Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pelo Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants to AD e J-PP. A AL e a FS receberam prêmios NSERC CGS-M em apoio à sua pesquisa de pós-graduação.

1. Fazendo pratos forrados de silicone
NOTA: Esta etapa deve ser feita antes dos experimentos. Esses pratos serão feitos para preparar o prato de ensaio para dissecções, e para experimentos de ensaio de contração.
<ol><li>Prepare o silicone usando um kit de elastômero de silicone seguindo as recomendações do fabricante. Misture os componentes líquidos de duas partes a uma razão de 10 a 1. Misture suavemente e completamente invertendo, mas certifique-se de minimizar a formação de ...

Ao ingerir uma refeição de sangue, os insetos hematófagos enfrentam o desafio do excesso de solutos e água em seu hemolymph2. Para lidar com isso, eles possuem um sistema excretório especializado, que é fortemente controlado por fatores hormonais, permitindo que os insetos iniciem rapidamente a diurese pós-prandial. O ensaio ramsay e o uso de microeletrodos seletivos de íons permite a medição das taxas de secreção de fluidos, juntamente com concentrações de íons e taxas de transport...

A manutenção dos níveis de sal e água nos insetos permite que eles tenham sucesso em muitos nichos ecológicos e ambientais, utilizando uma variedade de estratégias de alimentação1. A maioria dos insetos desenvolveu mecanismos para regular a composição de seu hemoglifo dentro de limites estreitos, a fim de suportar os diferentes desafios associados ao seu ambiente particular2. Os insetos terrestres são frequentemente confrontados com o desafio de conservar a água e o sistema excretório sofre anti-diurese para evitar a perda de água e alguns sais essenciais, evitando, portanto, a dessecação. Em contraste, a diurese ocorre quando o inseto se alimenta e é desafiado com excesso de água e potencialmente sais3,4. Por meio de seu sistema excretório especializado e altamente ativo, os insetos desenvolveram mecanismos regulatórios que atuam para combater seus desafios osmoregulatórios. Em mosquitos Aedes aegypti adultos, o sistema excretório é composto pelos túbulos malpighianos (TM) e hindgut, este último é composto pelo íleo anterior e reto posterior5. Os MTs são responsáveis pela geração de urina primária, geralmente rica em NaCl e/ou KCl. A urina primária é então modificada através de processos secretos e reabsortivos à medida que viaja rio abaixo do túbulo e entra no hindgut5. A excreta final pode ser hiper ou hipoosmótica para o hemolítico, dependendo das condições alimentares/ambientais, e é enriquecida em resíduos tóxicos e nitrogenados2.
Os MTs são ideais para estudar muitas características do fluido epitelial e do transporte de soluto, pois realizam uma grande variedade de funções de transporte e excreção2,6. Através da regulação hormonal2, os TM funcionam segregando íons e outros solutos do sangue para o lúmen léculo7, fornecendo um gradiente osmótico permitindo que a água seja transportada por aquaporinas8,9, que cria coletivamente a urina primária, antes de viajar em direção ao traseiro reabsorguente2. Assim, coletando o fluido secretado de MTs isolados, pode-se monitorar continuamente o transporte transepitelial de fluidos e íons. A medição da taxa de secreção e a composição da urina fornecem uma visão sobre os mecanismos responsáveis pelo íon transepiteliol e transporte de fluidos. Um método popular para estudar taxas de secreção de fluidos é o ensaio ramsay, que foi introduzido pela primeira vez por Ramsay em 195310. Neste método, a extremidade distal (fechada) do túbulo é tratada com um hormônio (ou outro composto/droga de teste), enquanto a extremidade proximal (aberta) é enrolada em torno de um pino em óleo de parafina saturada de água, que secreta a urina primária, acumulando-se como uma gota na ponta do pino. Os MTs isolados são capazes de sobreviver e funcionar por longos períodos (até 24 h) em condições in vitro otimizadas, o que os torna modelos adequados e eficientes para a medição da secreção de fluidos. Os insetos têm sistemas circulatórios abertos, assim os MTs são facilmente dissecados e removidos, pois geralmente flutuam livremente no hemolymph6. Além disso, com exceção dos pulgões — que não possuem MTs11 — o número de TM em uma determinada espécie de inseto pode variar consideravelmente de quatro a centenas (cinco em mosquitos Aedes) permitindo múltiplas medições de um inseto.
