Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC) AD 및 J-PP에 대한 발견 보조금에 의해 투자되었습니다. AL과 FS는 대학원 연구를 지원하기 위해 NSERC CGS-M 상을 수상했습니다.

1. 실리콘 안감이 있는 요리 만들기
참고: 이 단계는 실험 전에 수행해야 합니다. 이 요리는 해부를위한 분석 접시를 준비하고 수축 분석 실험을 위해 만들어집니다.
<ol><li>제조업체의 권장 사항에 따라 실리콘 엘라스토머 키트를 사용하여 실리콘을 준비합니다. 2부리 액체 성분을 10 대 1의 비율로 혼합합니다. 반전하여 부드럽고 철저하게 섞지만 거품 형성을 최소화하십시오...

혈액 식사를 섭취 할 때, haematophagus 곤충은 그들의 혈성 림프2에 과잉 solutes및 물의 도전에 직면합니다. 이에 대처하기 위해, 그들은 호르몬 요인에 의해 단단히 통제되는 전문 배설 시스템을 가지고 있어 곤충이 급속히 후 prandial 이뇨를 시작할 수 있습니다. 램지 분석 및 이온 선택적 미세 전극의 사용은 격리 된 곤충 MT에서 이온 농도 및 전송 속도와 함께 유체 분비 속도를 측정 ...

