Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Esta investigación fue financiada por Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants a AD y J-PP. AL y FS recibieron premios NSERC CGS-M en apoyo de su investigación de posgrado.

1. Hacer platos forrados de silicona
NOTA: Este paso debe realizarse antes de los experimentos. Estos platos se harán para preparar el plato de ensayo para disecciones y para experimentos de ensayo de contracción.
<ol><li>Prepare la silicona con un kit de elastómero de silicona siguiendo las recomendaciones del fabricante. Mezcle los componentes líquidos de dos partes en una proporción de 10 a 1. Mezcle suavemente y a fondo invirtiendo, pero asegúrese de minimizar la formación de burb...

Al ingerir una comida de sangre, los insectos hematófagos se enfrentan al desafío del exceso de solutos y agua en su hemolinfa2. Para hacer frente a esto, tienen un sistema excretor especializado, que está estrechamente controlado por factores hormonales, lo que permite a los insectos iniciar rápidamente la diuresis postprandial. El ensayo de Ramsay y el uso de microelectrodos selectivos de iones permiten medir las tasas de secreción de líquido junto con las concentraciones de iones y las ta...

El mantenimiento de los niveles de sal y agua en los insectos les permite tener éxito en muchos nichos ecológicos y ambientales, utilizando una variedad de estrategias de alimentación1. La mayoría de los insectos han desarrollado mecanismos para regular la composición de su hemolinfa dentro de límites estrechos con el fin de soportar los diferentes desafíos asociados con su entorno particular2. Los insectos terrestres a menudo se enfrentan al desafío de conservar el agua y el sistema excretor se somete a antidiuresis para evitar la pérdida de agua y algunas sales esenciales, por lo tanto, evitando la desecación. Por el contrario, la diuresis ocurre cuando el insecto se alimenta y es desafiado con el exceso de agua y potencialmente sales3,4. A través de su sistema excretor especializado y altamente activo, los insectos han desarrollado mecanismos reguladores que actúan para contrarrestar sus desafíos osmorreguladores. En los mosquitos adultos Aedes aegypti, el sistema excretor está compuesto por los túbulos de Malpighian (MT) y el intestino posterior, este último formado por el íleon anterior y el recto posterior5. Los MT son responsables de generar orina primaria, generalmente rica en NaCl y/o KCl. La orina primaria se modifica a través de procesos secretores y reabsortivos a medida que viaja aguas abajo del túbulo y entra en el intestino posterior5. Los excrementos finales pueden ser hiper o hipoosmóticos a la hemolinfa, dependiendo de las condiciones de alimentación/ambientales, y están enriquecidos en desechos tóxicos y nitrogenados2.
Las MT son ideales para estudiar muchas características del transporte de líquido epitelial y soluto, ya que realizan una gran variedad de funciones de transporte y excretoras2,6. A través de la regulación hormonal2, las MT funcionan secretando iones y otros solutos de la sangre hacia el túbulo lumen7, proporcionando un gradiente osmótico que permite que el agua sea transportada por acuaporinas8,9, que colectivamente crea la orina primaria, antes de viajar hacia el intestino posterior reabsortivo2. Por lo tanto, al recolectar el fluido secretado de MT aislados, se puede monitorear continuamente el transporte transepitelial de fluido e iones. La medición de la tasa de secreción y la composición de la orina proporciona información sobre los mecanismos responsables del transporte de iones y líquidos transepiteliales. Un método popular para estudiar las tasas de secreción de fluidos es el ensayo de Ramsay, que fue introducido por primera vez por Ramsay en 195310. En este método, el extremo distal (cerrado) del túbulo se trata con una hormona (u otro compuesto / fármaco de prueba), mientras que el extremo proximal (abierto) se envuelve alrededor de un alfiler en aceite de parafina saturado de agua, que secreta la orina primaria, acumulándose como una gota en la punta del alfiler. Los MT aislados son capaces de sobrevivir y funcionar durante largos períodos (hasta 24 h) en condiciones in vitro optimizadas, lo que los convierte en modelos adecuados y eficientes para la medición de la secreción de fluidos. Los insectos tienen sistemas circulatorios abiertos, por lo que los MT se diseccionan y eliminan fácilmente, ya que generalmente flotan libremente en la hemolinfa6. Además, con la excepción de los pulgones, que carecen de MT11, el número de MT en una especie de insecto dada puede variar considerablemente de cuatro a cientos (cinco en mosquitos Aedes), lo que permite múltiples mediciones de un insecto.
