Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants til AD og J-PP. AL og FS mottok NSERC CGS-M-priser til støtte for sin avgangsforskning.

1. Lage silikonforede retter
MERK: Dette trinnet bør gjøres før forsøkene. Disse rettene vil bli laget for å forberede analyseretten for disseksjoner, og for sammentrekningsanalyseeksperimenter.
<ol><li>Forbered silikonet ved hjelp av et silikonelastomersett etter produsentens anbefalinger. Bland de todelte væskekomponentene i forholdet 10 til 1. Bland forsiktig og grundig ved å snu, men sørg for å minimere bobledannelse.</li>
	<li>Hell silikonelastomeren i standard 60 mm engangs po...

Når du inntar et blodmåltid, står hematofagus insekter overfor utfordringen med overflødige solutes og vann i hemolymfen2. For å takle dette har de et spesialisert ekskresjonssystem, som er tett kontrollert av hormonelle faktorer, slik at insekter raskt kan initiere post-prandial diurese. Ramsay-analysen og bruk av ion-selektive mikroelektroder gjør det mulig å måle væskesekresjonshastigheter sammen med ionkonsentrasjoner og transportrater i isolerte insekt-MTs. Kritiske skritt innenfor d...

Vedlikehold av salt- og vannnivåer i insekter gjør at de kan lykkes i mange økologiske og miljømessige nisjer, ved hjelp av en rekke fôringsstrategier1. De fleste insekter har utviklet mekanismer for å regulere sammensetningen av hemolymfen innenfor smale grenser for å motstå de forskjellige utfordringene knyttet til deres spesielle miljø2. Terrestriske insekter står ofte overfor utfordringen med å bevare vann, og ekskresjonssystemet gjennomgår anti-diurese for å forhindre tap av vann og noen essensielle salter, og unngår derfor uttørking. I motsetning oppstår diurese når insektet strømmer og utfordres med overflødig vann og potensielt salter3,4. Gjennom sitt spesialiserte og svært aktive ekskresjonssystem har insekter utviklet regulatoriske mekanismer som virker for å motvirke deres osmoregulatoriske utfordringer. Hos voksne Aedes aegypti mygg består ekskresjonssystemet av malpighiske tubuli (MTs) og bakgut, hvorav sistnevnte består av det fremre ileum og bakre endetarm5. MTs er ansvarlige for å generere primær urin, vanligvis rik på NaCl og / eller KCl. Den primære urinen endres deretter gjennom sekretoriske og reabsorptive prosesser når den beveger seg nedstrøms tubule og går inn i hindgut5. Den endelige ekskretaen kan være hyper- eller hypoosmotisk til hemolymfen, avhengig av fôrings-/miljøforhold, og er beriket i giftig og nitrogenholdig avfall2.
MT-er er ideelle for å studere mange egenskaper ved epitelvæske og løsemiddeltransport da de utfører et stort utvalg av transport- og ekskresjonsfunksjoner2,6. Gjennom hormonell regulering2 fungerer MTs ved å utskille ioner og andre solutes fra blodet inn i tubule lumen7, noe som gir en osmotisk gradient som gjør at vann kan transporteres av aquaporins8,9, som samlet skaper primær urin, før du reiser mot reabsorptive hindgut2. Dermed, ved å samle utskilt væske fra isolerte MTs, kan man kontinuerlig overvåke transepithelial transport av væske og ioner. Måling av sekresjonshastighet og urinsammensetning gir innsikt i mekanismer som er ansvarlige for transepithelial ion og væsketransport. En populær metode for å studere væskesekresjonsrater er Ramsay-analysen, som først ble introdusert av Ramsay i 195310. I denne metoden behandles den distale (lukkede) enden av tubule med et hormon (eller annen testforbindelse / stoff), mens den proksimale (åpne) enden er pakket rundt en pinne i vannmettet parafinolje, som skiller ut den primære urinen, akkumuleres som en dråpe på spissen av pinnen. Isolerte MT-er er i stand til å overleve og fungere i lange perioder (opptil 24 timer) under optimaliserte in vitro-forhold, noe som gjør dem egnet og effektive modeller for væskesekresjonsmåling. Insekter har åpne sirkulasjonssystemer, slik at MT-ene lett dissekeres og fjernes, da de vanligvis flyter fritt i hemolymfen6. I tillegg, med unntak av bladlus - som mangler MTs11 - kan antall MT-er i en gitt insektart variere betydelig fra fire til hundrevis (fem i Aedes mygg) som tillater flere målinger fra ett insekt.