곤충의 소금과 수위 유지를 통해 다양한 수유 전략을 활용하여 많은 생태 및 환경 틈새 시장에서 성공할 수 있습니다1. 대부분의 곤충은 특정 환경과 관련된 다양한 과제를 견딜 수 있도록 좁은 한계 내에서 혈청림프의 조성을 조절하는 메커니즘을 진화시켰습니다2. 육상 곤충은 종종 물을 보존하는 도전에 직면하고 배설 시스템은 물과 일부 필수 염의 손실을 방지하기 위해 안티 이뇨제를 겪습니다, 따라서, 건조를 피하기. 대조적으로, 이뇨는 곤충이 공급하고 과잉 물과 잠재적으로 소금3,4로 도전할 때 생깁니다 3,4. 곤충은 전문적이고 능동적인 배설 시스템을 통해 삼투규제 문제에 대응하기 위해 작용하는 규제 메커니즘을 발전시켰습니다. 성인 Aedes aegypti 모기에서 배설 시스템은 말피기안 튜벌레 (MT)와 힌드구트로 구성되어 있으며, 그 중 후자는 전방 장막과 후방 직장5로 구성됩니다. MT는 1 차적인 소변을 생성에 대 한 책임, 일반적으로 NaCl 및/또는 KCl에 풍부한. 1 차적인 소변은 그 때 관의 하류를 여행하고 hindgut5를 입력할 때 분비및 재봉경 과정을 통해 수정됩니다. 최종 배설물은 수유/환경 조건에 따라 혈성 림프에 대한 하이퍼 또는 저체산소성일 수 있으며 독성 및 질소 폐기물2에서 농축됩니다2.
MT는 다양한 교통 및 배설 기능을 수행하므로 상피 유체 및 솔루트 운송의 많은 기능을 연구하는 데 이상적입니다2,6. 호르몬 조절을 통해2, MT는 혈액에서 튜룰 루멘7로 이온 및 기타 솔루트를 분비하여 기능하며, 수중 포린스8,9에 의해 물을 수송할 수 있도록 하는 삼투성 그라데이션을 제공하여 1차 소변을 종합적으로 생성하며, 이는 재흡수형 힌구트2로 이동한다2. 따라서, 격리된 MT로부터 분비된 액체를 수집함으로써, 유체 및 이온의 환피성 수송을 지속적으로 모니터링할 수 있다. 분비 속도와 소변 구성측정은 환피성 이온 및 유체 수송을 담당하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 유체 분비 율을 연구하기위한 인기있는 방법은 램지 분석입니다, 이는 램지에 의해 처음 도입 된 195310. 이 방법에서, 튜블러의 말단 (폐쇄) 끝은 호르몬 (또는 다른 시험 화합물/약물)으로 취급되는 반면, 근위 (개방) 끝은 1 차 소변을 분비하는 수포화 파라핀 오일의 핀 주위에 감싸고, 핀의 끝에 액적으로 축적된다. 격리된 MT는 생체외 조건에 최적화된 환경에서 장기간(최대 24시간) 동안 생존하고 작동할 수 있어 유체 분비 측정에 적합하고 효율적인 모델을 제공합니다. 곤충은 개방 순환 시스템을 가지고, 따라서 MT는 쉽게 해부하고 일반적으로 혈몰리프6에 자유롭게 떠 있기 때문에 제거된다. 또한, MTs11이 부족한 진딧물을 제외하고, 특정 곤충 종의 MT 수는 4개에서 수백 개(Aedes 모기 5개)로 크게 달라질 수 있어 곤충 1마리에서 여러 측정을 할 수 있습니다.
Aedes 모기의 MT는 다른 엔옵티고트 곤충과 공통적으로, 간단한 상피2,12를 형성하는 2개의 세포 모형으로 이루어집니다; 광피 성 Cl-분비13에 도움이 되는 용온(즉, Na+및 K+)의 활성 수송을 용이하게 하는 대형 주체 세포( 즉, Na+및 K+)와 얇은 스텔레이트 세포. MT는 innervated2, 대신 이뇨제 및 반대로 이뇨 요인을 모두 포함 하 여 여러 호르몬에 의해 규제, 이온 전송의 제어를 허용 (주로 Na+, K+, 그리고 Cl-) 그리고 osmotically 의무 물2. 수많은 연구는 일시적인 전송에 내분비 요인의 역할을 이해하기 위해 Aedes MTs의 호르몬 조절을 조사14,15,16,17,18. 대표적인 결과에 나타난 바와 같이, 본 원에서 의정서는 이뇨제 및 항이뇨제 대조군을 포함하는 성인 여성 A. aegypti 모기로부터 분리된 MT에 대한 상이한 호르몬 인자의 효과를 보여준다(그림 1). 램지 분석은 항 이뇨 호르몬, AedaeCAPA-1, 이뇨 호르몬에 의해 자극 된 MT의 유체 분비를 억제 하는 방법을 입증 하는 데 사용 됩니다 31 (DH31) (그림 1).
곤충의 작은 크기는 유체 샘플에서 이온 활성 및 농도를 측정하기위한 마이크로 방법의 개발을 요구하고있다, 또는 MT및 창자와 같은 고립 된 조직의 표면 근처. 이온 농도의 측정을 위해 분비된 유체 방울의 수집이 필요한 이온19의 방사성 동위원소 의 사용을 포함하여 다양한 방법이 구현되었다20. 체외에서 자극 Aedes tubules 일반적으로 분비 ~0.5 nL/min21, 따라서 이러한 작은 볼륨의 처리 는 도전을 제기 하 고 잠재적으로 전송 시 오류를 소개할 수 있습니다. 그 결과, 이온 선택적 마이크로전극(ISMEs)은 시험관내 MT의 분비된 액적에서 이온 농도를 측정하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 이 방법에서, 적절한 백필 용액 및 이오노포어로 채워진 기준 전극 및 ISME는 이온 농도22를 결정하기 위해 분비된 소변 방울에 배치된다. 도니니와 동료23에서 적응, 이 현재 프로토콜은 성인 Aedes 모기에 자극 된 MT에서 분비 된 방울에서 이온 활동을 측정하기 위해 Na +선택적 ionophore를 사용합니다. 이온 선택적 미세 전극은 이온 활성을 측정하기 때문에, 이 데이터는 교정 솔루션 및 실험 샘플이 동일한 이온 활성 계수를 공유한다는 가정에 따라 이온 농도로 표현될 수 있다(도 1B,C).
