Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants to AD e J-PP. AL e FS hanno ricevuto i premi NSERC CGS-M a sostegno della loro ricerca universitaria.

1. Preparare piatti rivestiti in silicone
NOTA: questo passaggio deve essere eseguito prima degli esperimenti. Questi piatti saranno fatti per preparare il piatto di analisi per le dissezioni e per gli esperimenti di saggio di contrazione.
<ol><li>Preparare il silicone utilizzando un kit di elastomero siliconico seguendo le raccomandazioni del produttore. Mescolare i componenti liquidi in due parti con un rapporto di 10 a 1. Mescolare delicatamente e accuratamente invertendo ma assicurarsi d...

Quando ingeriscono un pasto di sangue, gli insetti ematofagi affrontano la sfida dell'eccesso di soluti e acqua nella loro emolinfa2. Per far fronte a questo, hanno un sistema escretore specializzato, che è strettamente controllato da fattori ormonali, consentendo agli insetti di avviare rapidamente la diuresi post-prandiale. Il saggio Ramsay e l'uso di microelettrodi iono-selettivi consentono di misurare i tassi di secrezione del fluido insieme alle concentrazioni di ioni e ai tassi di trasporto...

Il mantenimento dei livelli di sale e acqua negli insetti consente loro di avere successo in molte nicchie ecologiche e ambientali, utilizzando una varietà di strategie di alimentazione1. La maggior parte degli insetti ha sviluppato meccanismi per regolare la composizione della loro emolinfa entro limiti ristretti al fine di resistere alle diverse sfide associate al loro particolare ambiente2. Gli insetti terrestri si trovano spesso di fronte alla sfida di conservare l'acqua e il sistema escretore subisce anti-diuresi per prevenire la perdita di acqua e di alcuni sali essenziali, evitando quindi l'essiccazione. Al contrario, la diuresi si verifica quando l'insetto si nutre e viene sfidato con l'acqua in eccesso e potenzialmente i sali3,4. Attraverso il loro sistema escretore specializzato e altamente attivo, gli insetti hanno sviluppato meccanismi di regolazione che agiscono per contrastare le loro sfide osmoregolatrici. Nelle zanzare adulte Aedes aegypti, il sistema escretore è costituito dai tubuli malpighiani (MT) e dall'intestino posteriore, quest'ultimo costituito dall'ileo anteriore e dal retto posteriore5. Le MT sono responsabili della generazione di urina primaria, solitamente ricca di NaCl e/o KCl. L'urina primaria viene quindi modificata attraverso processi secretori e di riassorbimento mentre viaggia a valle del tubulo ed entra nell'intestino posteriore5. Gli escrementi finali possono essere iper- o ipoosmotici all'emolinfa, a seconda delle condizioni di alimentazione/ambientali, e sono arricchiti in rifiuti tossici e azotati2.
Le MT sono ideali per studiare molte caratteristiche del fluido epiteliale e del trasporto del soluto in quanto svolgono una grande varietà di funzioni di trasporto ed escretorie2,6. Attraverso la regolazione ormonale2, le MT funzionano secernendo ioni e altri soluti dal sangue nel lume del tubulo7, fornendo un gradiente osmotico che consente all'acqua di essere trasportata dalle acquaporine8,9, che collettivamente crea l'urina primaria, prima di viaggiare verso l'intestino posteriore riassorbito2. Pertanto, raccogliendo il fluido secreto da MT isolate, è possibile monitorare continuamente il trasporto transepiteliale di fluido e ioni. La misurazione della velocità di secrezione e della composizione delle urine fornisce informazioni sui meccanismi responsabili del trasporto di ioni e fluidi transepiteliali. Un metodo popolare per studiare i tassi di secrezione fluida è il test Ramsay, che è stato introdotto per la prima volta da Ramsay nel 195310. In questo metodo, l'estremità distale (chiusa) del tubulo viene trattata con un ormone (o altro composto / farmaco di prova), mentre l'estremità prossimale (aperta) è avvolta attorno a un perno in olio di paraffina saturo d'acqua, che secerne l'urina primaria, accumulandosi come una goccia sulla punta del perno. Le MT isolate sono in grado di sopravvivere e funzionare per lunghi periodi (fino a 24 ore) in condizioni in vitro ottimizzate, che le rendono modelli adatti ed efficienti per la misurazione della secrezione di fluidi. Gli insetti hanno sistemi circolatori aperti, quindi le MT sono facilmente sezionate e rimosse poiché di solito fluttuano liberamente nell'emolinfa6. Inoltre, ad eccezione degli afidi, che mancano di MT11, il numero di MT in una determinata specie di insetti può variare considerevolmente da quattro a centinaia (cinque nelle zanzare Aedes) consentendo misurazioni multiple da un insetto.
