Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Это исследование финансировалось Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) Discovery Grants для AD и J-PP. AL и FS получили награды NSERC CGS-M в поддержку своих исследований выпускников.

1. Изготовление блюд с силиконовой подкладкой
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен до начала экспериментов. Эти блюда будут сделаны для приготовления пробирного блюда для вскрытия и для экспериментов по анализу сокращения.
<ol><li>Подготовьте силикон с помощью компле...

При проглатывании кровяной муки гематофагусные насекомые сталкиваются с проблемой избытка растворенных веществ и воды в своей гемолимфе2. Чтобы справиться с этим, они имеют специализированную выделительную систему, которая жестко контролируется гормональными факторами...

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

Исследования физиологии насекомых, особенно у тех видов, которые являются переносчиками патогенов, вызывающих заболевания у людей и других позвоночных, обеспечивают основу для разработки новых стратегий борьбы с вредителями. Здесь описан ряд методов, которые обычно используются для определения функциональной роли нейропептидов и других нейронных факторов (т. Е. Биогенных аминов) на выделительной системе комара Aedes aegypti. Мальпигиевы канальцы (МТ), ответственные за первичное образование мочи, могут продолжать функционировать в течение нескольких часов при удалении от комара, что позволяет измерять секрецию жидкости после гормональной обработки. Таким образом, анализ Рамзи является полезным методом для измерения скорости секреции из изолированных MTs. Ионселективные микроэлектроды (ISME) могут последовательно использоваться для измерения концентраций ионов (т. Е. Na+ и K+) в секретируемой жидкости. Этот анализ позволяет измерять несколько МТ в данный момент времени, определяя эффекты различных гормонов и лекарств. Метод сканирующих ионселективных электродов использует ISME для измерения напряжения, представляющего ионную активность в неперетечном слое, прилегающем к поверхности органов, транспортирующих ионы, для определения трансэпителиального переноса ионов в режиме, близком к реальному времени. Этот метод может быть использован для понимания роли гормонов и других регуляторов в поглощении или секреции ионов через эпителий. Анализы сокращения задних конечностей также являются полезным инструментом для характеристики миоактивных нейропептидов, которые могут усиливать или уменьшать способность этого органа удалять лишнюю жидкость и отходы. В совокупности эти методы дают представление о том, как выделительная система регулируется у взрослых комаров. Это важно, потому что функциональная координация выделительных органов имеет решающее значение для преодоления таких проблем, как стресс высыхания после эклозии и до поиска подходящего хозяина позвоночных для получения кровеносной муки.

Применение DH31 против нестимулированных МТ приводит к значительному увеличению скорости секреции жидкости, подтверждая ее роль в качестве мочегонного гормона у комаров Aedes (рисунок 1A). При обработке канальцев AedaeCAPA-1 наблюдается снижение скорости секреци...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

В этом протоколе излагаются методологии, лежащие в основе анализа Рамсея, ионселективных микроэлектродов, сканирующей ионселективной электродной техники (SIET) и анализов сокращения in vitro, применяемых для изучения выделительной системы взрослых комаров, состоящей из мальпигиевых канальцев и задней кишки, для коллективного измерения скорости секреции ионов и жидкости, сократительной активности и транспорта трансэпителиальных ионов.

Изучение активности нейропептидов и других регуляторов выделительной системы у взрослого комара