MTs i Aedes mygg, til felles med andre endopterygote insekter, består av to celletyper som danner et enkelt epitel2,12; store hovedceller, som letter aktiv transport av kasjoner (dvs. Na + og K +) inn i lumen, og tynne stellate celler, som hjelper i transepithelial Cl- sekresjon13. MT-ene er ikke innervated2, og er i stedet regulert av flere hormoner, inkludert både vanndrivende og anti-vanndrivende faktorer, noe som muliggjør kontroll av iontransport (hovedsakelig Na +, K + og Cl-) og osmotisk forpliktet vann2. Tallrike studier har undersøkt hormonell regulering av Aedes MTs for å forstå rollen som endokrine faktorer på transepithelial transport14,15,16,17,18. Som vist i de representative resultatene, viser protokollene heri effekten av forskjellige hormonelle faktorer på isolerte MTs fra voksne kvinnelige A. aegypti mygg, inkludert både vanndrivende og anti-vanndrivende kontroll (figur 1). Ramsay-analysen brukes til å demonstrere hvordan et anti-vanndrivende hormon, AedaeCAPA-1, hemmer væskesekresjon av MTs stimulert av vanndrivende hormon 31 (DH31) (figur 1).
Den mindre størrelsen på insekter har krevd utvikling av mikrometoder for måling av ionisk aktivitet og konsentrasjoner i væskeprøver, eller nær overflaten av isolerte vev som MTs og tarm. Ulike metoder er implementert, inkludert bruk av radioisotoper av ioner19, som krever innsamling av utskilte væskedråper for måling av ionkonsentrasjoner20. Stimulerte Aedes tubules in vitro skiller vanligvis ut ~ 0,5 nL / min21, og dermed kan håndtering av slike små volumer utgjøre en utfordring og potensielt introdusere feil ved overføring. Som et resultat har ion-selektive mikroelektroder (ISMEs) blitt mye brukt til å måle ionkonsentrasjoner i utskilte dråper MTs in vitro. I denne metoden er en referanseelektrode og ISME, fylt med riktig etterfyllingsløsning og ionofor, plassert i den utskilte urindråpen for å bestemme ionkonsentrasjoner22. Tilpasset fra Donini og kolleger23, bruker denne nåværende protokollen en Na + selektiv ionofor for å måle ionaktivitet i utskilte dråper fra stimulerte MT-er i voksne Aedes mygg. Siden ion-selektive mikroelektroder måler ionaktivitet, kan disse dataene uttrykkes som ionkonsentrasjoner etter antagelsen om at kalibreringsløsningene og eksperimentelle prøver deler samme ionaktivitetskoeffisient21 (figur 1B, C).
Scanning Ion-selektiv elektrodeteknikk (SIET) bruker også ISME-er til å måle ionkonsentrasjonsgradienter i det uprøvde laget ved siden av organer, vev eller celler som transporterer ioner. ISME-ene måler spenningsgradienter som deretter kan brukes til å beregne ionkonsentrasjonsgradientene og retningen og størrelsen på ionfluksen over orgelet, vevet eller celle20. I denne teknikken er ISME montert på en tre akser manipulator styrt av datastyrte mikro-stepper motorer slik at 3D-posisjonen styres til mikrometernivået20. Spenninger måles på to punkter i det ustigede laget ved hjelp av en prøvetakingsprotokoll programmert inn i og kontrollert av dataprogramvare. De to punktene er vanligvis adskilt med en avstand på 20-100 μm med ett punkt innenfor 5-10 μm av overflaten av organet, vevet eller cellen og det andre punktet ytterligere 20-100 μm unna. Forskjellen i spenningsstørrelse mellom de to punktene beregnes for å oppnå en