스캐닝 이온 선택적 전극 기술(SIET)은 또한 ISMEs를 사용하여 이온을 운반하는 장기, 조직 또는 세포에 인접한 교반되지 않은 층의 이온 농도 그라데이션을 측정합니다. ISMEs는 전압 그라데이션을 측정한 다음 장기, 조직 또는 cell20을 가로지르는 이온 농도 그라데이션 및 방향 및 크기 및 크기를 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기법에서 ISME는 전산화된 마이크로 스테퍼 모터에 의해 제어되는 3개의 축 조작기에 장착되어 3D 위치가 마이크로미터 레벨20으로 제어됩니다. 전압은 컴퓨터 소프트웨어에 의해 프로그래밍되고 제어되는 샘플링 프로토콜을 사용하여 교반되지 않은 레이어 내의 두 지점에서 측정됩니다. 두 점은 전형적으로 장기, 조직 또는 세포의 표면의 5-10 μm 이내의 1점과 20-100 μm의 거리로 구분되며 두 번째 점은 20-100 μm 더 멀리 떨어져 있다. 두 점 사이의 전압 의 크기 차이는 전압 그라데이션을 얻기 위해 계산24,25,26, 이는 다음 농도 그라데이션을 계산하고 그 후 Fick의 Law24,27을 사용하여 순 플럭스를 계산하는 데 사용된다. 이 방법은 곤충 창자와 MTs의 다른 지역에 걸쳐 특정 이온의 수송을 평가하는 데 유용, 또는 혈밀 또는 치료 노출 다음 특정 시점에서. 예를 들어, SIET는 모기 배설 시스템의 흡수 및 분비 과정이 호르몬28뿐만 아니라 다른 수유 행동 및 양육 조건에 의해 규제되는 방법을 이해하는 데 사용할 수 있습니다25. SIET를 활용한 이전 작품은 항문 유두와 성모의 직장인을 따라 이온 수송에 관련된 사이트를 공개했다24,28. Paluzzi와 동료에 의해 이전에 기술된 현재 프로토콜26는, 성인 여성 직장의 직장 패드 상피에 걸쳐 Na+ 플럭스를 측정합니다 (그림 2).
모기 배설 시스템의 최종 세그먼트는 음식을 혼합하고 폐기물을 분비하는 데 도움이 조정 된 근육 운동이 필요합니다26. 미드구트에서 소화의 비 흡수성 제품, MT에 의해 분비 된 기본 소변과 함께, 유두 판막을 통과 하 고 hindgut2에 전달 됩니다. 자발적인 힌구트 수축은 유두 판막에서 시작하여 상피 세포의 기저 표면을 둘러싼 원형 및 세로 근육의 조정 된 수축을 통해 ileum을 통해 릴레이되는 연동 파에서 발생합니다26. 마지막으로, 직장 내근육은 항문 운하를 통해 폐기물을 추진하고 제거하는 데 도움이됩니다. 비록 곤충 힌창 운동성 근생, 자발적인 수축을 생산 하기 위해 세포 외 Ca2 + 필요, 이러한 프로세스는 또한 뉴런26,29,30 규제 될 수 있습니다. 동물이 창자에서 폐기물을 추방하고 혈굴량 균형을 복원해야하기 때문에 신경계에 의한 이 외인성 조절은 먹이기 후에 중요합니다31. 그 결과, 체외 생체 분해를 수행하여 심근 자극성 또는 심억제 신경 펩티드를 식별하는 것은 신경 화학 물질이 힌창 성 연골에 미치는 영향을 평가하는 데 유용합니다. Lajevardi와 Paluzzi28에 의해 수행된 현재 프로토콜은, 신경 펩티드에 응하여 일색 운동성을 검사하기 위하여 비디오 기록을 이용합니다 (그림 3). 마찬가지로, 힘 변환기 또는 임피던스 변환기는 데이터 수집 소프트웨어를 통해 수축의 흔적을 관찰하는 데 사용될 수도 있다32,33. 그러나 비디오 기술을 사용하면 기관을 시각적으로 평가하고 매개 변수의 하위 집합을 사용하여 추가 분석하여 힌창 성 운동성에 대한 호르몬의 역할을 식별할 수 있습니다.
이러한 기술을 사용하면 힌창 운동성과 함께 배설 시스템을 따라 유체 및 이온 수송을 조절하고 조정하는 요인을 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중요한 것은, MT에 의한 이뇨반응과 힌창성 운동성 사이의 기능적 연결고리가 지원되며, DH31 과 5HT와 같은 이뇨호르몬은 MT에 의한 유체 분비를 자극하는 능력을 특징으로 하며, 또한 모기 뒷받이21,34,35를 따라 근영양 작용을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다. . 이 사실 인정은 급속한 폐기물 제거를 요구하는 곤충에 있는 포스트 prandial 이뇨와 같은 사건 도중 MT와 hindgut 사이 엄격한 조정의 중요성을 강조합니다.
본명, 모기, A. aegypti, 및 이온 선택적 마이크로전극의 사용을 측정하기 위한 램지 분석 기술의 뒤에 상세한 접근법이 설명되어 있으며, 이는 결합될 때 일시적인 이온 수송 속도를 결정할 수 있다. 또한, 스캐닝 이온 선택적 전극 기술과 힌드구트 수축 분석법은 각각 이온 플럭스와 운동성을 측정하여 힌드구트의 호르몬 조절을 해명하는 데 도움이 된다(도 4).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