Le MT nelle zanzare Aedes, in comune con altri insetti endottergoti, sono composte da due tipi cellulari che formano un epitelio semplice2,12; grandi cellule principali, che facilitano il trasporto attivo dei cationi (cioè Na+ e K+) nel lume, e sottili cellule stellate, che aiutano nella secrezione transepiteliale di Cl13. Le MT non sono innervate2 e sono invece regolate da diversi ormoni, tra cui fattori diuretici e antidiuretici, consentendo il controllo del trasporto ionico (principalmente Na +, K + e Cl-) e dell'acqua osmoticamente obbligata2. Numerosi studi hanno esaminato la regolazione ormonale delle Aedes MTs per comprendere il ruolo dei fattori endocrini sul trasporto transepiteliale14,15,16,17,18. Come mostrato nei risultati rappresentativi, i protocolli qui riportati dimostrano gli effetti di diversi fattori ormonali su MT isolate da zanzare A. aegypti femmine adulte, incluso il controllo diuretico e antidiuretico (Figura 1). Il test Ramsay viene utilizzato per dimostrare come un ormone antidiuretico, AedaeCAPA-1, inibisce la secrezione fluida di MT stimolati dall'ormone diuretico 31 (DH31) (Figura 1).
La dimensione più piccola degli insetti ha richiesto lo sviluppo di micro metodi per misurare l'attività ionica e le concentrazioni in campioni di fluido o vicino alla superficie di tessuti isolati come le MT e l'intestino. Sono stati implementati diversi metodi, tra cui l'uso di radioisotopi di ioni19, che richiede la raccolta delle gocce di fluido secrete per la misurazione delle concentrazioni di ioni20. I tubuli di Aedes stimolati in vitro secernono tipicamente ~ 0,5 nL / min21, quindi la gestione di volumi così piccoli può rappresentare una sfida e potenzialmente introdurre errori al momento del trasferimento. Di conseguenza, i microelettrodi iono-selettivi (ISMI) sono stati ampiamente utilizzati per misurare le concentrazioni di ioni in goccioline secrete di MT in vitro. In questo metodo, un elettrodo di riferimento e ISME, riempiti con la soluzione di riempimento appropriata e ionoforo, vengono posizionati nella goccia di urina secreta per determinare le concentrazioni di ioni22. Adattato da Donini e colleghi23, questo protocollo attuale utilizza uno ionoforo Na+-selettivo per misurare l'attività ionica in goccioline secrete da MT stimolate in zanzare Aedes adulte. Poiché i microelettrodi iono-selettivi misurano l'attività ionica, questi dati possono essere espressi in concentrazioni ioniche in seguito all'ipotesi che le soluzioni di taratura e i campioni sperimentali condividano lo stesso coefficiente di attività ionica21 (Figura 1B,C).
La Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) utilizza anche gli ISMI per misurare i gradienti di concentrazione ionica nello strato non istigato adiacente a organi, tessuti o cellule che trasportano ioni. Gli ISMI misurano i gradienti di tensione che possono quindi essere utilizzati per calcolare i gradienti di concentrazione ionica e la direzione e l'entità del flusso ionico attraverso l'organo, il tessuto o la cellula20. In questa tecnica, l'ISME è montato su un manipolatore a tre assi controllato da motori micro-passo-passo computerizzati in modo che la sua posizione 3D sia controllata al livello micrometrico20. Le tensioni vengono misurate in due punti all'interno dello strato non agitato utilizzando un protocollo di campionamento programmato e controllato da un software per computer. I due punti sono tipicamente separati da una distanza di 20-100 μm con un punto entro 5-10 μm dalla superficie dell'organo, del tessuto o della cellula e il secondo punto a ulteriori 20-100 μm di distanza. La differenza di grandezza delle tensioni tra i due punti viene calcolata per ottenere un gradiente di tensione24,25,26, che viene poi utilizzato per calcolare il gradiente di concentrazione e successivamente il flusso netto utilizzando la legge di Fick24,27. Questo