spenningsgradient24,25,26, som deretter brukes til å beregne konsentrasjonsgradienten og deretter nettostrømmen ved hjelp av Ficks Law24,27. Denne metoden er nyttig for å vurdere transport av spesifikke ioner på tvers av forskjellige regioner i insekts tarmen og MTs, eller på bestemte tidspunkter etter en blodmel eller behandlingseksponering. For eksempel kan SIET brukes til å forstå hvordan absorptive og sekretoriske prosesser i myggutskillelsessystemet reguleres av hormoner28 samt forskjellige fôringsatferd og oppdrettsforhold25. Tidligere arbeid ved hjelp av SIET avslørte steder som er involvert i iontransport langs anal papill og endetarm av larval og voksne mygg24,28. Den nåværende protokollen, beskrevet tidligere av Paluzzi og kolleger26, måler Na + flux over rektal pad epithelia av den voksne kvinnelige endetarmen (figur 2).
Det siste segmentet av myggekskresjonssystemet krever koordinert muskelbevegelse for å blande mat og skille ut avfall26. Ikke-absorberbare produkter av fordøyelsen fra midgut, sammen med primær urin utskilt av MTs, passeres gjennom pyloric ventilen og leveres til hindgut2. Spontane hindgutsammentrekninger begynner ved pylorisk ventil og forekommer i peristaltiske bølger, som videresendes over ileum gjennom koordinert sammentrekning av sirkulære og langsgående muskler rundt den basale overflaten av epitelceller26. Til slutt bidrar musklene i endetarmen til å drive og eliminere avfall gjennom analkanalen. Selv om insekt hindgutmotilitet er myogen, som krever ekstracellulær Ca2 + for å produsere spontane sammentrekninger, kan disse prosessene også reguleres nevronally26,29,30. Denne eksogene reguleringen av nervesystemet er viktig etter fôring, da dyret må utvise avfall fra tarmen og gjenopprette hemolymf balanse31. Som et resultat er det nyttig å utføre in vitro bioassays for å identifisere myostimulatorium eller myoinhibitory neuropeptider for å vurdere hvordan nevrokjemikalier påvirker hindgutmotilitet. Den nåværende protokollen, utført av Lajevardi og Paluzzi28, bruker videoopptak for å undersøke ileal motilitet som svar på nevropeptider (figur 3). På samme måte kan en krafttransduser eller impedanskonverterer også brukes til å observere spor av sammentrekninger gjennom en datainnsamlingsprogramvare32,33. Ved hjelp av videoteknologi kan vi imidlertid visuelt vurdere orgelet og analysere videre ved hjelp av en undergruppe av parametere for å identifisere hormonenes rolle på bakgutmotilitet.
Ved hjelp av disse teknikkene kan du bidra til å karakterisere faktorer som regulerer og koordinerer væske- og iontransport langs ekskresjonssystemet sammen med bakre bevegelighet. Viktigst, en funksjonell kobling mellom vanndrivende respons av MTs og hindgut motility støttes, som vanndrivende hormoner, som DH31 og 5HT, preget av deres evne til å stimulere væskesekresjon av MTs, har også blitt funnet å vise myotrope handlinger langs mygg hindgut21,34,35 . Disse funnene fremhever viktigheten av streng koordinering mellom MT-ene og bakenden under hendelser som post-prandial diurese i insekter som krever rask avfalls eliminering.
Heri beskrives den detaljerte tilnærmingen bak Ramsay-analyseteknikken for å måle væskesekresjonshastigheten i mygga, A. aegypti, og bruken av ion-selektive mikroelektroder for å bestemme Na + konsentrasjoner i den utskilte væsken til MT-ene, som når de kombineres, gjør det mulig å bestemme transepitheliale iontransportrater. I tillegg er Scanning Ion-selektiv elektrodeteknikk og hindgut-sammentrekningsanalyser beskrevet for å måle henholdsvis ionfluks og bevegelighet, noe som bidrar til å belyse hormonell regulering av bakguten (figur 4).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