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Этот протокол описывает методы, которые могут быть использованы физиологами мелких животных для выяснения роли нейропептидов и других гормональных факторов, которые регулируют пищеварительную и / или выделительную систему. Эти методы позволяют измерять микроразмерные биологические образцы, которые в противном случае были бы невозможны с использованием методов, разработанных специально для более крупных моделей животных, включая, например, грызунов и телеусов. Этот метод может дать представление об эндокринной регуляции кишечника, включая транспортировку эпителиальных, а также гладких мышц, связанных с желудочно-кишечным трактом у насекомых и у видов, не являющихся насекомыми аналогичного размера.Демонстрацию процедур почечной трубы насекомых продемонстрирует Фарва Саджади, кандидат наук из моей лаборатории. Кроме того, бывший аспирант из моей лаборатории Арьян Ладжеварди будет демонстрировать протоколы, ориентированные на заднюю кишку. Начните с приготовления блюд Рамзи и анализа сокращения для экспериментов.Используйте пипетку и заполняйте колодцы до 20 микролитров раствора. Для нестимулированного контроля заполните скважины 20 микролитрами соленой среды Шнайдера Aedes. После того, как все скважины заполнены, налейте гидратированное минеральное масло в пробирную посуду до тех пор, пока колодцы и штифты Minutien не будут погружены.После погружения канальца в колодец поднимите проксимальный конец канальца щипцами, извлеките его из капельки для купания и оберните конец вокруг штифта. Обмотайте каналец вокруг штифта дважды, сохраняя длину трубочки, оставшейся в капле для купания, в соответствии с другими канальцами. Чтобы сделать селективный микроэлектрод натрия, используйте шприц в один миллилитр для засыпки электрода 100 миллимолярным хлоридом натрия.Убедитесь, что раствор для засыпки заполнен до конца электрода. При появлении пузырьков воздуха осторожно проведите микроэлектродом или извлеките раствор и заправьте. Окуните 10-микролитровый наконечник пипетки в раствор селективного ионофора натрия.Выровняйте электрод перпендикулярно пипетке, затем поместите палец в перчатке на нижнюю часть кончика, чтобы создать давление и изгнать небольшую каплю ионофора. Осторожно прикосните каплю ионофора к кончику микроэлектрода, следя за тем, чтобы не сломать его. Заполните небольшой стакан наполовину 100 миллимолярным хлоридом натрия и поместите немного моделирующей глины на внутреннюю часть в верхней части стакана.После того, как ионофор был взят, поместите наконечник электрода вниз на стенку стакана, впустив наконечники внутрь хлорида натрия. Храните ISME в стакане до тех пор, пока он не будет готов к использованию. Чтобы сделать электрод сравнения ISME, засыпьте электрод 500 миллимолярами хлорида калия и храните его в стакане.Обложите наконечники электродов раствором примерно 3,5% поливинилхлорида, растворенного в тетрагидрофуране, чтобы избежать смещения ионофора при погружении в парафиновое масло. Чтобы откалибровать натриевый электрод, поместите 10 микролитровых капель стандартных концентраций хлорида натрия на край чашки Рамси с инкубированными мальпигиевыми канальцами. Поместите стандартные капли на расстоянии двух сантиметров друг от друга с более высокой концентрацией сверху.Вставьте как электрод сравнения, так и ионселективный электрод поверх хлоридно-серебряных проводов и надежно скрепите их с помощью держателей электродов, которые прикреплены к микроманипуляторам. Направьте оба электрода к 200-миллимолярной капле хлорида натрия с помощью микроманипуляторов, следя за тем, чтобы электрокончики не касались дна тарелки. Включите электрометр, чтобы начать запись и стабилизировать показания.Запишите чтение и перейдите к следующему стандарту. После получения измерений скорости секреции жидкости осторожно переместите эталонные и ионселективные электроды в секретируемую каплю с помощью микроманипуляторов. Включите запись и дайте показаниям стабилизироваться, а затем запишите.Включите ионный/полярографический усилитель IPA-2, световой микроскоп и компьютеры. Поместите селективный микроэлектрод натрия на держатель, состоящий из проволоки хлорида серебра, и прикрепите его к гнезду разъема. Извлеките один опорный электрод из стакана с хлоридом калия, поместив один палец на один конец и наклонив стеклянный капилляр в сторону этого пальца, чтобы предотвратить выпадение агара.Осторожно поместите один конец в держатель, следя за тем, чтобы не образовались пузырьки. Если есть пузырь, снимите опорный электрод, наполните держатель тремя молярными хлоридами калия и повторите. Поместите держатель электрода в гнездо разъема.После калибровки рассекают орган. Поместите поли-L-лизиновую тарелку с рассеченным образцом на ступень микроскопа и вставьте наконечник эталонного электрода внутрь физиологического раствора. Погрузите наконечник ионселективного микроэлектрода в физиологический раствор, следя за тем, чтобы не сломать наконечник.