Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי מענקי גילוי של המועצה למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) ל- AD ו- J-PP. אל ו-FS קיבלו פרסי NSERC CGS-M לתמיכה במחקרם לתואר שני.

1. הכנת מנות מצופות סיליקון
הערה: שלב זה צריך להיעשות לפני הניסויים. מנות אלה ייעשו כדי להכין את צלחת הבדיקה עבור ניתוחים, לניסויים בדיקת התכווצות.
<ol><li>הכינו את הסיליקון באמצעות ערכת אלסטומר סיליקון בהתאם להמלצות היצרן. מערבבים את הרכיבים הנוזליים בשני חלקים ביחס של 10 ל-1. מ?...

כאשר בולעים ארוחה דם, חרקי הממטופג מתמודדים עם האתגר של מסיסים עודפים ומים בהמולימפ2 שלהם. כדי להתמודד עם זה, יש להם מערכת הפרשה מיוחדת, אשר נשלטת היטב על ידי גורמים הורמונליים, המאפשר חרקים ליזום במהירות diuresis שלאחר פראנדיאל. בדיקת רמזי ושימוש במיקרואלקטרודים סלקטיביים של יונ?...

שמירה על רמות המלח והמים בחרקים מאפשרת להם להצליח בנישות אקולוגיות וסביבתיות רבות, תוך שימוש במגוון אסטרטגיות האכלה1. רוב החרקים פיתחו מנגנונים לווסת את הרכב המולימפה שלהם בתוך גבולות צרים על מנת לעמוד באתגרים השונים הקשורים לסביבתם המסוימת2. חרקים יבשתיים מתמודדים לעתים קרובות עם האתגר של חיסכון במים ומערכת ההפרשה עוברת אנטי diuresis כדי למנוע אובדן מים וכמה מלחים חיוניים, ולכן, הימנעות התייבשות. לעומת זאת, diuresis מתרחשת כאשר החרק ניזון והוא מאותגר עם עודף מים וייתכן מלחים 3,4. באמצעות מערכת ההפרשה המיוחדת והפעילה ביותר שלהם, חרקים פיתחו מנגנוני רגולציה הפועלים כדי להתמודד עם האתגרים האוסמורגולטוריים שלהם. אצל יתושי Aedes aegypti למבוגרים, מערכת ההפרשה מורכבת מהצינורות המלפיגיים (MTs) וההינדגוט, שהאחרון שבהם מורכב מאילום הקדמי ופי הטבעת האחורית5. MTs אחראים על יצירת שתן ראשוני, בדרך כלל עשיר NaCl ו / או KCl. השתן העיקרי משתנה לאחר מכן באמצעות תהליכי הפרשה ו reabsorptive כפי שהוא נוסע במורד הזרם של הצינור ונכנס hindgut5. הצואה הסופית יכולה להיות היפר-או היפוסמוטית להמולימפה, בהתאם לתנאי האכלה/סביבה, והיא מועשרת בפסולת רעילה וחנקנית2.
MTs הם אידיאליים לחקר תכונות רבות של נוזל אפיתל ותחבורה solute כפי שהם מבצעים מגוון גדול של פונקציות תחבורה הפרשה2,6. באמצעות ויסות הורמונלי2, MTs פונקציה על ידי הפרשת יונים ומסיסים אחרים מן הדם לתוך לומן צינור7, מתן שיפוע אוסמוטי המאפשר מים להיות מועברים על ידי aquaporins8,9, אשר באופן קולקטיבי יוצר את השתן העיקרי, לפני נסיעה לכיוון hindgut reabsorptive2. לכן, על ידי איסוף הנוזל המופרש מ MTs מבודדים, אפשר לפקח ברציפות על הובלה transepithelial של נוזל ויונים. מדידת קצב ההפרשה והרכב השתן מספקים תובנה על מנגנונים האחראים על יון transepithelial והובלת נוזלים. שיטה פופולרית לחקר שיעורי הפרשת נוזלים היא בדיקת רמזי, שהוצגה לראשונה על ידי רמזי בשנת 195310. בשיטה זו, הקצה הדיסטלי (הסגור) של הצינור מטופל עם הורמון (או תרכובת בדיקה אחרת / תרופה), בעוד הקצה הפרוקסימלי (הפתוח) עטוף סביב סיכה בשמן פרפין רווי מים, אשר מפריש את השתן העיקרי, מצטבר כטיפה על קצה הסיכה. MTs מבודדים מסוגלים לשרוד ולתפקד לתקופות ארוכות (עד 24 שעות) בתנאי הפריה חוץ גופית ממוטבים, מה שהופך אותם למודלים מתאימים ויעילים למדידת הפרשת נוזלים. לחרקים יש מערכות דם פתוחות, ולכן MTs מנותחים בקלות ומוסרים כפי שהם בדרך כלל צפים בחופשיות haemolymph6. בנוסף, למעט כנימות – חסרות MTs11 – מספר ה- MTs11 במין חרק נתון יכול להשתנות במידה ניכרת מארבע למאות (חמישה יתושי Aedes) המאפשרים מדידות מרובות מחרק אחד.