곤충 생리학의 연구, 특히 인간과 다른 척추 동물에서 질병을 일으키는 병원균의 벡터인 그 종에서, 해충 방제에 대한 새로운 전략을 개발하는 기초를 제공합니다. 여기서, 모기, Aedes aegypti의 배설 시스템에 신경펩티드 및 기타 뉴런 인자(즉, 생생아민)의 기능적 역할을 결정하기 위해 일상적으로 활용되는 일련의 방법이 기재된다. 1 차적인 소변 형성을 담당하는 말피기안 튜블러 (MTs)는 모기에서 제거 될 때 몇 시간 동안 계속 작동 할 수 있으므로 호르몬 치료에 따라 유체 분비 측정을 허용합니다. 이와 같이, 램지 분석법은 분리된 MT로부터 분비 속도를 측정하는 유용한 기술입니다. 이온 선택적 마이크로 전극(ISME)은 분비유체에서 이온 농도(즉, Na+ 및 K+)를 측정하는 데 순차적으로 사용될 수 있다. 이 분석은 주어진 시간에 여러 MT의 측정을 허용, 다양한 호르몬과 약물의 효과를 결정. 스캐닝 이온 선택적 전극 기법은 ISME를 사용하여 이온 수송 기관의 표면에 인접한 교반되지 않은 층에서 이온 활성을 대표하는 전압을 측정하여 거의 실시간으로 이온의 환피성 수송을 결정합니다. 이 방법은 상피를 통해 이온 흡수 또는 분비에 호르몬과 다른 레귤레이터의 역할을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 힌구트 수축 소는 또한 근활성 신경 펩티드를 특성화하는 유용한 도구입니다, 그 향상하거나 과잉 유체와 폐기물을 제거하는이 기관의 능력을 줄일 수 있습니다. 전체적으로, 이 방법은 배설 시스템이 성인 모기에서 어떻게 규제되는지에 대한 통찰력을 제공합니다. 이는 배설 기관의 기능적 조정이 백과기 후 탈수 스트레스와 같은 문제를 극복하고 혈액밀을 얻기 에 적합한 척추 동물 숙터를 찾기 전에 매우 중요하기 때문에 중요합니다.