Os MTs em mosquitos Aedes, em comum com outros insetos endopterygote, são compostos por dois tipos de células que formam um simples epitélio2,12; grandes células principais, que facilitam o transporte ativo de cálas (ou seja, Na+ e K+) para o lúmen, e células estelares finas, que auxiliam na secreção transepiteliol cl-secreção13. Os MTs não são inervados2, e em vez disso são regulados por vários hormônios, incluindo fatores diuréticos e anti-diuréticos, permitindo o controle do transporte de íons (principalmente Na+, K+, e Cl-) e água osmoticamente obrigatória2. Inúmeros estudos têm examinado a regulação hormonal dos Aedes MTs para entender o papel dos fatores endócrinos no transporte transepitelio14,15,16,17,18. Como mostrado nos resultados representativos, os protocolos aqui demonstram os efeitos de diferentes fatores hormonais em MTs isolados de mosquitos adultos A. aegypti, incluindo controle diurético e anti-diurético (Figura 1). O ensaio de Ramsay é usado para demonstrar como um hormônio anti-diurético, AedaeCAPA-1, inibe a secreção fluida de TM estimulado pelo hormônio diurético 31 (DH31) (Figura 1).
O tamanho menor dos insetos tem exigido o desenvolvimento de micro métodos para medir a atividade iônica e concentrações em amostras de fluidos, ou perto da superfície de tecidos isolados, como os MTs e intestino. Métodos variados foram implementados, incluindo o uso de radioisótopos de íons19, o que requer a coleta das gotas de fluido secretadas para medição de concentrações de íons20. Túbulos Aedes estimulados in vitro normalmente secretam ~0,5 nL/min21, assim o manuseio de volumes tão pequenos pode representar um desafio e potencialmente introduzir erro após a transferência. Como resultado, microeletrodos seletivos de íons (ISMEs) têm sido amplamente utilizados para medir concentrações de íons em gotículas secretas de MTs in vitro. Neste método, um eletrodo de referência e ISME, preenchidos com a solução de enchimento e ionfora apropriadas, são posicionados na gotícula de urina secretada para determinar as concentrações de íon22. Adaptado de Donini e colegas23, este protocolo atual utiliza um ionophore Na+-seletivo para medir a atividade de íons em gotículas secretas de MTs estimulados em mosquitos Aedes adultos. Uma vez que os microeletrores seletivos medem a atividade de íons, esses dados podem ser expressos como concentrações de íons, seguindo a suposição de que as soluções de calibração e amostras experimentais compartilham o mesmo coeficiente de atividade de íon21 (Figura 1B,C).
A Técnica de Eletrodo Seletivo de Digitalização (SIET) também faz uso de ISMEs para medir gradientes de concentração de íons na camada não tumercada adjacente a órgãos, tecidos ou células que estão transportando íons. Os ISMEs medem gradientes de tensão que podem ser usados para calcular os gradientes de concentração de íons e direção e magnitude do fluxo de íons através do órgão, tecido ou célula20. Nesta técnica, o ISME é montado em um manipulador de três eixos controlado por motores micro-passo computadorizados para que sua posição 3D seja controlada até o nível de micrômetro20. As tensões são medidas em dois pontos dentro da camada não-rarizado usando um protocolo de amostragem programado e controlado por software de computador. Os dois pontos são tipicamente separados por uma distância de 20-100 μm com um ponto dentro de 5-10 μm da superfície do órgão, tecido ou célula e o segundo ponto a mais 20-100 μm de distância. A diferença de magnitude das tensões entre os dois pontos é calculada para obter um gradiente