Los MT en los mosquitos Aedes, al igual que otros insectos endopterigotas, están compuestos por dos tipos de células que forman un epitelio simple2,12; células principales grandes, que facilitan el transporte activo de cationes (es decir, Na+ y K+) hacia la luz, y células estrelladas delgadas, que ayudan en la secreción transepitelial de Cl-13. Los MT no están inervados2, sino que están regulados por varias hormonas, incluidos factores diuréticos y antidiuréticos, lo que permite el control del transporte de iones (principalmente Na+, K+ y Cl-) y el agua osmóticamente obligada2. Numerosos estudios han examinado la regulación hormonal de los MT de Aedes para comprender el papel de los factores endocrinos en el transporte transepitelial14,15,16,17,18. Como se muestra en los resultados representativos, los protocolos aquí presentes demuestran los efectos de diferentes factores hormonales en TM aislados de mosquitos A. aegypti hembras adultas, incluido el control diurético y antidiurético (Figura 1). El ensayo de Ramsay se utiliza para demostrar cómo una hormona antidiurética, AedaeCAPA-1, inhibe la secreción de líquido de LAS ESTIMULADAS por la hormona diurética 31 (DH31) (Figura 1).
El tamaño más pequeño de los insectos ha requerido el desarrollo de micro métodos para medir la actividad iónica y las concentraciones en muestras de fluidos, o cerca de la superficie de tejidos aislados como los MT y el intestino. Se han implementado diversos métodos, incluyendo el uso de radioisótopos de iones19, que requiere la recolección de las gotas de fluido secretadas para la medición de las concentraciones de iones20. Los túbulos de Aedes estimulados in vitro generalmente secretan ~ 0.5 nL / min21, por lo que el manejo de volúmenes tan pequeños puede representar un desafío y potencialmente introducir errores en la transferencia. Como resultado, los microelectrodos selectivos de iones (IME) se han utilizado ampliamente para medir las concentraciones de iones en gotas secretadas de MT in vitro. En este método, un electrodo de referencia y un ISME, llenos de la solución de relleno y el ionóforo apropiados, se colocan en la gota de orina secretada para determinar las concentraciones de iones22. Adaptado de Donini y sus colegas23, este protocolo actual utiliza un ionóforo selectivo de Na+ para medir la actividad iónica en gotitas secretadas de MT estimuladas en mosquitos Aedes adultos. Dado que los microelectrodos selectivos de iones miden la actividad iónica, estos datos pueden expresarse como concentraciones de iones siguiendo el supuesto de que las soluciones de calibración y las muestras experimentales comparten el mismo coeficiente de actividad iónica21 (Figura 1B,C).
La técnica de electrodo selectivo de iones de barrido (SIET) también hace uso de ISMEs para medir gradientes de concentración de iones en la capa no erosionada adyacente a órganos, tejidos o células que transportan iones. Los ISMEs miden gradientes de voltaje que luego se pueden usar para calcular los gradientes de concentración de iones y la dirección y magnitud del flujo de iones a través del órgano, tejido o célula20. En esta técnica, el ISME se monta en un manipulador de tres ejes controlado por motores micropastores computarizados para que su posición 3D se controle al nivel micrométrico20. Los voltajes se miden en dos puntos dentro de la capa no agitada utilizando un protocolo de muestreo programado y controlado por un software informático. Los dos puntos están típicamente separados por una distancia de 20–100 μm con un punto dentro de 5–10 μm de la superficie del órgano, tejido o célula y el segundo punto a 20–100 μm de distancia. La diferencia de magnitud de tensiones entre los dos puntos se calcula para obtener un gradiente de tensión24,25,26, que luego se utiliza para calcular el gradiente de concentración y posteriormente el flujo neto utilizando la Ley de Fick24,27. Este método es útil para evaluar el transporte de iones específicos a través de diferentes regiones del intestino del insecto y las MT, o en puntos de tiempo específicos después de una exposición a la harina de sangre o al tratamiento. Por ejemplo, el SIET se puede utilizar para comprender cómo los procesos de absorción y secreción en el sistema excretor de mosquitos están regulados por hormonas28, así como por diferentes comportamientos de alimentación y condiciones de cría25. Trabajos previos utilizando el SIET revelaron sitios involucrados en el transporte de iones a lo largo de las papilas anales y el recto de mosquitos larvales y adultos24,28. El protocolo actual, descrito anteriormente por Paluzzi y sus colegas26, mide el flujo de Na+ a través de los epitelios de la almohadilla rectal del recto femenino adulto (Figura 2).