Studier av insektfysiologi, spesielt i de artene som er vektorer av patogener som forårsaker sykdom hos mennesker og andre vertebrater, gir grunnlaget for å utvikle nye strategier for skadedyrsbekjempelse. Her beskrives en rekke metoder som rutinemessig brukes til å bestemme de funksjonelle rollene til nevropeptider og andre nevronfaktorer (dvs. biogene aminer) på myggens ekskresjonssystem, Aedes aegypti. De malpighiske tubuliene (MTs), som er ansvarlige for primær urindannelse, kan fortsette å fungere i flere timer når de fjernes fra mygga, noe som gir mulighet for væskesekresjonsmålinger etter hormonbehandlinger. Som sådan er Ramsay-analysen en nyttig teknikk for å måle sekresjonshastigheter fra isolerte MTs. Ion-selektive mikroelektroder (ISME) kan sekvensielt brukes til å måle ionkonsentrasjoner (dvs. Na + og K +) i utskilt væske. Denne analysen gjør det mulig å måle flere MT-er på et gitt tidspunkt, og bestemme effekten av ulike hormoner og stoffer. Scanning Ion-selektiv elektrodeteknikk bruker ISME til å måle spenningsrepresentant for ionisk aktivitet i det uprøvde laget ved siden av overflaten av iontransporterende organer for å bestemme transepithelial transport av ioner i nær sanntid. Denne metoden kan brukes til å forstå rollen som hormoner og andre regulatorer på ionabsorpsjon eller sekresjon på tvers av epithelia. Hindgut-sammentrekningsanalyser er også et nyttig verktøy for å karakterisere myoaktive nevropeptider, som kan forbedre eller redusere dette organets evne til å fjerne overflødig væske og avfall. Samlet gir disse metodene innsikt i hvordan ekskresjonssystemet reguleres i voksne mygg. Dette er viktig fordi funksjonell koordinering av ekskresjonsorganene er avgjørende for å overvinne utfordringer som uttørkingsstress etter eklosjon og før du finner en passende vertebratvert for å få et blodmel.