de tensão24,25,26, que é então usado para calcular o gradiente de concentração e, posteriormente, o fluxo líquido utilizando a Lei de Fick24,27. Este método é útil para avaliar o transporte de íons específicos em diferentes regiões do intestino e MTs de insetos, ou em momentos específicos após uma exposição de farinha de sangue ou tratamento. Por exemplo, o SIET pode ser usado para entender como processos absortivos e secretores no sistema excretório do mosquito são regulados por hormônios28, bem como diferentes comportamentos alimentares e condições de criação25. Trabalhos anteriores utilizando o SIET revelaram locais envolvidos no transporte de íons ao longo das papilas anais e reto de mosquitos larvais e adultos24,28. O protocolo atual, descrito anteriormente por Paluzzi e seus colegas26, mede o fluxo na+ através da epitélio retal pad do reto feminino adulto (Figura 2).
O segmento final do sistema excretório do mosquito requer movimento muscular coordenado para ajudar a misturar alimentos e segregar o desperdício26. Produtos não absorvíveis de digestão a partir do midgut, juntamente com a urina primária secretada pelos TM, são passados através da válvula pilênca e entregues ao hindgut2. Contrações espontâneas de hindguta começam na válvula pilórica e ocorrem em ondas peristálticas, que são transmitidas sobre o íleo através da contração coordenada de músculos circulares e longitudinais ao redor da superfície basal das células epiteliais26. Finalmente, os músculos dentro do reto ajudam a impulsionar e eliminar o desperdício através do canal anal. Embora a motilidade do inseto hindgut seja miogênica, exigindo Ca2+ extracelular para produzir contrações espontâneas, esses processos também podem ser regulados neuronalmente26,29,30. Essa regulação exógena pelo sistema nervoso é importante após a alimentação, pois o animal deve expulsar resíduos do intestino e restaurar o equilíbrio hemólquio31. Como resultado, a realização de bioensações in vitro para identificar neuropeptídeos miostimulatórios ou mioinhibitórios é útil para avaliar como os neuroquímicos influenciam a motilidade hindgut. O protocolo atual, realizado por Lajevardi e Paluzzi28, utiliza gravações de vídeo para examinar a motilidade ileal em resposta a neuropeptídeos (Figura 3). Da mesma forma, um transdutor de força ou conversor de impedância também pode ser usado para observar traços de contrações através de um software de aquisição de dados32,33. No entanto, o uso da tecnologia de vídeo nos permite avaliar visualmente o órgão e analisar melhor usando um subconjunto de parâmetros para identificar o papel dos hormônios na motilidade hindgut.
O uso dessas técnicas pode ajudar a caracterizar fatores que regulam e coordenam o transporte de fluidos e íons ao longo do sistema excretório, juntamente com a motilidade hindgut. É importante ressaltar que é suportada uma ligação funcional entre a resposta diurética pelos TM e a motilidade hindgut, pois hormônios diuréticos, como DH31 e 5HT, caracterizados por sua capacidade de estimular a secreção de fluidos pelos TM, também foram encontrados para exibir ações miotrópicas ao longo do mosquito hindgut21,34,35 . Esses achados destacam a importância de uma coordenação rigorosa entre os TM e o hindgut durante eventos como diurese pós-prandial em insetos que requerem eliminação rápida de resíduos.
Aqui, são descritas a abordagem detalhada por trás da técnica de ensaio de Ramsay para medir a taxa de secreção de fluidos no mosquito A. aegypti e o uso de microeletrodos seletivos para determinar as concentrações na+ dentro do fluido secreto dos MTs, que quando combinado permite que as taxas de transporte de íons transepitelais sejam determinadas. Além disso, a Técnica de Eletrodo seletivo de digitalização e ensaios de contração de contração de porcas são descritos para medir o fluxo de íons e a motilidade, respectivamente, o que ajuda a elucidar a regulação hormonal do hindgut (Figura 4).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