자극되지 않은 MT에 대한 DH31 의 적용은 액분비율의 현저한 증가를 초래하며, Aedes 모기에서 이뇨 호르몬으로서의 역할을 확인합니다(그림 1A). 튜블러가 AedaeCAPA-1로 처리될 때, DH31 자극 된 MT에서 분비 속도의 감소가 관찰됩니다. 그림 1B 는 분비 된 물방울에서 Na+ 농도를 측정하기 위해 이온 선택적 전극의 사용을 보...

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Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

이 프로토콜은 램지 분석, 이온 선택적 미세 전극, 스캐닝 이온 선택적 전극 기술 (SIET) 및 시험관 위축 분석 뒤에 방법론을 간략하게 설명하며, 말피기안 튜블러와 힌구트로 구성된 성인 모기 배설 시스템을 연구하기 위해 적용되어 이온 및 유체 분비 속도, 수축 활동 및 변형 변환을 공동으로 측정합니다.

성인 모기에 있는 배설 시스템의 Neuropeptides 및 그밖 규제기관의 활동을 공부하기

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

이 프로토콜은 소화 및 배설 시스템을 조절하는 신경 펩티드 및 기타 호르몬 인자의 역할을 해명하기 위해 작은 동물 생리학자에 의해 이용 될 수있는 기술을 설명합니다. 이러한 기술은 설치류 및 텔레우스와 같은 대형 동물 모델을 위해 특별히 설계된 기술을 사용하여 는 불가능한 마이크로 크기의 생물학적 샘플을 측정할 수 있습니다. 이 방법은 곤충과 유사한 크기의 비 곤충 종에서 위장관과 관련된 부드러운 근육뿐만 아니라 상피 운반을 포함하여 창자의 내분비 조절에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.곤충 신장 관 절차를 시연하는 것은 파와 사자디, 내 실험실에서 박사 후보될 것입니다. 또한, 내 실험실 에서 전 대학원 생 Aryan Lajevardi 힌구트 초점을 맞춘 프로토콜을 시연 할 것 이다. 실험을 위한 램지와 수축 분석 요리를 준비하는 것으로 시작합니다.파이펫을 사용하고 최대 20마이크로리터의 용액으로 우물을 채웁니다. 자극되지 않는 컨트롤의 경우, Aedes 식염수 슈나이더의 매체의 20 마이크로 리터로 우물을 채웁니다. 모든 우물이 채워지면 수화 미네랄 오일을 분석 접시에 붓고 우물과 미누티엔 핀이 물에 잠기때까지 붓습니다.우물에 튜룰을 담근 후, 집게로 튜블러의 근위 쪽 끝을 집어 들고, 입물방울에서 제거하고, 핀 주위에 끝을 감쌉다. 다른 튜블러와 일치하는 목욕 물방울에 남아있는 튜블러의 길이를 두 번 핀 주위에 감싸십시오. 선택적 미세 전극을 만들려면 1밀리리터 주사기를 사용하여 100밀리머 나트륨 염화나트륨으로 전극을 충전하십시오.백필 용액이 전극의 끝이 될 때까지 채워지도록 합니다. 기포가 나타나면 마이크로 전극을 부드럽게 쓸어 넘기거나 용액을 제거하고 리필하십시오. 10 마이크로리터 파이펫 팁을 나트륨 선택적 이오노포어 용액에 담급다.파이펫에 수직으로 전극을 정렬한 다음 장갑을 낀 손가락을 끝 아래쪽에 놓고 압력을 만들고 작은 이오노포어 방울을 추방합니다. 마이크로 전광제 끝에 이오노포어 방울을 조심스럽게 만져 서 그것을 깨지 않도록 하십시오. 작은 비커를 100 밀리마일라 나트륨 염화나트륨으로 중간에 채우고 일부 모델링 점토를 비커 의 상단에 내부에 놓습니다.이오노포어를 채택한 후 전극 팁을 비커 벽에 내려 놓고 염화나트륨 내의 팁을 놓습니다. ISME를 사용할 준비가 될 때까지 비커에 보관하십시오. ISME 기준 전극을 만들려면 전극에 염화칼륨 500밀리머칼륨으로 백필하여 비커에 보관하십시오.파라핀 오일에 잠수했을 때 이오노포어의 변위를 피하기 위해 테트라하이드로푸란에 용해된 약 3.5%의 폴리염화비닐용액을 사용하여 전극 팁을 코팅한다. 나트륨 전극을 보정하려면, 인큐베이션 된 말피기안 튜블러와 램지 접시의 가장자리에 염화 나트륨 표준 농도의 10 마이크로 리터 방울을 배치합니다. 표준 물방울을 2센티미터 에 더 높은 농도로 두어 놓습니다.염화물 은 전선 위에 기준 전극과 이온 선택적 전극을 모두 삽입하고 마이크로 조작기에 부착된 전극 홀더를 사용하여 안전하게 고정합니다. 마이크로 조작기를 사용하여 200 밀리머 나트륨 염화 나트륨 방울을 향해 전극을 모두 탐색하여 전기 팁이 접시의 바닥에 닿지 않도록합니다. 전기계를 켜서 레코딩을 시작하고 판독값이 안정화되도록 합니다.읽기를 기록하고 다음 표준을 계속합니다. 유체 분비 율의 측정을 얻은 후, 마이크로 조작기를 사용하여 기준 및 이온 선택적 전극을 분비된 액적물으로 조심스럽게 이동합니다. 레코딩을 켜고 판독값이 안정화되도록 한 다음 기록합니다.IPA-2 이온/폴라로그래픽 증폭기, 광 현미경 및 컴퓨터를 켭니다. 은염화물 와이어로 구성된 홀더에 나트륨 선택적 미세 전전자를 놓고 여성 커넥터 잭에 부착합니다. 염화칼륨으로 비커에서 기준 전극 1개를 제거하고 한쪽 끝에 한 손가락을 놓고 유리 모세관을 이 손가락쪽으로 기울여 한천이 떨어지는 것을 방지합니다.조심스럽게 거품이 형성되지 않도록 홀더에 한쪽 끝을 배치합니다. 거품이 있는 경우, 기준 전극을 제거하고, 3개의 어금니 칼륨으로 홀더를 리필하고 반복한다. 전극 홀더를 여성 커넥터 잭에 넣습니다.