Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
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この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)ディスカバリー助成金からADおよびJ-PPへの資金提供を受けました。ALとFSは、彼らの大学院研究を支援するためにNSERC CGS-M賞を受賞しました。

1. シリコーン張りの皿作り
注: この手順は、実験の前に行う必要があります。これらのディッシュは、解剖のためのアッセイディッシュ、および収縮アッセイ実験のために作製されるであろう。
<ol><li>製造元の推奨事項に従って、シリコーンエラストマーキットを使用してシリコーンを準備します。2液からなる液体成分を10対1の割合で混合する。反転させて優しく徹底...

血液ミールを摂取するとき、ヘマトファガス昆虫はヘモリンパ中の過剰な溶質と水の課題に直面します2。これに対処するために、彼らはホルモン因子によって厳密に制御され、昆虫が食後の利尿を迅速に開始することを可能にする特殊な排泄システムを有する。Ramsayアッセイおよびイオン選択的微電極の使用により、単離された昆虫MTにおけるイオン濃度および輸送速度と?...

昆虫の塩分と水位を維持することで、さまざまな摂食戦略を利用して、多くの生態学的および環境的ニッチで成功することができます1。ほとんどの昆虫は、特定の環境に関連するさまざまな課題に耐えるために、狭い範囲内でヘモリンパの組成を調節するメカニズムを進化させてきました2。陸生昆虫はしばしば水を節約するという課題に直面し、排泄システムは水といくつかの必須塩の損失を防ぐために抗利尿を受け、したがって乾燥を避ける。対照的に、利尿は、昆虫が餌を与え、過剰な水と潜在的に塩で挑戦されるときに起こります3,4。その専門的で非常に活性な排泄システムを通じて、昆虫は浸透圧調節の課題に対抗するように作用する調節機構を進化させました。成虫のヒトスジシマカでは、排泄系はマルピーギ尿細管(MT)と後腸で構成され、後者は前回腸と後直腸で構成されています5。MTは一次尿を生成する役割を担っており、通常はNaClおよび/またはKClが豊富です。一次尿は、尿細管の下流に移動し、後腸に入るにつれて、分泌および再吸収プロセスを通じて修正されます5。最終的な排泄物は、摂食/環境条件に応じて、ヘモリンパに対して高浸透圧または低浸透圧であり、有毒で窒素性の廃棄物に富んでいます2。
MTは、多種多様な輸送および排泄機能を実行するため、上皮液および溶質輸送の多くの特徴を研究するのに理想的です2,6。ホルモン調節2により、MTは血液から尿細管腔にイオンやその他の溶質を分泌することによって機能し7、浸透圧勾配を提供し、水がアクアポリン8,9によって輸送され、一次尿が集合的に生成され、その後部胃に向かって移動します2。したがって、単離されたMTから分泌流体を収集することによって、流体およびイオンの経上皮輸送を連続的に監視することができる。分泌速度と尿組成を測定することで、経上皮イオンと体液輸送を担うメカニズムに関する洞察が得られます。体液分泌速度を研究するための一般的な方法は、195310年にラムゼイによって最初に導入されたラムゼイアッセイである。この方法では、尿細管の遠位(閉じた)端をホルモン(または他の試験化合物/薬物)で処理し、近位(開いた)端を水飽和パラフィン油のピンに巻き付け、一次尿を分泌し、ピンの先端に液滴として蓄積する。単離されたMTは、最適化されたin vitro条件下で長期間(最大24時間)生存し、機能することができるため、流体分泌測定に適切で効率的なモデルになります。昆虫は開いた循環器系を持っているので、MTは通常ヘモリンパに自由に浮遊しているので、MTは容易に解剖され、取り除かれます6。さらに、MTs11を欠いているアブラムシを除いて、特定の昆虫種のMTの数は4から数百(ヒトスジシマカでは5匹)とかなり異なり、1つの昆虫から複数の測定が可能です。
ヒトスジシマカの蚊のMTは、他の内翅目昆虫と同様に、単純な上皮を形成する2つの細胞型で構成されています2,12;内腔への陽イオン(すなわち、Na+およびK+)の能動的輸送を促進する大きな主細胞、および経上皮のCl-分泌を助ける薄い星状細胞13。MTは神経支配されておらず2、代わりに利尿作用因子と抗利尿因子の両方を含むいくつかのホルモンによって調節され、イオン輸送(主にNa+、K+、Cl-)と浸透圧義務水2の制御を可能にします。多くの研究が、経上皮輸送における内分泌因子の役割を理解するために、ヒトスジシマカMTのホルモン調節を調べてきました14,15,16,17,18。代表的な結果に示されているように、本明細書のプロトコールは、利尿薬および抗利尿薬の両方の対照を含む、成体雌のA. aegypti蚊から単離されたMTに対する異なるホルモン因子の効果を実証する(図1)。ラムゼイアッセイは、抗利尿ホルモンAedaeCAPA-1が利尿ホルモン31(DH31)によって刺激されたMTの体液分泌をどのように阻害するかを実証するために使用されます(図1)。