Estudos de fisiologia de insetos, particularmente nas espécies que são vetores de patógenos causando doenças em humanos e outros vertebrados, fornecem a base para desenvolver novas estratégias para o controle de pragas. Aqui, uma série de métodos são descritos que são rotineiramente utilizados para determinar os papéis funcionais de neuropeptídeos e outros fatores neuronais (ou seja, aminas biogênicas) no sistema excretório do mosquito, Aedes aegypti. Os túbulos malpighianos (TM), responsáveis pela formação primária da urina, podem continuar funcionando por horas quando removidos do mosquito, permitindo medidas de secreção de fluidos após tratamentos hormonais. Como tal, o ensaio ramsay é uma técnica útil para medir as taxas de secreção de MTs isolados. Microeletrodos seletivos de íons (ISME) podem ser usados sequencialmente para medir concentrações de íons (ou seja, Na+ e K+) no fluido secretado. Este ensaio permite a medição de vários MTs em um determinado momento, determinando os efeitos de vários hormônios e drogas. A Técnica de Eletrodo seletivo de digitalização usa ISME para medir a tensão representativa da atividade iônica na camada não írpara adjacente à superfície dos órgãos de transporte de íons para determinar o transporte transepiteno de íons em tempo real. Este método pode ser usado para entender o papel dos hormônios e outros reguladores sobre absorção de íons ou secreção através da epitélio. Os ensaios de contração de porca também são uma ferramenta útil para caracterizar neuropeptídeos mioativos, que podem aumentar ou reduzir a capacidade deste órgão de remover o excesso de fluido e resíduos. Coletivamente, esses métodos fornecem uma visão de como o sistema excretório é regulado em mosquitos adultos. Isso é importante porque a coordenação funcional dos órgãos excretórios é crucial para superar desafios como o estresse de dessecação após o término e antes de encontrar um hospedeiro vertebrado adequado para obter uma farinha de sangue.