metodo è utile per valutare il trasporto di ioni specifici attraverso diverse regioni dell'intestino degli insetti e delle MT, o in punti temporali specifici a seguito di un'esposizione a farina di sangue o trattamento. Ad esempio, il SIET può essere utilizzato per capire come i processi di assorbimento e secretorio nel sistema escretore delle zanzare sono regolati dagli ormoni28, nonché da diversi comportamenti alimentari e condizioni di allevamento25. Precedenti lavori che utilizzavano il SIET hanno rivelato siti coinvolti nel trasporto di ioni lungo le papille anali e il retto di zanzare larvali e adulte24,28. L'attuale protocollo, descritto in precedenza da Paluzzi e colleghi26, misura il flusso di Na+ attraverso l'epitelio rettale del retto femminile adulto (Figura 2).
Il segmento finale del sistema escretore delle zanzare richiede un movimento muscolare coordinato per aiutare a mescolare il cibo e secernere i rifiuti26. I prodotti non assorbibili della digestione dal midgut, insieme all'urina primaria secreta dalle MT, vengono fatti passare attraverso la valvola pilorica e consegnati all'intestino posteriore2. Le contrazioni spontanee dell'intestino posteriore iniziano dalla valvola pilorica e si verificano in onde peristaltiche, che vengono trasmesse sull'ileo attraverso la contrazione coordinata dei muscoli circolari e longitudinali che circondano la superficie basale delle cellule epiteliali26. Infine, i muscoli all'interno del retto aiutano a spingere ed eliminare i rifiuti attraverso il canale anale. Sebbene la motilità dell'intestino posteriore degli insetti sia miogenica e richieda Ca2+ extracellulare per produrre contrazioni spontanee, questi processi possono anche essere regolati neuronalmente26,29,30. Questa regolazione esogena da parte del sistema nervoso è importante dopo l'alimentazione, poiché l'animale deve espellere i rifiuti dall'intestino e ripristinare l'equilibrio dell'emolinfa31. Di conseguenza, l'esecuzione di biosaggi in vitro per identificare neuropeptidi miostimolatori o mioinibitori è utile per valutare come le sostanze neurochimiche influenzano la motilità dell'intestino posteriore. L'attuale protocollo, eseguito da Lajevardi e Paluzzi28, utilizza registrazioni video per esaminare la motilità ileale in risposta ai neuropeptidi (Figura 3). Allo stesso modo, un trasduttore di forza o un convertitore di impedenza può anche essere utilizzato per osservare tracce di contrazioni attraverso un software di acquisizione dati32,33. Tuttavia, l'utilizzo della tecnologia video ci consente di valutare visivamente l'organo e analizzare ulteriormente utilizzando un sottoinsieme di parametri per identificare il ruolo degli ormoni sulla motilità dell'intestino posteriore.
L'uso di queste tecniche può aiutare a caratterizzare i fattori che regolano e coordinano il trasporto di fluidi e ioni lungo il sistema escretore insieme alla motilità dell'intestino posteriore. È importante sottolineare che è supportato un legame funzionale tra la risposta diuretica da parte delle MT e la motilità dell'intestino posteriore, poiché gli ormoni diuretici, come DH31 e 5HT, caratterizzati dalla loro capacità di stimolare la secrezione di liquidi da parte delle MT, sono stati trovati anche per esibire azioni miotropiche lungo l'intestino posteriore della zanzara21,34,35 . Questi risultati evidenziano l'importanza di un rigoroso coordinamento tra le MT e l'intestino posteriore durante eventi come la diuresi post-prandiale negli insetti che richiedono una rapida eliminazione dei rifiuti.
Qui, vengono descritti l'approccio dettagliato alla base della tecnica di analisi Ramsay per misurare il tasso di secrezione di fluido nella zanzara, A. aegypti, e l'uso di microelettrodi iono-selettivi per determinare le concentrazioni di Na + all'interno del fluido secreto delle MT, che quando combinato consente di determinare i tassi di trasporto degli ioni transepiteliali. Inoltre, la tecnica dell'elettrodo iono-selettivo a scansione e i saggi di contrazione dell'intestino posteriore sono descritti per misurare rispettivamente il flusso ionico e la motilità, che aiuta a chiarire la regolazione ormonale dell'intestino posteriore (Figura 4).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