MTs יתושים Aedes, במשותף עם חרקים אנדופטריגוטה אחרים, מורכבים משני סוגי תאים היוצרים אפיתל פשוט2,12; תאים עיקריים גדולים, המאפשרים הובלה פעילה של cations (כלומר, Na + ו- K +) לתוך הלומן, ותאי סטלה דקים, אשר מסייעים בהפרשת Cl-epithelial transepithelial13. MTs אינם innervated2, ובמקום זאת מווסתים על ידי מספר הורמונים כולל גורמים משתן ואנטי משתן, המאפשרים שליטה על הובלת יונים (בעיקר Na +, K +, ו- Cl-) ומים מחויבים osmotically2. מחקרים רבים בחנו את הרגולציה ההורמונלית של Aedes MTs כדי להבין את תפקידם של גורמים אנדוקריניים על תחבורה transepithelial14,15,16,17,18. כפי שניתן לראות בתוצאות הייצוגיות, הפרוטוקולים כאן מדגימים את ההשפעות של גורמים הורמונליים שונים על MTs מבודדים מנקבה בוגרת יתושים A. aegypti, כולל הן שליטה משתן והן שליטה אנטי משתן (איור 1). בדיקת Ramsay משמשת כדי להדגים כיצד הורמון אנטי משתן, AedaeCAPA-1, מעכב הפרשת נוזלים של MTs מגורה על ידי הורמון משתן 31 (DH31) (איור 1).
הגודל הקטן יותר של חרקים דרש פיתוח של שיטות מיקרו למדידת פעילות יונית וריכוזים בדגימות נוזלים, או ליד פני השטח של רקמות מבודדות כגון MTs ומעיים. שיטות שונות יושמו, כולל שימוש radioisotopes של ions19, אשר דורש איסוף של טיפות נוזל מופרש למדידה של ריכוזי יונים20. צינורות Aedes מגורה במבחנה בדרך כלל להפריש ~ 0.5 nL / min21, ובכך טיפול של כרכים קטנים כאלה יכול להוות אתגר, פוטנציאל להציג שגיאה בעת ההעברה. כתוצאה מכך, מיקרואלקטרודים סלקטיביים יונים (ISMEs) שימשו בהרחבה למדידת ריכוזי יונים בטיפות מופרשות של MTs במבחנה. בשיטה זו, אלקטרודה התייחסות ISME, מלא פתרון מילוי גב מתאים ionophore, ממוקמים לתוך טיפת שתן מופרשת כדי לקבוע ריכוזי יון22. הותאם מדוניני ועמיתיו23, פרוטוקול נוכחי זה משתמש ionophore Na +-סלקטיבי כדי למדוד פעילות יונים בטיפות מופרשות מ MTs מגורה יתושי Aedes למבוגרים. מאחר שמיקרואלקטרודים סלקטיביים של יונים מודדים פעילות יונים, נתונים אלה יכולים לבוא לידי ביטוי כריכוזי יונים בעקבות ההנחה שפתרונות הכיול והדגימות הניסיוניות חולקים את אותו מקדם פעילות יונים21 (איור 1B,C).
טכניקת האלקטרודה הסלקטיבית של סריקת היונים (SIET) עושה שימוש גם ב- ISMEs כדי למדוד שיפועי ריכוז יונים בשכבה הלא מסודרת הסמוכה לאיברים, רקמות או תאים המעבירים יונים. ISMEs למדוד שיפועי מתח אשר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לחשב את שיפועי ריכוז היונים ואת הכיוון ואת הגודל של שטף יונים על פני האיבר, הרקמה, או התא20. בטכניקה זו, ISME מותקן על מניפולטור שלושה צירים הנשלט על ידי מנועי מיקרו-צעד ממוחשבים, כך מיקומו התלת-ממדי נשלט לרמת המיקרומטר20. מתחים נמדדים בשתי נקודות בתוך השכבה הלא מסודרת באמצעות פרוטוקול דגימה המתוכנת ונשלט על ידי תוכנת מחשב. שתי הנקודות מופרדות בדרך כלל על ידי מרחק של 20-100 מיקרומטר עם נקודה אחת בתוך 5-10 מיקרומטר מפני השטח של האיבר, הרקמה או התא והנקודה השנייה במרחק של 20-100 מיקרומטר נוספים. ההבדל בגודל המתחים בין שתי הנקודות מחושב כדי לקבל שיפוע מתח24,25,26, אשר משמש