昆虫のサイズが小さいほど、流体サンプル中のイオン活性および濃度、またはMTや腸などの単離された組織の表面近くを測定するためのマイクロ法の開発が必要であった。イオン濃度の測定のために分泌された液体滴の収集を必要とするイオン19の放射性同位元素の使用を含む、様々な方法が実施されている20。インビトロで刺激された ヒトスジシマカ の尿細管は、典型的には〜0.5nL/min21を分泌するので、このような少量の取り扱いは困難をもたらし、潜在的に転写時にエラーを引き起こす可能性がある。その結果、イオン選択的微小電極(ISME)は、MTの分泌液滴中のイオン濃度をインビトロで測定するために広く使用されている。この方法では、適切なバックフィル溶液およびイオノフォアで満たされた参照電極およびISMEを、分泌された尿液滴内に配置して、イオン濃度を決定する22。Doniniら23から採用されたこの現在のプロトコルは、Na+選択的イオノフォアを使用して、成虫の ヒトスジシマカ の刺激MTから分泌された液滴中のイオン活性を測定する。イオン選択微小電極はイオン活性を測定するため、このデータは、校正溶液と実験サンプルが同じイオン活性係数21 を共有するという仮定に従ってイオン濃度として表すことができます(図1B、C)。
走査型イオン選択電極技術(SIET)は、ISMEを使用して、イオンを輸送している器官、組織、または細胞に隣接する未攪拌層のイオン濃度勾配を測定する。ISMEは電圧勾配を測定し、これを使用してイオン濃度勾配と、臓器、組織、または細胞全体のイオン流束の方向と大きさを計算することができます20。この技術では、ISMEは、その3D位置がマイクロメータレベル20に制御されるように、コンピュータ化されたマイクロステッピングモータによって制御される3軸マニピュレータに取り付けられる。電圧は、コンピュータソフトウェアにプログラムされ、制御されるサンプリングプロトコルを使用して、攪拌されていない層内の2点で測定されます。2 つの点は、通常、臓器、組織、または細胞の表面から 5 ~ 10 μm 以内の 1 つの点と、さらに 20 ~ 100 μm 離れた 20 ~ 100 μm の距離で区切られます。2点間の電圧の大きさの差を計算して電圧勾配24,25,26を得,次にこれを用いて濃度勾配を計算し,続いてフィックの法則24,27を用いて正味磁束を計算する。この方法は、昆虫の腸およびMTの異なる領域にわたる特定のイオンの輸送を評価するために、または血液ミールまたは治療曝露後の特定の時点で評価するために有用である。例えば、SIETは、蚊の排泄系における吸収性および分泌性プロセスがホルモン28、ならびに異なる摂食行動および飼育条件によってどのように調節されるかを理解するために使用することができる25。SIETを利用したこれまでの研究では、幼虫や成虫の蚊の肛門乳頭や直腸に沿ったイオン輸送に関与している部位が明らかになりました24,28。Paluzziら26によって以前に記述された現在のプロトコルは、成人女性の直腸の直腸パッド上皮を横切るNa+フラックスを測定する(図2)。
蚊の排泄システムの最後の部分では、食物を混ぜて老廃物を分泌するのを助けるために、調整された筋肉の動きが必要です26。中腸からの消化の非吸収性生成物は、MTによって分泌される一次尿とともに、幽門弁を通過し、後腸に送達される2。自発的な後腸収縮は幽門弁から始まり、蠕動波で起こり、上皮細胞の基底表面を囲む円形および縦方向の筋肉の協調収縮を介して回腸上に中継される26。最後に、直腸内の筋肉は、肛門管を通って老廃物を推進し、排除するのに役立つ。昆虫の後腸運動性は筋原性であり、自発的な収縮を生じるために細胞外Ca2+を必要とするが、これらの過程は神経細胞的に調節することもできる26,29,30。神経系によるこの外因性調節は、動物が腸から老廃物を排出し、血リンパバランスを回復させなければならないため、摂食後に重要です31。その結果、筋刺激性または筋抑制性神経ペプチドを同定するためにインビトロバイオアッセイを行うことは、神経化学物質が後腸運動性にどのように影響するかを評価するのに有用である。LajevardiとPaluzzi28によって実施された現在のプロトコルは、ビデオ録画を使用して、神経ペプチドに応答した回腸運動性を調べている(図3)。同様に、力変換器またはインピーダンス変換器もまた、データ収集ソフトウェア32,33を介して収縮の痕跡を観察するために使用され得る。しかし、ビデオ技術を使用することで、臓器を視覚的に評価し、パラメータのサブセットを使用してさらに分析し、後腸の運動性に対するホルモンの役割を特定することができます。
これらの技術を使用すると、後腸の運動性とともに排泄系に沿った流体およびイオン輸送を調節および調整する因子を特徴付けるのに役立つ可能性がある。重要なことに、MTsによる利尿反応と後腸運動との間の機能的リンクが支持されており、DH31および5HTなどの利尿ホルモンは、MTsによる体液分泌を刺激する能力によって特徴付けられ、蚊の後腸に沿って筋向性作用を示すことも見出されている21,34,35.この新知見は、迅速な老廃物除去を必要とする昆虫における食後利尿などの事象において、MTと後腸との間の厳格な調整の重要性を強調している。
本明細書では、蚊、 A. aegyptiにおける流体分泌速度を測定するためのラムゼイアッセイ技術の背後にある詳細なアプローチ、およびMTsの分泌流体中のNa+ 濃度を決定するためのイオン選択的微小電極の使用が記載されており、これを組み合わせると、経上皮イオン輸送速度が決定されることを可能にする。さらに、スキャニングイオン選択電極法と後腸収縮アッセイは、それぞれイオンフラックスと運動性を測定するために記載されており、後腸のホルモン調節を解明するのに役立ちます(図4)。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

