesurer la sécrétion de liquide après des traitements hormonaux. En tant que tel, le test de Ramsay est une technique utile pour mesurer les taux de sécrétion des MT isolés. Les microélectrodes sélectives d’ions (ISME) peuvent être utilisées séquentiellement pour mesurer les concentrations d’ions (c.-à-d. Na+ et K+) dans le fluide sécrété. Ce test permet de mesurer plusieurs MT à la fois, en déterminant les effets de diverses hormones et médicaments. La technique de l’électrode sélective d’ions à balayage utilise l’ISME pour mesurer la tension représentative de l’activité ionique dans la couche non instigorée adjacente à la surface des organes de transport d’ions afin de déterminer le transport transépithélial des ions en temps quasi réel. Cette méthode peut être utilisée pour comprendre le rôle des hormones et d’autres régulateurs sur l’absorption ou la sécrétion d’ions à travers l’épithélium. Les tests de contraction de l’intestin postérieur sont également un outil utile pour caractériser les neuropeptides myoactifs, qui peuvent améliorer ou réduire la capacité de cet organe à éliminer l’excès de liquide et de déchets. Collectivement, ces méthodes donnent un aperçu de la façon dont le système excréteur est régulé chez les moustiques adultes. Ceci est important car la coordination fonctionnelle des organes excréteurs est cruciale pour surmonter des défis tels que le stress de dessiccation après l’éclosion et avant de trouver un hôte vertébré approprié pour obtenir une farine de sang.

L’application de DH31 contre les MT non stimulées entraîne une augmentation significative du taux de sécrétion de liquide, confirmant son rôle en tant qu’hormone diurétique chez les moustiques Aedes (Figure 1A). Lorsque les tubules sont traités avec AedaeCAPA-1, une réduction du taux de sécrétion est observée dans les MT stimulés par DH31. La figure 1B montre l’utilisation d’électrodes sélectives d’...

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Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Ce protocole décrit les méthodologies derrière le test de Ramsay, les microélectrodes sélectives d’ions, la technique d’électrode sélective d’ions à balayage (SIET) et les tests de contraction in vitro, appliqués pour étudier le système excréteur de moustique adulte, composé des tubules de Malpighian et de l’intestin postérieur, pour mesurer collectivement les taux de sécrétion d’ions et de liquides, l’activité contractile et le transport transépithélial des ions.

Étude de l’activité des neuropeptides et d’autres régulateurs du système excréteur chez le moustique adulte