Anvendelse av DH31 mot ustimulerte MTs resulterer i en betydelig økning i væskesekresjonshastigheten, og bekrefter sin rolle som et vanndrivende hormon i Aedes mygg (figur 1A). Når tubuli behandles med AedaeCAPA-1, observeres en reduksjon i sekresjonshastigheten i DH31-stimulerte MT-er. Figur 1B viser bruk av ion-selektive elektroder for å måle Na + konsentrasjoner i de utskilte dråpene. Behandling av <sub...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Denne protokollen skisserer metoder bak Ramsay-analysen, ion-selektive mikroelektroder, skanning av ion-selektiv elektrodeteknikk (SIET) og in vitro-sammentrekningsanalyser, anvendt for å studere det voksne myggutskillelsessystemet, som består av malpighiske tubuli og bakgut, for kollektivt å måle ion- og væskesekresjonshastigheter, kontraktil aktivitet og transepithelial iontransport.

Studere aktiviteten til nevropeptider og andre regulatorer i ekskresjonssystemet i voksen mygg

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Denne protokollen beskriver teknikker som kan brukes av små dyrefysiologer for å belyse rollen som nevropeptider og andre hormonelle faktorer som regulerer fordøyelsessystemet og eller ekskresjonssystemet. Disse teknikkene tillater målinger av biologiske prøver i mikrostørrelse som ellers ikke ville være mulig ved hjelp av teknikker designet spesielt for større dyremodeller, inkludert for eksempel gnagere og teleus. Denne metoden kan gi innsikt i endokrine regulering av tarmen, inkludert transport av epitelial, samt glatt muskel forbundet med mage-tarmkanalen i insekter og i tilsvarende store ikke-insektarter.Å demonstrere insektets nyrerørprosedyrer vil være Farwa Sajadi, en stipendiat fra laboratoriet mitt. I tillegg vil en tidligere avgangsstudent fra laboratoriet mitt Aryan Lajevardi demonstrere de bakveiende fokuserte protokollene. Begynn med å forberede Ramsay og sammentrekningsanalyseretter for forsøkene.Bruk pipette og fyll brønner med opptil 20 mikroliter oppløsning. For ustimulerte kontroller, fyll brønnene med 20 mikroliter Aedes saltvann Schneiders medium. Når alle brønnene er fylt, hell hydrert mineralolje i analysefatet til brønnene og Minutien-pinnene er nedsenket.Etter å ha nedsenket tubule i brønnen, plukk opp den proksimale enden av tubule med tang, fjern den fra badedråpen og pakk enden rundt pinnen. Vikle tubule rundt pinnen to ganger og hold lengden på tubule igjen i badedråpen i samsvar med de andre tubuliene. For å lage en natriumselektiv mikroelektrod, bruk en en milliliter sprøyte for å fylle elektroden med 100 millimolar natriumklorid.Påse at bakfyllingsløsningen fylles til elektrodens spiss. Hvis det oppstår luftbobler, sveiper du forsiktig mikroelekroden eller fjerner oppløsningen og påfyller den. Dypp en 10 mikroliter pipettespiss i natriumselektiv ionoforoppløsning.Still opp elektroden vinkelrett på pipetten, legg deretter en hanskefinger over bunnen av spissen for å skape trykk og utvise en liten dråpe ionofor. Berør forsiktig dråpen av ionofor til mikroelektrodespissen, sørg for ikke å bryte den. Fyll et lite beger halvveis med 100 millimolar natriumklorid og legg litt modelleringsleire på innsiden på toppen av begeret.Etter at ionoforen er tatt opp, plasser elektrodespissen ned på veggen på begeret, la spissene i natriumkloridet. Hold ISME i begeret til det er klart til bruk. For å gjøre ISME-referanseelektroden, fyll en elektrode med 500 millimolar kaliumklorid og oppbevar den i et beger.Belegge elektrodespissene ved hjelp av en løsning på ca. 3,5% polyvinylklorid, oppløst i tetrahydrofuran, for å unngå forskyvning av ionoforen når den er nedsenket i parafinolje. For å kalibrere natriumelektroden, plasser 10 mikroliterdråper av natriumkloridstandardkonsentrasjoner på kanten av Ramsey-parabolen med de inkuberte malpighiske tubuliene. Plasser standarddråpene to centimeter fra hverandre med høyere konsentrasjon på toppen.Sett inn både referanseelektroden og den selektive ionelektroden over kloridets sølvtråder og fest dem sikkert ved hjelp av elektrodeholdere som er festet til mikromanipulatorer. Naviger begge elektrodene mot 200 millimolar natriumkloriddråpen ved hjelp av mikromanipulatorene, og sørg for at elektrospissene ikke berører bunnen av parabolen. Slå på elektrometeret for å starte opptaket og la avlesningen stabilisere seg.Spill inn lesingen og fortsett til neste standard. Etter å ha fått målinger av væskesekresjonshastigheten, flytt forsiktig referansen og ionselektelektrodene inn i det utskilte dråpet ved hjelp av mikromanipulatorene. Slå på innspillingen og la avlesningen stabilisere seg, og ta deretter opp.Slå på IPA-2 Ion/Polarographic Amplifier, lysmikroskopet og datamaskinene. Plasser natriumselektive mikroelektroden på en holder som består av en sølvkloridtråd og fest den i den kvinnelige kontaktkontakten. Fjern en referanseelektrode fra