Gli studi sulla fisiologia degli insetti, in particolare in quelle specie che sono vettori di agenti patogeni che causano malattie negli esseri umani e in altri vertebrati, forniscono le basi per sviluppare nuove strategie per il controllo dei parassiti. Qui, vengono descritti una serie di metodi che vengono abitualmente utilizzati per determinare i ruoli funzionali dei neuropeptidi e di altri fattori neuronali (cioè ammine biogeniche) sul sistema escretore della zanzara, Aedes aegypti. I tubuli malpighiani (MT), responsabili della formazione di urina primaria, possono continuare a funzionare per ore quando vengono rimossi dalla zanzara, consentendo misurazioni della secrezione di liquidi dopo trattamenti ormonali. Come tale, il test di Ramsay è una tecnica utile per misurare i tassi di secrezione da MT isolati. I microelettrodi iono-selettivi (ISME) possono essere utilizzati in sequenza per misurare le concentrazioni di ioni (cioè Na + e K +) nel fluido secreto. Questo test consente la misurazione di diversi MT in un dato momento, determinando gli effetti di vari ormoni e farmaci. La tecnica dell'elettrodo iono-selettivo a scansione utilizza ISME per misurare la tensione rappresentativa dell'attività ionica nello strato non istigato adiacente alla superficie degli organi che trasportano ioni per determinare il trasporto transepiteliale di ioni quasi in tempo reale. Questo metodo può essere utilizzato per comprendere il ruolo degli ormoni e di altri regolatori sull'assorbimento o la secrezione di ioni attraverso gli epiteli. I saggi di contrazione dell'intestino posteriore sono anche uno strumento utile per caratterizzare i neuropeptidi mioattivi, che possono migliorare o ridurre la capacità di questo organo di rimuovere i liquidi in eccesso e i rifiuti. Collettivamente, questi metodi forniscono informazioni su come il sistema escretore è regolato nelle zanzare adulte. Questo è importante perché la coordinazione funzionale degli organi escretori è fondamentale per superare sfide come lo stress da essiccazione dopo l'eclosione e prima di trovare un ospite vertebrato adatto per ottenere una farina di sangue.