לאחר מכן לחישוב שיפוע הריכוז ולאחר מכן השטף נטו באמצעות Law24,27 של פיק. שיטה זו שימושית להערכת הובלת יונים ספציפיים על פני אזורים שונים של המעיים חרקים MTs, או בנקודות זמן ספציפיות לאחר חשיפה לקמח דם או טיפול. לדוגמה, ניתן להשתמש ב- SIET כדי להבין כיצד תהליכי ספיגה והפרשה במערכת הפרשת יתושים מוסדרים על ידי הורמונים28, כמו גם התנהגויות האכלה שונות ותנאי גידול25. עבודה קודמת שהשתמשה ב-SIET חשפה אתרים המעורבים בהובלת יונים לאורך הפפילות האנאליות ופי הטבעת של יתושים זחליים ומבוגרים24,28. הפרוטוקול הנוכחי, שתואר בעבר על ידי פאלוצי ועמיתיו26, מודד את שטף Na+ על פני אפיתליה של כרית פי הטבעת הנשית הבוגרת (איור 2).
החלק האחרון של מערכת הפרשת יתושים דורש תנועה שרירית מתואמת כדי לעזור לערבב מזון ולהפריש פסולת26. מוצרים בלתי נספגים של עיכול מן midgut, יחד עם שתן ראשוני המופרש על ידי MTs, מועברים דרך שסתום pyloric ונמסרים hindgut2. התכווצויות הינדגוט ספונטניות מתחילות בשסתום הפילורי ומתרחשות בגלים פריסטלטיים, המועברים מעל האיליום באמצעות התכווצות מתואמת של שרירים מעגליים ואורך המקיפים את פני השטח הבסיסיים של תאי אפיתל26. לבסוף, השרירים בתוך פי הטבעת לעזור להניע ולחסל פסולת דרך התעלה אנאלית. למרות תנועתיות הינדגוט חרקים היא מיוגנית, הדורשת Ca2+ חוץ תאית לייצר התכווצויות ספונטניות, תהליכים אלה יכולים להיות מוסדרים גם נוירונים26,29,30. ויסות אקסוגני זה על ידי מערכת העצבים חשוב לאחר האכלה, כמו החיה חייבת לגרש פסולת מהמעיים ולשחזר איזון haemolymph31. כתוצאה מכך, ביצוע ביו-אסאיות במבחנה כדי לזהות נוירופפטידים מיוסטימולטוריים או myoinhibitory שימושי בהערכת האופן שבו נוירוכימיקלים משפיעים על תנועתיות הינדגוט. הפרוטוקול הנוכחי, המבוצע על ידי Lajevardi ו- Paluzzi28, משתמש בהקלטות וידאו כדי לבחון תנועתיות אילאלית בתגובה לנוירופפטידים (איור 3). באופן דומה, מתמר כוח או ממיר עכבה עשוי לשמש גם כדי לבחון עקבות של התכווצויות באמצעות תוכנת רכישת נתונים32,33. עם זאת, באמצעות טכנולוגיית וידאו מאפשר לנו להעריך חזותית את האיבר ולנתח עוד באמצעות קבוצת משנה של פרמטרים כדי לזהות את התפקיד של הורמונים על תנועתיות hindgut.
שימוש בטכניקות אלה יכול לעזור לאפיין גורמים המסדירים ומתאמים הובלת נוזלים ויונים לאורך מערכת ההפרשה יחד עם תנועתיות הינדגוט. חשוב לציין, קשר פונקציונלי בין התגובה משתן על ידי MTs ותנועתיות hindgut נתמך, כמו הורמונים משתן, כגון DH31 ו 5HT, מאופיין ביכולתם לעורר הפרשת נוזלים על ידי MTs, נמצאו גם להפגין פעולות מיוטרופיות לאורך היתוש hindgut21,34,35 . ממצאים אלה מדגישים את החשיבות של תיאום מחמיר בין MTs והינדגוט במהלך אירועים כגון diuresis שלאחר פראנדיאל בחרקים הדורשים חיסול פסולת מהירה.
להלן, הגישה המפורטת מאחורי טכניקת הבדיקה Ramsay כדי למדוד את קצב הפרשת הנוזלים יתוש, A. aegypti, ואת השימוש במיקרואלקטרודים סלקטיביים יון כדי לקבוע את ריכוזי Na + בתוך הנוזל המופרש של MTs מתוארים, אשר בשילוב מאפשר שיעורי הובלת יונים transepithelial להיקבע. בנוסף, טכניקת האלקטרודה הסלקטיבית של סריקת היונים ובדיקות התכווצות ההינדגוט מתוארות כדי למדוד שטף יונים ותנועתיות, בהתאמה, מה שעוזר להבהיר את הרגולציה ההורמונלית של ההינדגוט (איור 4).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