昆虫生理学の研究、特にヒトおよび他の脊椎動物に疾患を引き起こす病原体のベクターであるこれらの種において、有害生物防除のための新規戦略を開発するための基礎を提供する。ここでは、蚊、Aedes aegyptiの排泄系における神経ペプチドおよび他のニューロン因子(すなわち、生物起源アミン)の機能的役割を決定するために日常的に利用されている一連の方法が記載されている。一次尿形成の原因となるマルピーギ尿細管(MT)は、蚊から取り除かれても何時間も機能し続けることができ、ホルモン治療後の体液分泌測定を可能にします。そのため、ラムゼイアッセイは、単離されたMTからの分泌速度を測定するのに有用な技術であり、イオン選択微小電極(ISME)は、分泌流体中のイオン濃度(すなわち、Na+およびK+)を測定するために連続的に使用することができる。このアッセイは、所与の時間にいくつかのMTの測定を可能にし、様々なホルモンおよび薬物の効果を決定する。走査型イオン選択電極技術は、ISMEを使用してイオン輸送器官の表面に隣接する非攪拌層におけるイオン活性を表す電圧を測定し、イオンの経上皮輸送をほぼリアルタイムで決定する。この方法は、上皮全体のイオン吸収または分泌に対するホルモンおよび他の調節因子の役割を理解するために使用することができる。後腸収縮アッセイはまた、筋活性神経ペプチドを特徴付けるための有用なツールであり、それは過剰な体液および老廃物を除去するこの器官の能力を増強または減少させる可能性がある。全体として、これらの方法は、成虫の蚊において排泄系がどのように調節されているかについての洞察を提供する。排泄器官の機能的協調は、排泄後および血液ミールを得るために適切な脊椎動物宿主を見つける前に、乾燥ストレスなどの課題を克服する上で重要であるため、これは重要である。

非刺激MTに対するDH31の適用は、体液分泌速度の有意な増加をもたらし、ヒトスジシマカにおける利尿ホルモンとしての役割を確認した(図1A)。細管をAedaeCAPA-1で処理すると、DH31刺激MTで分泌速度の低下が観察されます。図1Bは、分泌された液滴中のNa+濃度を測定するためにイオン選択電極を使用することを示し?...