L'applicazione di DH31 contro LE MT non stimolate si traduce in un significativo aumento del tasso di secrezione di liquidi, confermando il suo ruolo come ormone diuretico nelle zanzare Aedes (Figura 1A). Quando i tubuli vengono trattati con AedaeCAPA-1, si osserva una riduzione della velocità di secrezione nelle MT stimolate da DH31. La Figura 1B dimostra l'uso di elettrodi iono-selettivi per misurare le concentrazioni d...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Questo protocollo delinea le metodologie alla base del test Ramsay, dei microelettrodi iono-selettivi, della tecnica dell'elettrodo iono-selettivo a scansione (SIET) e dei saggi di contrazione in vitro, applicati per studiare il sistema escretore di zanzare adulte, composto dai tubuli malpighiani e dall'intestino posteriore, per misurare collettivamente i tassi di secrezione di ioni e fluidi, l'attività contrattile e il trasporto di ioni transepiteliali.

Studiare l'attività dei neuropeptidi e di altri regolatori del sistema escretore nella zanzara adulta

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Questo protocollo descrive tecniche che possono essere utilizzate dai fisiologi dei piccoli animali per chiarire il ruolo dei neuropeptidi e di altri fattori ormonali che regolano il sistema digestivo e/o escretore. Queste tecniche consentono misurazioni di campioni biologici di dimensioni micro che altrimenti non sarebbero possibili utilizzando tecniche progettate specificamente per modelli animali più grandi, tra cui, ad esempio, roditori e teleus. Questo metodo può fornire informazioni sulla regolazione endocrina dell'intestino, incluso il trasporto epiteliale e la muscolatura liscia associata al tratto gastrointestinale negli insetti e nelle specie non insettiche di dimensioni simili.A dimostrare le procedure tubariche renali degli insetti sarà Farwa Sajadi, un dottorando del mio laboratorio. Inoltre, un ex studente laureato del mio laboratorio Aryan Lajevardi dimostrerà i protocolli focalizzati sull'intestino posteriore. Inizia preparando i piatti di Ramsay e di contrazione per gli esperimenti.Utilizzare pipette e riempire pozzi con un massimo di 20 microlitri di soluzione. Per i controlli non stimolati, riempire i pozzetti con 20 microlitri di mezzo Aedes saline Schneider. Una volta riempiti tutti i pozzetti, versare l'olio minerale idratato nel piatto di analisi fino a quando i pozzetti e i perni Minutien sono immersi.Dopo aver immerso il tubulo nel pozzo, raccogliere l'estremità prossimale del tubulo con una pinza, rimuoverla dalla goccia da bagno e avvolgere l'estremità attorno al perno. Avvolgere il tubulo attorno al perno due volte mantenendo la lunghezza del tubulo rimanente nella goccia da bagno coerente con gli altri tubuli. Per creare un microelettrodo selettivo del sodio, utilizzare una siringa da un millilitro per riempire l'elettrodo con cloruro di sodio da 100 millimolari.Assicurarsi che la soluzione di riempimento si riempia fino alla punta dell'elettrodo. Se compaiono bolle d'aria, scorrere delicatamente il microelettrodo o rimuovere la soluzione e ricaricare. Immergere una punta di pipetta da 10 microlitri nella soluzione di ionoforo selettivo del sodio.Allineare l'elettrodo perpendicolarmente alla pipetta, quindi posizionare un dito guantato sul fondo della punta per creare pressione ed espellere una piccola goccia di ionoforo. Toccare con attenzione la goccia di ionoforo sulla punta del microelettrodo, assicurandosi di non romperla. Riempi un piccolo becher a metà strada con cloruro di sodio 100 millimolare e posiziona dell'argilla modellante all'interno nella parte superiore del becher.Dopo che lo ionoforo è stato assorbito, posizionare la punta dell'elettrodo verso il basso sulla parete del becher, lasciando le punte all'interno del cloruro di sodio. Tenere ISME nel becher fino a quando non è pronto per l'uso. Per realizzare l'elettrodo di riferimento ISME, riempire un elettrodo con cloruro di potassio 500 millimolare e conservarlo in un becher.Rivestire le punte dell'elettrodo utilizzando una soluzione di circa il 3,5% di cloruro di polivinile, disciolto in tetraidrofurano, per evitare lo spostamento dello ionoforo quando immerso in olio di paraffina. Per calibrare l'elettrodo di sodio, posizionare 10 goccioline di microlitro di cloruro di sodio a concentrazioni standard sul bordo del piatto ramsey con i tubuli malpighiani incubati. Posiziona le goccioline standard a due centimetri di distanza con la maggiore concentrazione in cima.Inserire sia l'elettrodo di riferimento che l'elettrodo iono-selettivo sopra i fili d'argento cloruro e fissarli saldamente utilizzando portaelettrodi collegati a micropolmulatori. Navigare entrambi gli elettrodi verso la goccia di cloruro di sodio da 200 millimolari utilizzando i micropol manipolatori, assicurandosi che le punte elettriche non tocchino il fondo del piatto. Accendere l'elettrometro per avviare la registrazione e consentire alla lettura di stabilizzarsi.Registrare la lettura e passare allo standard successivo. Dopo aver acquisito le misurazioni della velocità di secrezione del fluido, spostare con attenzione gli elettrodi selettivi di riferimento e ionici nella goccia secreta utilizzando i micropolmulatori. Attiva la registrazione e consenti alla lettura di stabilizzarsi, quindi registra.Accendere l'amplificatore ionico/polarografico IPA-2, il microscopio ottico e i computer. Posizionare il microelettrodo selettivo del sodio su un supporto