מחקרים על פיזיולוגיית חרקים, במיוחד באותם מינים שהם וקטורים של פתוגנים הגורמים למחלות בבני אדם ובעלי חוליות אחרים, מספקים את הבסיס לפיתוח אסטרטגיות חדשניות להדברה. כאן, סדרה של שיטות מתוארות כי הם מנוצלים באופן שגרתי כדי לקבוע את התפקידים התפקודיים של neuropeptides וגורמים עצביים אחרים (כלומר, אמינים ביוגניים) על מערכת ההפרשה של היתוש, Aedes aegypti. הצינוריות המלפיגיות (MTs), האחראיות על היווצרות שתן ראשונית, יכולות להמשיך לתפקד במשך שעות כאשר הן מוסרות מהיתוש, ומאפשרות מדידות הפרשת נוזלים בעקבות טיפולים הורמונליים. ככזה, בדיקת רמזי היא טכניקה שימושית למדידת שיעורי הפרשה מ- MTs מבודדים. מיקרואלקטרודים סלקטיביים של יון (ISME) יכולים לשמש ברצף למדידת ריכוזי יונים (כלומר, Na+ ו- K +) בנוזל המופרש. בדיקה זו מאפשרת מדידה של מספר MTs בזמן נתון, קביעת ההשפעות של הורמונים שונים ותרופות. טכניקת האלקטרודה הסלקטיבית של סריקת יון משתמשת ב- ISME כדי למדוד נציג מתח של פעילות יונית בשכבה הלא מסודרת הסמוכה לפני השטח של איברים המעבירים יון כדי לקבוע הובלה טרנס-אפיתלאלית של יונים בזמן אמת. שיטה זו יכולה לשמש כדי להבין את התפקיד של הורמונים ורגולטורים אחרים על ספיגת יונים או הפרשה על פני אפיתליה. בדיקות התכווצות הינדגוט הן גם כלי שימושי לאפיון נוירופפטידים מיואקטיביים, שעשויים לשפר או להפחית את היכולת של איבר זה להסיר עודפי נוזלים ופסולת. באופן קולקטיבי, שיטות אלה מספקות תובנה כיצד מערכת ההפרשה מוסדרת יתושים בוגרים. זה חשוב כי תיאום פונקציונלי של איברי הפרשה הוא קריטי להתגבר על אתגרים כגון מתח ייבוש לאחר עיקול ולפני מציאת מארח חוליות מתאים כדי לקבל קמח דם.