Используйте ручные регуляторы для регулировки положения микроэлектрода во время просмотра под световым микроскопом. Отрегулируйте вертикальное положение микроэлектрода таким образом, чтобы его кончик находился на той же плоскости, что и орган или ткань, затем включите переключатель двигателя. С помощью клавиш со стрелками компьютера переместите микроэлектрод горизонтально в положение, находящееся на расстоянии трех миллиметров от ткани, чтобы измерить фоновые записи.Когда будете готовы, начните запись, нажав клавишу F5, получите пять измерений фоновой активности. Переместите кончик микроэлектрода близко к ткани, заботясь о том, чтобы не проткнуть орган. Уменьшите чувствительность нажатия клавиши, чтобы поместить наконечник микроэлектрода на два микрометра непосредственно вправо, перпендикулярно ткани.Получите три записи на участке вдоль ректальной прокладки, чтобы определить место наибольшей активности ионов, а затем получить исходные измерения физиологического раствора на участке, проявляющем наибольшую активность. Чтобы зафиксировать сокращения задней кишки, заполните одну из лунок в блюде известным объемом физиологического раствора Aedes. После рассечения аккуратно переложите рассеченную заднюю кишку, прикрепленную к средней кишке, в колодец в другой посуде, следя за тем, чтобы не защемить подвздошную кишку.Погрузите кишечник в физиологический раствор внутри колодца и поместите штифты Minutien в среднюю часть кишечника и прямую кишку. Подвздошная кишка не должна находиться под напряжением и должны наблюдаться самопроизвольные сокращения, возникающие у пилорического клапана в передней подвздошной кишке. Подключите видеокамеру к стереоскопическому микроскопу.Затем поместите блюдо, содержащее рассеченный орган, под микроскоп и запишите видео в течение двух минут. Применение DH31 против нестимулированных мальпигиевых канальцев приводит к значительному увеличению скорости секреции жидкости, подтверждая его роль в качестве мочегонного гормона у комаров Aedes. При обработке канальцев AedaeCAPA-1 наблюдается снижение скорости секреции в dh31 стимулированных мальпигиевскими канальцами.Ионселективные электроды использовали для измерения концентраций натрия в секретируемых каплях. Лечение DH31 на МТ не влияло на концентрацию натрия в секретируемой капле. Однако при применении AedaeCAPA-1 концентрация натрия в секретируемой жидкости была значительно увеличена.Кроме того, по сравнению с нестимулированным контролем, DH31 привел к значительно большей скорости переноса натрия, тогда как AedaeCAPA-1 отменил это увеличение канальцев, стимулируемых DH31. SIET использовался для оценки изменений в транспорте натрия вдоль эпителия ректальной прокладки взрослых самок комаров. Аналог лейкокинина был использован для изучения изменений в абсорбции натрия, что привело к четырехкратному снижению абсорбции натрия по сравнению с контролем физиологического раствора.Для оценки роли нейропептида пирокинина2 на подвижность подвздошной кишки был использован аналог Rhodnius prolixus, который, как было ранее показано, активирует рецептор A.aegypti PK2, обогащенный в подвздошной кишки комара. По сравнению с исходными уровнями PK2 значительно ингибирует сокращения подвздошной кишки. При выполнении анализа Рамзая с мальпигианскими канальцами и измерении скорости секреции ионов или жидкости крайне важно, чтобы канальцы не были повреждены во время рассечения или во время переноса в пробную чашку.Следуя анализу Рамзи, специфические мембранные транспортеры могут быть нацелены либо фармакологически, либо молекулярно с использованием обратных генетических методов, чтобы определить их конкретный вклад в трансэпителиальный транспорт растворенных веществ в простом эпителии.

Research

JoVE Journal

Biology

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Внутрибрюшинного введения в взрослых данио рерио

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Стабильный Изотопный Профилирование посредник Flux Метаболический в развивающихся странах и взрослой стадии Caenorhabditis Элеганс</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself Устройство для восстановления криоконсервированных образцов случайно уронил в криогенных резервуаров

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging взрослых данио рерио

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Экспериментальные и биоинформатика Протокол Секвенирование РНК Анализы ФОТОПЕРИОДИЧЕСКИХ диапаузы в Азиатско тигровый комар,<em&gt; Кусака бело-пёстрый</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Физиологические Записи и РНК Секвенирование Вкусовые придатков Желто-лихорадки комаров<em&gt; Комар желтолихорадочный</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Измерение личинок деятельности в<em&gt; Drosophila</em&gt; Монитор активности

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Визуализация пространственной реорганизацией МАРК сигнального пути с помощью переходного процесса система экспрессии Tobacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Репортер BW системы для изучения взаимодействия рецептор лиганд

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...