costituito da un filo di cloruro d'argento e collegarlo al jack del connettore femmina. Rimuovere un elettrodo di riferimento dal becher con il cloruro di potassio, posizionando un dito a un'estremità e inclinando il capillare di vetro verso questo dito per evitare che l'agar cada.Posizionare con attenzione un'estremità nel supporto, assicurandosi che non si formino bolle. Se c'è una bolla, rimuovere l'elettrodo di riferimento, riempire il supporto con tre cloruro di potassio molare e ripetere. Posizionare il supporto dell'elettrodo nel jack del connettore femmina.Dopo la calibrazione, sezionare l'organo. Posizionare il piatto di poli-L-lisina con il campione sezionato sul palco del microscopio e inserire la punta dell'elettrodo di riferimento all'interno della soluzione salina. Immergere la punta del microelettrodo iono-selettivo nella soluzione salina, facendo attenzione a non rompere la punta.Utilizzare le manopole di regolazione manuale per regolare la posizione del microelettrodo mentre si guarda al microscopio ottico. Regolare la posizione verticale del microelettrodo in modo che la sua punta si trovi sullo stesso piano dell'organo o del tessuto, quindi ruotare l'interruttore del motore per abilitarlo. Utilizzando i tasti freccia del computer, spostare il microelettrodo orizzontalmente in una posizione a tre millimetri di distanza dal tessuto per misurare le registrazioni in background.Quando sei pronto, inizia a registrare premendo F5, ottieni cinque misurazioni dell'attività in background. Spostare la punta del microelettrodo vicino al tessuto facendo attenzione a non perforare l'organo. Ridurre la sensibilità al tasto per posizionare la punta del microelettrodo di due micrometri direttamente a destra, perpendicolare al tessuto.Ottenere tre registrazioni nel sito lungo il pad rettale per identificare il sito di maggiore attività ionica, quindi ottenere misurazioni saline di base nel sito che mostra la maggiore attività. Per registrare le contrazioni dell'intestino posteriore, riempire uno dei pozzetti del piatto con un volume noto di soluzione salina Aedes. Dopo la dissezione, trasferire con cura l'intestino posteriore sezionato attaccato all'intestino medio in un pozzo in un altro piatto, assicurandosi di non pizzicare l'ileo.Immergere l'intestino nella soluzione salina all'interno del pozzo e posizionare i perni di Minutien nell'intestino medio e nel retto. L'ileo non deve essere sotto tensione e devono essere osservate contrazioni spontanee originate dalla valvola pilorica all'ileo anteriore. Collegare la videocamera al microscopio stereoscopico.Quindi posizionare il piatto contenente l'organo sezionato sotto il microscopio e registrare un video per due minuti. L'applicazione di DH31 contro i tubuli malpighiani non stimolati provoca un significativo aumento del tasso di secrezione dei liquidi, confermando il suo ruolo di ormone diuretico nelle zanzare Aedes. Quando i tubuli sono trattati con AedaeCAPA-1, si osserva una riduzione del tasso di secrezione nei tubuli malpighiani stimolati da DH31.Gli elettrodi ionoselettivi sono stati utilizzati per misurare le concentrazioni di sodio nelle goccioline secrete. Il trattamento di DH31 sulle MT non ha avuto alcun effetto sulla concentrazione di sodio nella goccia secreta. Tuttavia, con l'applicazione di AedaeCAPA-1, la concentrazione di sodio nel fluido secreto è stata significativamente aumentata.Inoltre, rispetto ai controlli non stimolati, DH31 ha portato a un tasso di trasporto del sodio significativamente maggiore, mentre AedaeCAPA-1 ha abolito questo aumento dei tubuli stimolati da DH31. Il SIET è stato utilizzato per valutare i cambiamenti nel trasporto di sodio lungo l'epitelio del cuscinetto rettale delle zanzare femmine adulte. Un analogo della leucochinina è stato utilizzato per esaminare i cambiamenti nell'assorbimento del sodio, che ha comportato una diminuzione di quattro volte dell'assorbimento del sodio rispetto al controllo salino.Per valutare il ruolo di un neuropeptide pirochinina2 sulla motilità ileale, è stato utilizzato un analogo di Rhodnius prolixus, che in precedenza aveva dimostrato di attivare il recettore A.aegypti PK2 arricchito nell'ileo della zanzara. Rispetto ai livelli basali, PK2 inibisce significativamente le contrazioni ileali. Quando si esegue un test Ramsay con tubuli malpighiani e si misurano i tassi di secrezione di ioni o liquidi, è imperativo che i tubuli non vengano danneggiati durante la dissezione o durante il trasferimento nel piatto del saggio.Dopo il test di Ramsay, specifici trasportatori di membrana possono essere mirati farmacologicamente o molecolarmente utilizzando tecniche genetiche inverse per discernere il loro contributo specifico al trasporto transepiteliale di soluti nell'epitelio semplice.

Research

JoVE Journal

Biology

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Iniezione intraperitoneale in Zebrafish adulti

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Ricerca

Biologia

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Zebrafish adulti

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fisiologici Registrazioni e RNA sequenziamento delle appendici gustative del Mosquito febbre gialla<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Misura della larvali attività nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Un sistema di BW Reporter per lo studio di interazioni recettore-ligando

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...