יישום DH31 נגד MTs לא מגורה גורם לעלייה משמעותית בשיעור הפרשת הנוזלים, המאשר את תפקידו כהורמון משתן יתושי Aedes (איור 1A). כאשר טובולות מטופלות ב-AedaeCAPA-1, נצפתה ירידה בשיעור ההפרשה ב-MTs מגורה DH31. איור 1B מדגים את השימוש באלקטרודות סלקטיביות ליוני?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות מאחורי בדיקת רמזי, מיקרואלקטרודים סלקטיביים יונים, סריקת טכניקת אלקטרודה סלקטיבית יון (SIET) ובדיקות התכווצות במבחנה, המיושמים לחקר מערכת הפרשת היתושים הבוגרת, המורכבת מצינורות Malpighian והינדגוט, כדי למדוד באופן קולקטיבי שיעורי הפרשת יונים ונוזלים, פעילות התכווצות והובלת יונים טרנס-אפיתל.

חקר הפעילות של נוירופפטידים ורגולטורים אחרים של מערכת ההפרשה יתוש למבוגרים

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

פרוטוקול זה מתאר טכניקות שניתן להשתמש בהן על ידי פיזיולוגים של בעלי חיים קטנים כדי להבהיר את תפקידם של נוירופפטידים וגורמים הורמונליים אחרים המווסתים את מערכת העיכול או ההפרשה. טכניקות אלה מאפשרות מדידות של דגימות ביולוגיות בגודל מיקרו שאחרת לא היו אפשריות באמצעות טכניקות שתוכננו במיוחד עבור מודלים גדולים יותר של בעלי חיים, כולל, למשל, מכרסמים ו teleus. שיטה זו יכולה לספק תובנה על הרגולציה האנדוקרינית של המעיים, כולל הובלת אפיתל, כמו גם שריר חלק הקשור למערכת העיכול בחרקים ובמינים שאינם חרקים בגודל דומה.הדגמת נהלי חצוצרות החרקים תהיה פארווה סג'די, מועמדת לדוקטורט מהמעבדה שלי. בנוסף, סטודנט לתואר שני לשעבר מהמעבדה שלי ארית Lajevardi יהיה להפגין את הפרוטוקולים ממוקדים hindgut. התחילו בהכנת רמזי ובדיקות התכווצות כלים לניסויים.יש להשתמש בפיפטה ולמלא בארות עם עד 20 מיקרוליטרים של תמיסה. לפקדים לא מגורים, מלאו את הבארות ב-20 מיקרוליטרים של המדיום של Aedes מלוחים שניידר. לאחר שכל הבארות מתמלאות, יוצקים שמן מינרלי מיובש לצלחת הבדיקה עד שהבארות וסיכות המינוטין שקועות.לאחר טבילת הצינור בבאר, להרים את הקצה הפרוקסימלי של הצינור עם מלקחיים, להסיר אותו מן טיפת הרחצה, ולעטוף את הקצה סביב הסיכה. עוטפים את הצינור סביב הסיכה פעמיים ושומרים על אורך הצינור שנותר בטיפת הרחצה בקנה אחד עם הצינורות האחרים. כדי להפוך את microelectrode נתרן סלקטיבי, להשתמש מזרק מיליליטר אחד כדי למלא את האלקטרודה עם 100 מילימולרי נתרן כלורי.ודאו שתמיסת המילוי האחורית מתמלאת עד קצה האלקטרודה. אם מופיעות בועות אוויר, יש להעיף בעדינות את המיקרואלקטרוניקה או להסיר את התמיסה ולמלא מחדש. יש לטבול קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר בתמיסת היונופור הסלקטיבית של הנתרן.בשורה את האלקטרודה מאונך לפיפטה, ולאחר מכן למקם אצבע בכפפה מעל החלק התחתון של הקצה כדי ליצור לחץ ולגרש טיפה קטנה של ionophore. בזהירות לגעת טיפה של ionophore לקצה microelectrode, הקפדה לא לשבור אותו. מלאו קטנה באמצע הדרך עם 100 מילימולר נתרן כלורי והניחו קצת חימר דוגמנות על החלק הפנימי בחלק העליון של הכוס.