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Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

このプロトコルは、ラムゼイアッセイ、イオン選択微電極、走査型イオン選択電極技術(SIET)、およびインビトロ収縮アッセイの背後にある方法論を概説し、マルピーギ尿細管と後腸からなる成虫の蚊排泄系を研究するために適用され、イオンおよび流体分泌速度、収縮活性、および経上皮イオン輸送を集合的に測定する。

成虫の蚊における排泄系の神経ペプチドおよび他の調節因子の活性の研究

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

このプロトコルは、消化器系およびまたは排泄系を調節する神経ペプチドおよび他のホルモン因子の役割を解明するために小動物生理学者によって利用され得る技術を記述する。これらの技術は、例えばげっ歯類およびテレウスを含むより大きな動物モデル用に特別に設計された技術を使用しては不可能であろうマイクロサイズの生物学的サンプルの測定を可能にする。この方法は、昆虫および同様のサイズの非昆虫種における上皮および胃腸管に関連する平滑筋の輸送を含む、腸の内分泌調節に関する洞察を提供することができる。昆虫腎尿細管の手順を実証するのは、私の研究室の博士候補であるFarwa Sajadiです。さらに、私の研究室の元大学院生アーリアン・ラジェヴァルディが、後腸に焦点を当てたプロトコルを実証します。実験用のラムゼイおよび収縮アッセイ皿を準備することから始めます。ピペットを使用し、ウェルに最大20マイクロリットルの溶液を充填します。無刺激対照の場合、ウェルを20マイクロリットルのヒトスジシマカ生理食塩水シュナイダー培地で満たします。すべてのウェルが満たされたら、ウェルとミヌティエンピンが水没するまで、水和鉱物油をアッセイ皿に注ぎます。細管を井戸に浸した後、鉗子で細管の近位端を拾い上げ、入浴液滴から取り出し、端をピンに巻き付けます。チューブをピンに2回巻き付けて、入浴液滴に残っている細管の長さを他のチューブと一致させます。ナトリウム選択的微小電極を作るには、1ミリリットルのシリンジを使用して、電極に100ミリモルの塩化ナトリウムをバックフィルします。バックフィル溶液が電極の先端まで充填されていることを確認します。気泡が現れた場合は、微小電極を軽くフリックするか、溶液を取り出して補充してください。10マイクロリットルのピペットチップをナトリウム選択イオノフォア溶液に浸します。電極をピペットに垂直に整列させ、手袋をはめた指を先端の底の上に置き、圧力を作り出し、少量のイオノフォアを排出します。イオノフォアの滴を微小電極の先端に注意深く触れ、それを壊さないようにしてください。小さなビーカーに100ミリモルの塩化ナトリウムを半分入れ、ビーカーの上部にある内側にモデリング粘土を置きます。イオノフォアを取り上げたら、電極チップをビーカーの壁に置き、チップを塩化ナトリウムの中に入れます。ISMEは、使用する準備ができるまでビーカーに入れたままにしておきます。ISME参照電極を作るには、電極に500ミリモルの塩化カリウムをバックフィルし、ビーカーに保管します。パラフィンオイルに沈んだときのイオノフォアの変位を避けるために、テトラヒドロフランに溶解した約3.5%のポリ塩化ビニルの溶液を使用して電極先端をコーティングする。ナトリウム電極を較正するために、インキュベートされたマルピーギ尿細管を有するラムジー皿の端に、標準濃度の塩化ナトリウムの10マイクロリットルの液滴を置く。標準液滴を2センチ離して、濃度の高いものを上に置きます。参照電極とイオン選択電極の両方を塩化銀線の上に挿入し、マイクロマニピュレータに取り付けられた電極ホルダーを使用してしっかりと固定します。マイクロマニピュレーターを使用して両方の電極を200ミリモルの塩化ナトリウム液滴に向かって移動させ、電気先端が皿の底に触れないようにします。エレクトロメーターをオンにして録音を開始し、読み取り値を安定させます。読み取り値を記録し、次の標準に進みます。流体分泌速度の測定値を取得した後、マイクロマニピュレータを使用して、基準電極とイオン選択電極を分泌液滴に慎重に移動させます。