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Ce protocole décrit les techniques qui peuvent être utilisées par les physiologistes des petits animaux pour élucider le rôle des neuropeptides et d’autres facteurs hormonaux qui régulent le système digestif et / ou excréteur. Ces techniques permettent de mesurer des échantillons biologiques de taille microscopique qui, autrement, ne seraient pas possibles à l’aide de techniques conçues spécifiquement pour des modèles animaux plus grands, y compris, par exemple, les rongeurs et les téléus. Cette méthode peut fournir un aperçu de la régulation endocrinienne de l’intestin, y compris le transport de l’épithélium, ainsi que des muscles lisses associés au tractus gastro-intestinal chez les insectes et chez les espèces non insectes de taille similaire.Farwa Sajadi, une candidate au doctorat de mon laboratoire, fera la démonstration des procédures tubales rénales des insectes. De plus, un ancien étudiant diplômé de mon laboratoire Aryan Lajevardi fera la démonstration des protocoles axés sur l’intestin postérieur. Commencez par préparer les plats ramsay et les tests de contraction pour les expériences.Utilisez une pipette et remplissez les puits avec jusqu’à 20 microlitres de solution. Pour les contrôles non stimulés, remplissez les puits avec 20 microlitres de milieu salin D’Aedes Schneider. Une fois tous les puits remplis, versez de l’huile minérale hydratée dans le plat d’essai jusqu’à ce que les puits et les épingles Minutien soient submergés.Après avoir immergé le tubule dans le puits, ramassez l’extrémité proximale du tubule avec une pince, retirez-la de la gouttelette de bain et enroulez l’extrémité autour de l’épingle. Enroulez le tubule autour de l’épingle deux fois en gardant la longueur du tubule restant dans la gouttelette de bain cohérente avec les autres tubules. Pour fabriquer une microélectrode sélective de sodium, utilisez une seringue d’un millilitre pour remplir l’électrode avec du chlorure de sodium de 100 millimolaires.Assurez-vous que la solution de remblai se remplit jusqu’à l’extrémité de l’électrode. Si des bulles d’air apparaissent, faites glisser doucement la microélectrode ou retirez la solution et rechargez. Trempez une pointe de pipette de 10 microlitres dans la solution d’ionophore sélectif de sodium.Alignez l’électrode perpendiculairement à la pipette, puis placez un doigt ganté sur le bas de la pointe pour créer une pression et expulser une petite goutte d’ionophore. Touchez délicatement la goutte d’ionophore à la pointe de la microélectrode, en veillant à ne pas la casser. Remplissez un petit bécher à mi-chemin avec du chlorure de sodium de 100 millimolaires et placez de la pâte à modeler à l’intérieur en haut du bécher.Une fois l’ionophore absorbé, placez l’extrémité de l’électrode sur la paroi du bécher, en laissant les extrémités dans le chlorure de sodium. Conservez ISME dans le bécher jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Pour fabriquer l’électrode de référence ISME, remplissez une électrode avec du chlorure de potassium de 500 millimolaires et stockez-la dans un bécher.Enduire les extrémités de l’électrode à l’aide d’une solution d’environ 3,5% de chlorure de polyvinyle, dissous dans du tétrahydrofurane, pour éviter le déplacement de l’ionophore lorsqu’il est immergé dans de l’huile de paraffine. Pour calibrer l’électrode de sodium, placez 10 gouttelettes de microlitres de concentrations étalons de chlorure de sodium sur le bord de la boîte ramsey avec les tubules malpighiens incubés. Placez les gouttelettes standard à deux centimètres l’une de l’autre avec la concentration la plus élevée sur le dessus.Insérez à la fois l’électrode de référence et l’électrode sélective d’ions sur les fils de chlorure d’argent et fixez-les solidement à l’aide de porte-électrodes fixés à des micro-manipulateurs. Dirigez les deux électrodes vers la gouttelette de chlorure de sodium de 200 millimolaires à l’aide des micro-manipulateurs, en veillant à ce que les électro-pointes ne touchent pas le fond de la boîte. Allumez l’électromètre pour commencer l’enregistrement et permettre à la lecture de se stabiliser.Enregistrez la lecture et passez à la norme suivante. Après avoir acquis des mesures de la vitesse de sécrétion de fluide, déplacez soigneusement les électrodes de référence et les électrodes sélectives d’ions dans la gouttelette sécrétée à l’aide des micro-manipulateurs. Activez l’enregistrement et laissez la lecture se stabiliser, puis enregistrez.Allumez l’amplificateur ionique/polarographique IPA-2, le microscope optique et les ordinateurs. Placez la microélectrode sélective de sodium sur un support constitué d’un fil de chlorure d’argent et fixez-la dans la prise de connecteur femelle. Retirez une électrode de référence du bécher avec le chlorure de potassium, en plaçant un doigt à une extrémité et en inclinant le capillaire en verre vers ce doigt pour empêcher la gélose de tomber.Placez soigneusement une extrémité dans le support, en vous assurant qu’aucune bulle ne se forme. S’il y a une bulle, retirez l’électrode de référence, remplissez le support avec trois molaires de chlorure de potassium et répétez. Placez le porte-électrode dans la prise de connexion femelle.Après l’étalonnage, disséquez l’organe. Placez la boîte de poly-L-lysine avec l’échantillon disséqué sur l’étage du microscope et insérez la pointe de l’électrode de référence à l’intérieur de la solution saline. Immergez la pointe de la microélectrode sélective d’ions dans la solution saline, en prenant