לאחר היונופור נלקח, מניחים את קצה האלקטרודה על קיר הכוס, ומאפשרים את הטיפים בתוך הנתרן כלורי. שמור את ISME בכוס עד שיהיה מוכן לשימוש. כדי להפוך את אלקטרודת הייחוס ISME, למלא בחזרה אלקטרודה עם 500 מילימולר אשלגן כלורי ולאחסן אותו בכוס.מצפים את קצות האלקטרודה באמצעות תמיסה של כ 3.5% פוליוויניל כלוריד, מומס טטרהידרופורן, כדי למנוע תזוזה של היונופור כאשר שקוע בשמן פרפין. כדי לכייל את אלקטרודת הנתרן, מניחים 10 טיפות מיקרוליטר של ריכוזים סטנדרטיים של נתרן כלורי על קצה צלחת רמזי עם הצינורות המלפיגיים המדודרים. מניחים את הטיפות הסטנדרטיות במרחק שני סנטימטרים זה מזה עם הריכוז הגבוה יותר למעלה.הכנס הן את אלקטרודת הייחוס והן את האלקטרודה הסלקטיבית של היונים מעל חוטי הכסף של הכלוריד והידק אותם בבטחה באמצעות מחזיקי אלקטרודות המחוברים למיקרו מניפולטורים. נווט את שתי האלקטרודות לכיוון טיפת הנתרן כלורית 200 מילימולרית באמצעות מניפולטורים מיקרו, להבטיח כי קצות אלקטרו לא לגעת בתחתית המנה. הפעל את האלקטרומטר כדי להתחיל להקליט ולאפשר לקריאה להתייצב.הקלט את הקריאה והמשיך לסטנדרט הבא. לאחר רכישת מדידות של קצב הפרשת הנוזלים, העבירו בזהירות את ההתייחסות ואת האלקטרודות הסלקטיביות של היונים לטיפות המופרשות באמצעות המניפולטורים הזעירים. הפעל את ההקלטה ואפשר לקריאה להתייצב ולאחר מכן הקלט.הפעילו את מגבר ה-IPA-2 Ion/Polarographic, את מיקרוסקופ האור ואת המחשבים. מניחים את הנתרן מיקרואלקטרודה סלקטיבית על מחזיק המורכב חוט כלוריד כסף ולחבר אותו לשקע המחבר הנשי. הסר אלקטרודת התייחסות אחת מן הכוס עם אשלגן כלורי, הצבת אצבע אחת בקצה אחד והטיית נימי הזכוכית לכיוון אצבע זו כדי למנוע את אגר לנשור.בזהירות למקם קצה אחד לתוך המחזיק, להבטיח כי לא נוצרות בועות. אם יש בועה, להסיר את אלקטרודת הייחוס, למלא את המחזיק עם שלושה אשלגן כלורי טוחן ולחזור. מקם את מחזיק האלקטרודה בשקע המחבר הנשי.לאחר הכיול, לנתח את האיבר. מניחים את צלחת הפולי-L-ליזין עם הדגימה המנותחת על במת המיקרוסקופ ומכניסים את קצה אלקטרודת הייחוס בתוך תמיסת המלח. להטביע את קצה המיקרו-אלקטרוניקה הסלקטיבית של היון בתמיסת המלח, תוך הקפדה שלא לשבור את הקצה.השתמש בידיות הכוונון הידניות כדי להתאים את מיקום המיקרו-אלקטרוניקה בעת התבוננות מתחת למיקרוסקופ האור. התאם את המיקום האנכי של המיקרואלקטרודה כך שהקצה שלו יהיה באותו מישור כמו האיבר או הרקמה, ואז סובב את מתג המנוע כדי לאפשר. באמצעות מקשי החצים של המחשב, הזז את המיקרואלקטרודה אופקית למיקום המרוחק שלושה מילימטרים מהרקמה כדי למדוד הקלטות רקע.כאשר אתה מוכן, התחל להקליט על-ידי הקשה על F5, השג חמש מדידות של פעילות ברקע. הזז את קצה microelectrode קרוב לרקמה תוך הקפדה לא לנקב את האיבר. הפחת את רגישות הפגיעה העיקרית כדי למקם את קצה microelectrode שני מיקרומטרים ישירות ימינה, בניצב לרקמה.