A aplicação de DH31 contra MTs não estimulados resulta em um aumento significativo na taxa de secreção de fluidos, confirmando seu papel como hormônio diurético em mosquitos Aedes (Figura 1A). Quando os túbulos são tratados com AedaeCAPA-1, observa-se uma redução na taxa de secreção em MTs estimulados por DH31. A Figura 1B demonstra o uso de eletrodos seletivos de íons para medir as concentrações na+</...

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Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Este protocolo descreve metodologias por trás do ensaio ramsay, microeletrodos seletivos de íons, técnica de eletrodo seletivo de digitalização (SIET) e ensaios de contração in vitro, aplicados para estudar o sistema excretório de mosquitos adultos, composto pelos túbulos e traseiros malpighianos, para medir coletivamente as taxas de íons e secreção de fluidos, atividade contratil e transporte transepitelial.

Estudando a Atividade de Neuropeptídeos e Outros Reguladores do Sistema Excretório no Mosquito Adulto

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Este protocolo descreve técnicas que podem ser utilizadas por pequenos fisiologistas animais para elucidar o papel de neuropeptídeos e outros fatores hormonais que regulam o sistema digestivo e ou excretório. Essas técnicas permitem medições de amostras biológicas de micro porte que de outra forma não seriam possíveis usando técnicas projetadas especificamente para modelos animais maiores, incluindo, por exemplo, roedores e teleus. Este método pode fornecer uma visão da regulação endócrina do intestino, incluindo o transporte epitelial, bem como músculo liso associado ao trato gastrointestinal em insetos e em espécies não-insetos de tamanho semelhante.Demonstrando os procedimentos tubais renais de insetos estará Farwa Sajadi, um doutorando do meu laboratório. Além disso, um ex-estudante de pós-graduação do meu laboratório Aryan Lajevardi estará demonstrando os protocolos focados em hindgut. Comece preparando o Ramsay e a contração ensaios pratos para os experimentos.Use pipeta e encha poços com até 20 microliters de solução. Para controles não estimulados, preencha os poços com 20 microliters do meio de Aedes salino Schneider. Uma vez que todos os poços estejam cheios, despeje óleo mineral hidratado no prato de ensaio até que os poços e pinos minutien estejam submersos.Depois de imergir o túbulo no poço, pegue a extremidade proximal do túbulo com fórceps, remova-a da gota de banho e enrole a extremidade em torno do pino. Enrole o túbulo ao redor do pino duas vezes mantendo o comprimento do túbulo permanecendo na gota de banho consistente com os outros túbulos. Para fazer uma microeletroroda seletiva de sódio, use uma seringa de um mililitro para enchimento do eletrodo com cloreto de sódio de 100 mililitros.Certifique-se de que a solução de enchimento de enco tudo se encha até a ponta do eletrodo. Se aparecerem bolhas de ar, gire suavemente o microeletrodo ou remova a solução e reabasteça. Mergulhe uma ponta de pipeta de 10 microliter na solução de ionóforo seletivo de sódio.Alinque o eletrodo perpendicular à pipeta, em seguida, coloque um dedo enluvado sobre a parte inferior da ponta para criar pressão e expulse uma pequena gota de ionóforo. Toque cuidadosamente a gota de ionophore para a ponta de microeletrídico, certificando-se de não quebrá-la. Encha um pequeno béquer no meio do caminho com 100 mililitros de sódio e coloque um pouco de argila modeladora no interior no topo do béquer.Depois que o ionóforo tiver sido tomado, coloque a ponta de eletrodo na parede do béquer, deixando as pontas dentro do cloreto de sódio. Mantenha o ISME no béquer até que esteja pronto para uso. Para fazer o eletrodo de referência ISME, encha um eletrodo com cloreto de potássio de 500 milimilas e armazene-o em um béquer.Cubra as pontas do eletrodo utilizando uma solução de aproximadamente 3,5% de cloreto de polivinil, dissolvido em tetrahidrofurano, para evitar o deslocamento do ionóforo quando submerso em óleo de parafina. Para calibrar o eletrodo de sódio, coloque 10 gotículas de microliter de concentrações padrão de cloreto de sódio na borda do prato Ramsey com os túbulos malpighianos incubados. Coloque as gotículas padrão a dois centímetros de distância com a maior concentração em cima.Insira o eletrodo de referência e o eletrodo seletivo de íon sobre os fios de prata do cloreto e fixe-os com segurança usando suportes de eletrodos que estão ligados a micro manipuladores. Navegue pelos dois eletrodos em direção à gotícula de cloreto de sódio de 200 milimões usando os micro manipuladores, garantindo que as pontas eletro não toquem na parte inferior do prato. Ligue o eletrometro para iniciar a gravação e deixe a leitura estabilizar.Grave a leitura e continue para o próximo padrão. Após a aquisição de medições da taxa de secreção de fluidos, mova cuidadosamente os eletrodos seletivos de referência e íon para a gotícula secreta usando os micro manipuladores. Ligue a gravação e deixe a leitura estabilizar e, em seguida, grave.Ligue o Amplificador IPA-2 Ion/Polarographic, o microscópio de luz e os computadores. Coloque a microeletrídra seletiva de sódio em um suporte constituído por um fio de cloreto de prata e conecte-o na tomada do conector feminino. Remova um eletrodo