begeret med kaliumkloridet, plasser en finger i den ene enden og vipp glasskapillæren mot denne fingeren for å forhindre at agaren faller ut.Plasser forsiktig den ene enden i holderen, og sørg for at det ikke dannes bobler. Hvis det er en boble, fjern referanseelektroden, fyll holderen med tre molar kaliumklorid og gjenta. Plasser elektrodeholderen i den kvinnelige kontaktkontakten.Etter kalibrering, dissekere orgelet. Plasser poly-L-lysinfatet med den dissekerte prøven på mikroskopstadiet og sett spissen av referanseelektroden inn i saltvannen. Senk spissen av ionens selektive mikroelektrode i saltvannen, pass på at du ikke bryter spissen.Bruk de manuelle justeringsknappene til å justere mikroelektrodposisjonen mens du ser under lysmikroskopet. Juster mikroelektrodens vertikale posisjon slik at spissen er på samme plan som organet eller vevet, og drei deretter motorbryteren for å aktivere. Bruk datamaskinpiltastene til å flytte mikroelektroden horisontalt til en posisjon tre millimeter bort fra vevet for å måle bakgrunnsopptak.Når du er klar, begynner du innspillingen ved å trykke på F5, få fem målinger av bakgrunnsaktivitet. Flytt mikroelektrodespissen nær vevet og pass på at du ikke pierce orgelet. Reduser nøkkeltrefffølsomheten for å plassere mikroelektrodespissen to mikrometer direkte til høyre, vinkelrett på vevet.Få tre opptak på stedet langs rektal pad for å identifisere stedet for størst ion aktivitet, deretter få baseline saltvannsmålinger på stedet viser størst aktivitet. For å registrere bakbenssammentrekninger, fyll en av brønnene i parabolen med et kjent volum Aedes saltvann. Etter disseksjon, overfør forsiktig den dissekerte bakguten festet til midt tarmen til en brønn i en annen tallerken, sørg for ikke å klemme ileum.Senk tarmen ned i saltvannet inne i brønnen og plasser Minutien-pinnene i midtre tarm og endetarm. Ileum bør ikke være under spenning og spontane sammentrekninger som stammer fra pyloric ventilen på fremre ileum bør observeres. Koble videokameraet til det stereoskopiske mikroskopet.Plasser deretter parabolen som inneholder det dissekerte organet under mikroskopet og ta opp en video i to minutter. Anvendelse av DH31 mot ustimulerte malpighiske tubuli resulterer i en betydelig økning i væskesekresjonshastighet, og bekrefter sin rolle som et vanndrivende hormon i Aedes mygg. Når tubuli behandles med AedaeCAPA-1, observeres en reduksjon i sekresjonshastigheten i DH31-stimulerte malpighiske tubuli.Ionselektive elektroder ble brukt til å måle natriumkonsentrasjoner i de utskilte dråpene. Behandling av DH31 på MT-ene hadde ingen effekt på natriumkonsentrasjonen i den utskilte dråpen. Men med anvendelsen av AedaeCAPA-1 ble natriumkonsentrasjonen i den utskilte væsken betydelig økt.I tillegg, sammenlignet med ustimulerte kontroller, førte DH31 til en betydelig større natriumtransportrate, mens AedaeCAPA-1 avskaffet denne økningen i DH31-stimulerte tubuli. SIET ble brukt til å vurdere endringer i natriumtransport langs rektal pad epitel av voksne kvinnelige mygg. En leucokinin-analog ble brukt til å undersøke endringer i natriumabsorpsjon, noe som resulterte i en fire ganger reduksjon i natriumabsorpsjon sammenlignet med saltvannskontroll.For å vurdere rollen som en neuropeptid pyrokinin2 på ileal motilitet, ble en Rhodnius prolixus analog brukt, som tidligere ble vist å aktivere A.aegypti PK2-reseptoren beriket i mygg ileum. I forhold til baseline nivåer hemmer PK2 signifikant ileal sammentrekninger. Når du utfører en Ramsay-analyse med malpighiske tubuli og måler ion- eller væskesekresjonshastigheter, er det viktig at tubuli ikke blir skadet under disseksjonen eller under overføringen til analysefatet.Etter Ramsay-analysen kan spesifikke membrantransportører målrettes enten farmakologisk eller molekylært ved hjelp av omvendte genetiske teknikker for å skjelne deres spesifikke bidrag til transepithelial transport av løsemidler i det enkle epitelet.

Research

JoVE Journal

Biology

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gjør-det-selv Enhet for gjenoppretting av Cryopreserved Prøver uhell falt inn Kryogeniske lagertanker

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Adult Sebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

En eksperimentell og bioinformatikk protokoll for RNA-seq Analyser av Photoperiodic Diapause i den asiatiske tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fysiologiske Recordings og RNA sekvensering av Gustatory vedheng av Yellow-feber Mosquito<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Måling av Larve Aktiviteten i<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Spatial Omorganisering av et MAPK signalveien Bruke Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

En BW Reporter System for å studere reseptor-Ligand interaksjoner

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...