El segmento final del sistema excretor de mosquitos requiere un movimiento muscular coordinado para ayudar a mezclar los alimentos y secretar desechos26. Los productos no absorbibles de la digestión del intestino medio, junto con la orina primaria secretada por los MT, se pasan a través de la válvula pilórica y se entregan al intestino posterior2. Las contracciones espontáneas del intestino posterior comienzan en la válvula pilórica y ocurren en ondas peristálticas, que se transmiten sobre el íleon a través de la contracción coordinada de los músculos circulares y longitudinales que rodean la superficie basal de las células epiteliales26. Finalmente, los músculos dentro del recto ayudan a impulsar y eliminar los desechos a través del canal anal. Aunque la motilidad del intestino posterior de los insectos es miogénica, requiriendo Ca2+ extracelular para producir contracciones espontáneas, estos procesos también pueden ser regulados neuronalmente26,29,30. Esta regulación exógena por parte del sistema nervioso es importante después de la alimentación, ya que el animal debe expulsar los desechos del intestino y restaurar el equilibrio hemolinfático31. Como resultado, la realización de bioensayos in vitro para identificar neuropéptidos mioestimuladores o mioinhibitorios es útil para evaluar cómo los neuroquímicos influyen en la motilidad del intestino posterior. El protocolo actual, realizado por Lajevardi y Paluzzi28, utiliza grabaciones de video para examinar la motilidad ileal en respuesta a neuropéptidos (Figura 3). Del mismo modo, también se puede utilizar un transductor de fuerza o un convertidor de impedancia para observar rastros de contracciones a través de un software de adquisición de datos32,33. Sin embargo, el uso de la tecnología de video nos permite evaluar visualmente el órgano y analizar más a fondo utilizando un subconjunto de parámetros para identificar el papel de las hormonas en la motilidad del intestino posterior.
El uso de estas técnicas puede ayudar a caracterizar los factores que regulan y coordinan el transporte de líquidos e iones a lo largo del sistema excretor junto con la motilidad del intestino posterior. Es importante destacar que se apoya un vínculo funcional entre la respuesta diurética de los MT y la motilidad del intestino posterior, ya que también se ha encontrado que las hormonas diuréticas, como DH31 y 5HT, caracterizadas por su capacidad para estimular la secreción de líquidos por las MT, exhiben acciones miotrópicas a lo largo del intestino posterior del mosquito21,34,35 . Estos hallazgos resaltan la importancia de una coordinación estricta entre los MT y el intestino posterior durante eventos como la diuresis postprandial en insectos que requieren una rápida eliminación de desechos.
Aquí, se describe el enfoque detallado detrás de la técnica de ensayo de Ramsay para medir la tasa de secreción de líquido en el mosquito, A. aegypti, y el uso de microelectrodos selectivos de iones para determinar las concentraciones de Na + dentro del fluido secretado de los MT, que cuando se combinan permite determinar las tasas de transporte de iones transepiteliales. Además, se describen la Técnica de Electrodo Selectivo de Iones de Barrido y los ensayos de contracción del intestino posterior para medir el flujo iónico y la motilidad, respectivamente, lo que ayuda a dilucidar la regulación hormonal del intestino posterior (Figura 4).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

Los estudios de fisiología de insectos, particularmente en aquellas especies que son vectores de patógenos que causan enfermedades en humanos y otros vertebrados, proporcionan la base para desarrollar estrategias novedosas para el control de plagas. Aquí, se describen una serie de métodos que se utilizan rutinariamente para determinar el papel funcional de los neuropéptidos y otros factores neuronales (es decir, aminas biogénicas) en el sistema excretor del mosquito, Aedes aegypti. Los túbulos de Malpighian (TM), responsables de la formación primaria de orina, pueden continuar funcionando durante horas cuando se eliminan del mosquito, lo que permite mediciones de secreción de líquido después de los tratamientos hormonales. Como tal, el ensayo de Ramsay es una técnica útil para medir las tasas de secreción de MT aislados. Los microelectrodos selectivos de iones (ISME) se pueden usar secuencialmente para medir las concentraciones de iones (es decir, Na + y K +) en el fluido secretado. Este ensayo permite la medición de varios TM en un momento dado, determinando los efectos de varias hormonas y medicamentos. La técnica de electrodo selectivo de iones de barrido utiliza ISME para medir el voltaje representativo de la actividad iónica en la capa no agitada adyacente a la superficie de los órganos transportadores de iones para determinar el transporte transepitelial de iones en tiempo casi real. Este método se puede utilizar para comprender el papel de las hormonas y otros reguladores en la absorción o secreción de iones a través de los epitelios. Los ensayos de contracción del intestino posterior también son una herramienta útil para caracterizar neuropéptidos mioactivos, que pueden mejorar o reducir la capacidad de este órgano para eliminar el exceso de líquido y desechos. En conjunto, estos métodos proporcionan información sobre cómo se regula el sistema excretor en los mosquitos adultos. Esto es importante porque la coordinación funcional de los órganos excretores es crucial para superar desafíos como el estrés por desecación después de la eclosión y antes de encontrar un huésped vertebrado adecuado para obtener una harina de sangre.