להשיג שלוש הקלטות באתר לאורך כרית רקטלית כדי לזהות את האתר של פעילות היונים הגדולה ביותר, ולאחר מכן לקבל מדידות מלוחים בסיסיות באתר המציג את הפעילות הגדולה ביותר. כדי להקליט התכווצויות hindgut, למלא את אחת הבארות בצלחת עם נפח ידוע של תמיסת מלח Aedes. לאחר הניתוח, מעבירים בזהירות את ההינדגוט המנותח המחובר לבטן האמצעית לבאר בצלחת אחרת, ומקפידים לא לצבוט את האילום.שקועים במעיים בתמיסת המלח בתוך הבאר ומניחים סיכות מינוטין לתוך המעיים האמצעיים ופי הטבעת. ileum לא צריך להיות תחת מתח התכווצויות ספונטניות שמקורן בשסתום פילורי באיליאום הקדמי יש לראות. חבר את מצלמת הווידאו למיקרוסקופ הסטריאוסקופי.לאחר מכן מניחים את המנה המכילה את האיבר המנותח מתחת למיקרוסקופ ולהקליט וידאו במשך שתי דקות. יישום של DH31 נגד צינורות Malpighian unstimulated גורם לעלייה משמעותית בשיעור הפרשת נוזלים, המאשר את תפקידו כהורמון משתן יתושים Aedes. כאשר טובולות מטופלות עם AedaeCAPA-1, ירידה בשיעור הפרשה הוא ציין DH31 מגורה צינורות Malpighian.אלקטרודות סלקטיביות יון שימשו למדידת ריכוזי נתרן בטיפות המופרשות. טיפול DH31 על MTs לא הייתה השפעה על ריכוז הנתרן בטיפת המופרשת. עם זאת, עם היישום של AedaeCAPA-1, ריכוז הנתרן בנוזל המופרש גדל באופן משמעותי.בנוסף, בהשוואה לבקרות לא מגורות, DH31 הוביל לקצב הובלת נתרן גדול יותר באופן משמעותי, ואילו AedaeCAPA-1 ביטל עלייה זו בצינורות מגורה DH31. ה- SIET שימש להערכת שינויים בהובלת נתרן לאורך אפיתל כרית פי הטבעת של יתושים נקבות בוגרות. אנלוגי לוקוקינין שימש לבחינת שינויים בספיגת הנתרן, מה שגרם לירידה של פי ארבעה בספיגת הנתרן בהשוואה לשליטה מלוחה.כדי להעריך את התפקיד של pyrokininin neuropeptide2 על תנועתיות ileal, נעשה שימוש באנלוגי של רודניוס פרוליקסוס, אשר הוכח בעבר כדי להפעיל את קולטן A.aegypti PK2 מועשר ileum יתוש. יחסית לרמות הבסיס, PK2 מעכב באופן משמעותי התכווצויות ileal. בעת ביצוע בדיקת רמזי עם טובולות Malpighian ומדידת שיעורי הפרשת יונים או נוזלים, זה הכרחי כי צינורות לא ניזוקו במהלך הניתוח או במהלך ההעברה לתוך צלחת הבדיקה.בעקבות בדיקת רמזי, מובילי ממברנות ספציפיים יכולים להיות ממוקדים או פרמקולוגית או מולקולרית באמצעות טכניקות גנטיות הפוכות כדי להבחין בתרומתם הספציפית להובלה טרנס-אפיתל של מסיסים באפיתל הפשוט.

Research

JoVE Journal

Biology

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

פרופיל איזוטופים יציבים של שטף מטבולית מתווך בשלב פיתוח למבוגרים Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging דג הזברה למבוגר

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים,<em&gt; אדס המפוספס</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

מערכת BW כתב ללמוד אינטראקציות קולטן-ליגנד

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...