de referência do béquer com o cloreto de potássio, colocando um dedo em uma extremidade e inclinando o capilar de vidro em direção a este dedo para evitar que o ágar caia.Coloque cuidadosamente uma extremidade no suporte, garantindo que não se forme bolhas. Se houver uma bolha, remova o eletrodo de referência, rechee o suporte com três cloreto de potássio molar e repita. Coloque o suporte de eletrodo na tomada do conector feminino.Após a calibração, disseca o órgão. Coloque o prato de poli-L-lysine com a amostra dissecada no estágio do microscópio e insira a ponta do eletrodo de referência dentro do soro fisiológico. Submergir a ponta do íon microeletrodo seletivo no soro fisiológico, tomando cuidado para não quebrar a ponta.Use os botões de ajuste manual para ajustar a posição de microeletrídro enquanto olha sob o microscópio de luz. Ajuste a posição vertical do microeletrodo de tal forma que sua ponta esteja no mesmo plano que o órgão ou tecido, em seguida, gire o interruptor do motor para habilitar. Usando as teclas de seta do computador, mova o microeletrodo horizontalmente para uma posição de três milímetros de distância do tecido para medir gravações de fundo.Quando estiver pronto, comece a gravar pressionando F5, obtenha cinco medições de atividade de fundo. Mova a ponta da microeletrídria para perto do tecido tomando cuidado para não perfurar o órgão. Reduza a sensibilidade do golpe da chave para colocar a ponta do microelerode dois micrômetros diretamente para a direita, perpendicular ao tecido.Obtenha três gravações no local ao longo da almofada retal para identificar o local de maior atividade de íons e, em seguida, obter medições salinas de base no local exibindo maior atividade. Para registrar contrações de patas traseiras, encha um dos poços do prato com um volume conhecido de soro fisiológico do Aedes. Após a dissecação, transfira cuidadosamente o hindgut dissecado preso ao intestino médio em um poço em outro prato, certificando-se de não beliscar o íleo.Submergir o intestino no soro fisiológico dentro do poço e coloque pinos minutien no intestino médio e reto. O íleo não deve estar sob tensão e as contrações espontâneas originárias da válvula pilórica no íleo anterior devem ser observadas. Conecte a câmera de vídeo ao microscópio estereoscópico.Em seguida, coloque o prato contendo o órgão dissecado sob o microscópio e grave um vídeo por dois minutos. A aplicação de DH31 contra túbulos malpighianos não estimulados resulta em um aumento significativo na taxa de secreção de fluidos, confirmando seu papel como hormônio diurético em mosquitos Aedes. Quando os túbulos são tratados com AedaeCAPA-1, observa-se uma redução na taxa de secreção em túbulos malpighianos estimulados por DH31.Eletrodos seletivos de íons foram usados para medir concentrações de sódio nas gotículas secretadas. O tratamento de DH31 nos TM não teve efeito na concentração de sódio na gotícula secretada. No entanto, com a aplicação do AedaeCAPA-1, a concentração de sódio no fluido secretado foi significativamente aumentada.Além disso, em comparação com os controles não estimulados, o DH31 levou a uma taxa de transporte de sódio significativamente maior, enquanto o AedaeCAPA-1 aboliu esse aumento nos túbulos estimulados por DH31. O SIET foi utilizado para avaliar alterações no transporte de sódio ao longo da pítelia retal de mosquitos fêmeas adultas. Um analógico leucocina foi usado para examinar alterações na absorção de sódio, o que resultou em uma redução de quatro vezes na absorção de sódio em comparação com o controle salino.Para avaliar o papel de um neuropeptídeo pirokinin2 na motilidade ileal, foi utilizado um análogo de Rodélio prolixus, que foi mostrado anteriormente para ativar o receptor A.aegypti PK2 enriquecido no íleo do mosquito. Em relação aos níveis de linha de base, o PK2 inibe significativamente as contrações ileais. Ao realizar um ensaio ramsay com túbulos malpighianos e medindo taxas de íon ou secreção de fluidos, é imperativo que os túbulos não sejam danificados durante a dissecção ou durante a transferência para o prato de ensaio.Seguindo o ensaio de Ramsay, transportadores específicos de membrana podem ser direcionados farmacologicamente ou molecularmente usando técnicas genéticas reversas para discernir sua contribuição específica para o transporte transepitelio de solutos no epitélio simples.

Research

JoVE Journal

Biology

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Biologia

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

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Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself Dispositivo de Recuperação de amostras criopreservadas cair acidentalmente em Tanques de armazenamento criogênico

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Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

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Uma Experimental e Bioinformática Protocolo de Análises de RNA-seq de fotoperiódicas diapausa no Tigre Asiático Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

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Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Um sistema BW repórter para estudar interações ligante-Receptor

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...