La aplicación de DH31 contra las MT no estimuladas da como resultado un aumento significativo en la tasa de secreción de líquidos, lo que confirma su papel como hormona diurética en los mosquitos Aedes (Figura 1A). Cuando los túbulos se tratan con AedaeCAPA-1, se observa una reducción en la tasa de secreción en las MT estimuladas por DH31. La Figura 1B demuestra el uso de electrodos selectivos de iones para medir la...

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Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Este protocolo describe las metodologías detrás del ensayo de Ramsay, los microelectrodos selectivos de iones, la técnica de electrodo selectivo de iones de barrido (SIET) y los ensayos de contracción in vitro, aplicados para estudiar el sistema excretor de mosquitos adultos, compuesto por los túbulos de Malpighian y el intestino posterior, para medir colectivamente las tasas de secreción de iones y líquidos, la actividad contráctil y el transporte de iones transepiteliales.

Estudio de la actividad de los neuropéptidos y otros reguladores del sistema excretor en el mosquito adulto

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Este protocolo describe técnicas que pueden ser utilizadas por los fisiólogos de pequeños animales para dilucidar el papel de los neuropéptidos y otros factores hormonales que regulan el sistema digestivo y/o excretor. Estas técnicas permiten mediciones de muestras biológicas de tamaño micro que de otro modo no serían posibles utilizando técnicas diseñadas específicamente para modelos animales más grandes, incluidos, por ejemplo, roedores y teleus. Este método puede proporcionar información sobre la regulación endocrina del intestino, incluido el transporte epitelial, así como el músculo liso asociado con el tracto gastrointestinal en insectos y en especies no insectígenas de tamaño similar.Demostrando los procedimientos de trompas renales de insectos estará Farwa Sajadi, un candidato a doctorado de mi laboratorio. Además, un ex estudiante graduado de mi laboratorio Aryan Lajevardi demostrará los protocolos centrados en el intestino trasero. Comience preparando los platos de Ramsay y ensayos de contracción para los experimentos.Use pipeta y llene los pozos con hasta 20 microlitros de solución. Para controles no estimulados, llene los pozos con 20 microlitros de medio salino de Aedes Schneider. Una vez que todos los pocillos estén llenos, vierta aceite mineral hidratado en el plato de ensayo hasta que los pocillos y los alfileres minutien estén sumergidos.Después de sumergir el túbulo en el pozo, recoja el extremo proximal del túbulo con fórceps, retírelo de la gota de baño y envuelva el extremo alrededor del pasador. Envuelva el túbulo alrededor del pasador dos veces manteniendo la longitud del túbulo que queda en la gota de baño consistente con los otros túbulos. Para hacer un microelectrodo selectivo de sodio, use una jeringa de un mililitro para rellenar el electrodo con cloruro de sodio 100 milimolar.Asegúrese de que la solución de relleno se llene hasta la punta del electrodo. Si aparecen burbujas de aire, mueva suavemente el microelectrodo o retire la solución y vuelva a llenarla. Sumerja una punta de pipeta de 10 microlitros en la solución de ionóforo selectivo de sodio.Alinee el electrodo perpendicular a la pipeta, luego coloque un dedo enguantado sobre la parte inferior de la punta para crear presión y expulsar una pequeña gota de ionóforo. Toque con cuidado la gota de ionóforo en la punta del microelectrodo, asegurándose de no romperlo. Llene un vaso de precipitados pequeño hasta la mitad con cloruro de sodio 100 milimolar y coloque un poco de arcilla de modelado en el interior en la parte superior del vaso de precipitados.Después de que el ionóforo haya sido absorbido, coloque la punta del electrodo hacia abajo en la pared del vaso de precipitados, dejando las puntas dentro del cloruro de sodio. Mantenga isme en el vaso de precipitados hasta que esté listo para usar. Para hacer el electrodo de referencia ISME, rellene un electrodo con cloruro de potasio 500 milimolar y guárdelo en un vaso de precipitados.Cubra las puntas de los electrodos con una solución de aproximadamente 3,5% de cloruro de polivinilo, disuelta en tetrahidrofurano, para evitar el desplazamiento del ionóforo cuando se sumerge en aceite de