soin de ne pas casser la pointe.Utilisez les boutons de réglage manuel pour régler la position de la microélectrode tout en regardant sous le microscope optique. Ajustez la position verticale de la microélectrode de sorte que sa pointe soit sur le même plan que l’organe ou le tissu, puis tournez l’interrupteur du moteur pour l’activer. À l’aide des touches fléchées de l’ordinateur, déplacez la microélectrode horizontalement dans une position située à trois millimètres du tissu pour mesurer les enregistrements d’arrière-plan.Lorsque vous êtes prêt, commencez à enregistrer en appuyant sur F5, obtenez cinq mesures de l’activité de fond. Déplacez la pointe de la microélectrode près du tissu en prenant soin de ne pas percer l’organe. Réduisez la sensibilité à l’impact de la touche pour placer la pointe de la microélectrode de deux micromètres directement à droite, perpendiculairement au tissu.Obtenez trois enregistrements sur le site le long du coussinet rectal pour identifier le site de la plus grande activité ionique, puis obtenez des mesures salines de base sur le site affichant la plus grande activité. Pour enregistrer les contractions de l’intestin postérieur, remplissez l’un des puits du plat avec un volume connu de solution saline Aedes. Après la dissection, transférez soigneusement l’intestin postérieur disséqué attaché à l’intestin moyen dans un puits dans un autre plat, en veillant à ne pas pincer l’iléon.Immergez l’intestin dans la solution saline à l’intérieur du puits et placez les broches Minutien dans l’intestin moyen et le rectum. L’iléon ne doit pas être sous tension et des contractions spontanées provenant de la valve pylorique de l’iléon antérieur doivent être observées. Connectez la caméra vidéo au microscope stéréoscopique.Placez ensuite le plat contenant l’organe disséqué sous le microscope et enregistrez une vidéo pendant deux minutes. L’application de DH31 contre des tubules malpighiens non stimulés entraîne une augmentation significative du taux de sécrétion de liquides, confirmant son rôle en tant qu’hormone diurétique chez les moustiques Aedes. Lorsque les tubules sont traités avec AedaeCAPA-1, une réduction du taux de sécrétion est observée dans les tubules de Malpighian stimulés par DH31.Des électrodes sélectives d’ions ont été utilisées pour mesurer les concentrations de sodium dans les gouttelettes sécrétées. Le traitement du DH31 sur les MT n’a eu aucun effet sur la concentration de sodium dans la gouttelette sécrétée. Cependant, avec l’application d’AedaeCAPA-1, la concentration de sodium dans le liquide sécrété a été significativement augmentée.De plus, par rapport aux témoins non stimulés, le DH31 a conduit à un taux de transport du sodium significativement plus élevé, tandis que AedaeCAPA-1 a aboli cette augmentation des tubules stimulés par le DH31. Le SIET a été utilisé pour évaluer les changements dans le transport du sodium le long de l’épithélial rectal des moustiques femelles adultes. Un analogue de la leucokinine a été utilisé pour examiner les changements dans l’absorption du sodium, ce qui a entraîné une diminution de quatre fois de l’absorption du sodium par rapport au contrôle salin.Pour évaluer le rôle d’un neuropeptide pyrokinine2 sur la motilité iléale, un analogue de Rhodnius prolixus a été utilisé, dont il a été précédemment démontré qu’il active le récepteur A.aegypti PK2 enrichi dans l’iléon du moustique. Par rapport aux niveaux de base, PK2 inhibe de manière significative les contractions iléales. Lors de la réalisation d’un test de Ramsay avec des tubules de Malpighian et de la mesure des taux de sécrétion d’ions ou de liquide, il est impératif que les tubules ne soient pas endommagés pendant la dissection ou pendant le transfert dans la boîte d’essai.Après le test de Ramsay, des transporteurs membranaires spécifiques peuvent être ciblés pharmacologiquement ou moléculairement en utilisant des techniques de génétique inverse pour discerner leur contribution spécifique au transport transépithélial des solutés dans l’épithélium simple.

Research

JoVE Journal

Biology

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Injection intrapéritonéale en Zebrafish adultes

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Recherche

Biologie

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable profilage isotopique du flux métabolique intermédiaire dans la phase de développement et de l&#39;adulte Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself dispositif de récupération d&#39;échantillons cryoconservés tombé accidentellement dans les réservoirs de stockage cryogéniques

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavage poisson zèbre pour adultes

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Un protocole expérimental et de la bioinformatique pour les analyses d&#39;ARN-Seq de la photopériode diapause dans le Asian Tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiologiques Recordings et ARN séquençage des annexes gustatives du Mosquito fièvre jaune<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Mesure de larves activité dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Moniteur d&#39;activité

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imagerie réorganisation spatiale d&#39;une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d&#39;expression transitoire du tabac

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Un système de BW rapporteur pour étudier les Interactions Ligand-récepteur

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...