記録をオンにし、読み取りが安定するようにしてから、記録します。IPA-2イオン/ポラログラフィックアンプ、光学顕微鏡、およびコンピュータの電源を入れます。塩化銀線からなるホルダーにナトリウム選択微小電極を置き、メスコネクタジャックに取り付けます。塩化カリウムを入れたビーカーから参照電極を1つ取り出し、片方の指を1本ずつ置き、寒天が落ちないようにガラスキャピラリーをこの指に向かって傾けます。片方の端をホルダーに慎重に置き、泡が形成されないようにします。気泡がある場合は、参照電極を取り外し、ホルダーに3モルの塩化カリウムを補充して繰り返します。電極ホルダーをメスコネクタジャックに差し込みます。較正後、器官を解剖する。解剖した試料の入ったポリL-リジン皿を顕微鏡ステージ上に置き、参照電極の先端を生理食塩水の内部に挿入する。イオン選択微小電極の先端を生理食塩水に沈め、先端を壊さないように注意する。手動調整ノブを使用して、光学顕微鏡の下を見ながら微小電極の位置を調整します。微小電極の先端が器官または組織と同じ平面上にあるように微小電極の垂直位置を調整し、モータースイッチを回して有効にします。コンピュータの矢印キーを使用して、マイクロ電極を組織から3ミリメートル離れた位置に水平に動かし、バックグラウンド記録を測定します。準備ができたら、F5を押して記録を開始し、バックグラウンドアクティビティの5つの測定値を取得します。微小電極先端部を組織に近づけて、臓器を突き刺さないように注意する。キーヒット感度を下げて、マイクロ電極チップを2マイクロメートル右に直接、組織に対して垂直に配置します。直腸パッドに沿った部位で3つの記録を取得して、最もイオン活性の高い部位を特定し、次いで、最も活性を示す部位でベースライン生理食塩水測定値を得る。後腸の収縮を記録するには、皿の井戸の1つを既知の量のヒトスジシマカの生理食塩水で満たします。解剖後、中腸に付着した解剖後腸を別の皿の井戸に慎重に移し、回腸をつまないようにします。井戸の中の生理食塩水に腸を浸し、ミヌティエンピンを腸の真ん中と直腸に入れます。回腸は緊張状態であってはならず、前回腸の幽門弁に由来する自発的な収縮が観察されるべきである。ビデオカメラを実体顕微鏡に接続します。次に、解剖した臓器を含む皿を顕微鏡下に置き、ビデオを2分間録画する。無刺激マルピーギ尿細管に対するDH31の適用は、体液分泌速度の有意な増加をもたらし、ヒトスジシマカにおける利尿ホルモンとしての役割を確認する。細管をAedaeCAPA-1で処理すると、DH31刺激マルピーギ尿細管において分泌速度の低下が観察される。イオン選択電極は、分泌された液滴中のナトリウム濃度を測定するために使用した。MTsに対するDH31の処理は、分泌された液滴中のナトリウム濃度に影響を及ぼさなかった。しかし、AedaeCAPA-1の適用により、分泌液中のナトリウム濃度は有意に増加した。さらに、非刺激対照と比較して、DH31は有意に高いナトリウム輸送速度をもたらしたが、AedaeCAPA-1はDH31刺激尿細管のこの増加を消失させた。SIETは、成体雌蚊の直腸パッド上皮に沿ったナトリウム輸送の変化を評価するために使用された。ロイコキニン類似体を用いてナトリウム吸収の変化を調べたところ、生理食塩水対照と比較してナトリウム吸収が4倍減少した。回腸運動性に対する神経ペプチドピロキニン2の役割を評価するために、蚊回腸に富むA.aegypti PK2受容体を活性化することが以前に示されたRhodnius prolixus類似体を使用した。ベースラインレベルと比較して、PK2は回腸収縮を有意に阻害する。マルピーギ尿細管を用いてラムゼイアッセイを実施し、イオンまたは流体の分泌速度を測定する場合、解剖中またはアッセイ皿への移送中に細管が損傷を受けないことが不可欠です。Ramsayアッセイに続いて、特定の膜トランスポーターを、逆遺伝学的手法を使用して薬理学的または分子的に標的化し、単純な上皮における溶質の経上皮輸送に対するそれらの特異的な寄与を識別することができる。

Research

JoVE Journal

Biology

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