교정 후 장기를 해부합니다. 폴리-L-리신 접시를 현미경 단계에 해부된 시료와 함께 놓고 식염수 내부에 기준 전극의 끝을 삽입합니다. 식염수에 이온 선택적 미세 전극의 끝을 침수, 팁을 깰하지 않도록주의.수동 조정 노브를 사용하여 가벼운 현미경 아래에서 보이는 동안 미세 전극 위치를 조정합니다. 그 끝이 기관 또는 조직과 같은 평면에 있도록 마이크로 전자의 수직 위치를 조정한 다음 모터 스위치를 돌려 가능하게합니다. 컴퓨터 화살표 키를 사용하여 미세 전극을 조직에서 3밀리미터 떨어진 위치로 수평으로 이동하여 배경 기록을 측정합니다.준비가 되면 F5를 눌러 녹음을 시작하고 백그라운드 활동의 다섯 가지 측정값을 가져옵니다. 미전전제 팁을 장기를 관통하지 않고 돌보는 조직에 가깝게 이동합니다. 미세 전하 팁 2 마이크로미터를 조직에 수직으로 직접 배치하여 키 적중 감도를 줄입니다.직장 패드를 따라 사이트에서 세 개의 레코딩을 가져와 가장 큰 이온 활동의 부위를 식별한 다음 가장 큰 활동을 표시하는 사이트에서 기준식염수 측정값을 얻습니다. 힌드구트 수축을 기록하려면 요리의 우물 중 하나를 Aedes 식염수로 채웁니다. 해부에 따라, 조심스럽게 다른 접시에 우물에 중간 창자에 부착 된 해부 힌장을 전송, ileum을 꼬집어하지 않도록.우물 안쪽의 식염수에 내장을 잠그고 미누티엔 핀을 중간 창자와 직장에 넣습니다. 장막은 장력 하에 있지 않아야하며 전방 일루의 유러믹 밸브에서 발생하는 자발적수축을 관찰해야합니다. 비디오 카메라를 입체 현미경에 연결합니다.그런 다음 해부된 장기를 함유한 접시를 현미경 아래에 놓고 2분 동안 비디오를 녹화합니다. 자극되지 않은 말피기안 튜블러에 대한 DH31의 적용은 액분비율이 현저한 증가하여 Aedes 모기의 이뇨 호르몬으로서의 역할을 확인합니다. 튜블러가 AedaeCAPA-1로 치료될 때, DH31에서 분비율의 감소가 말피기안 튜블러를 자극하는 것으로 관찰된다.이온 선택적 전극은 분비된 물방울에서 나트륨 농도를 측정하는 데 사용되었다. MT에 DH31의 치료는 분비 된 액적에서 나트륨 농도에 영향을 미치지 않았다. 그러나, AedaeCAPA-1의 적용으로, 분비된 액체에 있는 나트륨 농도가 현저하게 증가했습니다.또한 자극되지 않은 제어에 비해 DH31은 나트륨 수송속도가 현저히 높아졌고, AedaeCAPA-1은 DH31 자극 튜블러의 증가를 폐지했습니다. SIET는 성인 여성 모기의 직장 패드 상피를 따라 나트륨 수송의 변화를 평가하는 데 사용되었습니다. 류코키닌 아날로그는 나트륨 흡수의 변화를 검사하는 데 사용되었으며, 이로 인해 식염수 조절에 비해 나트륨 흡수가 4배 감소했습니다.일막 운동성에 대한 neuropeptide pyrokinin2의 역할을 평가하기 위해, 론드니우스 prolixus 아날로그가 사용되었으며, 이는 이전에 모기 장막에 농축된 A.aegypti PK2 수용체를 활성화시키는 것으로 나타났다. 기준선 수준에 비해 PK2는 장골 수축을 현저히 억제합니다. 말피기히안 튜블러로 램지 분석을 수행하고 이온 또는 유체 분비 속도를 측정할 때, 해부 중 또는 분석 접시로 옮기는 동안 튜벌레가 손상되지 않는 것이 필수적입니다.램지 분석에 따라, 특정 멤브레인 수송기는 간단한 상피에서 솔테의 환피성 수송에 그들의 특정 기여를 분별하기 위하여 역 유전 기술을 사용하여 약리학적으로 또는 분자적으로 표적으로 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

성인 Zebrafish에 Intraperitoneal 사출

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

연구

생물학

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

개발하고 성인 단계에서 중개 신진 대사 플럭스 안정 원소 프로파일 Caenorhabditis 엘레간스</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Cryopreserved 샘플 복구를 위해 손수 함 장치 실수로 극저온 저장 탱크 떨어졌고

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Gavaging Adult Zebrafish

성인 Zebrafish의를 Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

아시아 타이거 모기에 Photoperiodic 휴면의 RNA-서열 분석을위한 실험 및 생물 정보학 프로토콜,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

생리 녹음 및 황열병 모기의 미각 부속 기관의 RNA 시퀀싱<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

에서 애벌레 활동의 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 활동 모니터

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

수용 체 Ligand 상호 작용을 공부 하기 위한 BW 기자 시스템

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...