parafina. Para calibrar el electrodo de sodio, coloque 10 gotas de microlitros de concentraciones estándar de cloruro de sodio en el borde del plato Ramsey con los túbulos malpighianos incubados. Coloque las gotas estándar a dos centímetros de distancia con la mayor concentración en la parte superior.Inserte tanto el electrodo de referencia como el electrodo selectivo de iones sobre los cables de cloruro de plata y sujéntelos de forma segura utilizando soportes de electrodos que estén conectados a micromanipuladores. Navegue por ambos electrodos hacia la gota de cloruro de sodio de 200 milimolares utilizando los micromanipuladores, asegurándose de que las puntas eléctricas no toquen el fondo del plato. Encienda el electrómetro para comenzar a grabar y permita que la lectura se estabilice.Registre la lectura y continúe con el siguiente estándar. Después de adquirir mediciones de la tasa de secreción de fluido, mueva cuidadosamente los electrodos selectivos de referencia e iones en la gota secretada utilizando los micromanipuladores. Encienda la grabación y permita que la lectura se estabilice, luego grabe.Encienda el amplificador de iones/polarográfico IPA-2, el microscopio de luz y los ordenadores. Coloque el microelectrodo selectivo de sodio en un soporte que consiste en un cable de cloruro de plata y conéctelo al conector hembra. Retire un electrodo de referencia del vaso de precipitados con el cloruro de potasio, colocando un dedo en un extremo e inclinando el capilar de vidrio hacia este dedo para evitar que el agar se caiga.Coloque con cuidado un extremo en el soporte, asegurándose de que no se formen burbujas. Si hay una burbuja, retire el electrodo de referencia, vuelva a llenar el soporte con cloruro de potasio de tres molares y repita. Coloque el soporte del electrodo en el conector hembra.Después de la calibración, diseccione el órgano. Coloque la placa de poli-L-lisina con la muestra diseccionada en la etapa del microscopio e inserte la punta del electrodo de referencia dentro de la solución salina. Sumergir la punta del microelectrodo selectivo de iones en la solución salina, teniendo cuidado de no romper la punta.Utilice las perillas de ajuste manual para ajustar la posición del microelectrodo mientras mira bajo el microscopio óptico. Ajuste la posición vertical del microelectrodo de modo que su punta esté en el mismo plano que el órgano o tejido, luego gire el interruptor del motor para habilitarlo. Usando las teclas de flecha de la computadora, mueva el microelectrodo horizontalmente a una posición a tres milímetros de distancia del tejido para medir las grabaciones de fondo.Cuando esté listo, comience a grabar presionando F5, obtenga cinco mediciones de la actividad de fondo. Mueva la punta del microelectrodo cerca del tejido teniendo cuidado de no perforar el órgano. Reduzca la sensibilidad a golpes de la tecla para colocar la punta del microelectrodo dos micrómetros directamente a la derecha, perpendicular al tejido.Obtenga tres registros en el sitio a lo largo de la almohadilla rectal para identificar el sitio de mayor actividad iónica, luego obtenga mediciones salinas de referencia en el sitio que muestra la mayor actividad. Para registrar las contracciones del intestino posterior, llene uno de los pocillos en el plato con un volumen conocido de solución salina de Aedes. Después de la disección, transfiera cuidadosamente el intestino posterior diseccionado unido al intestino medio a un pozo en otro plato, asegurándose de no pellizcar el íleon.Sumerja el intestino en la solución salina dentro del pozo y coloque los alfileres Minutien en el intestino medio y el recto. El íleon no debe estar bajo tensión y deben observarse contracciones espontáneas originadas en la válvula pilórica en el íleon anterior. Conecte la cámara de vídeo al microscopio estereoscópico.Luego coloque el plato que contiene el órgano diseccionado bajo el microscopio y grabe un video durante dos minutos. La aplicación de DH31 contra túbulos malpighianos no estimulados da como resultado un aumento significativo en la tasa de secreción de líquidos, lo que confirma su papel como hormona diurética en los mosquitos Aedes. Cuando los túbulos se tratan con AedaeCAPA-1, se observa una reducción en la tasa de secreción en los túbulos de Malpighian estimulados por DH31.Se utilizaron electrodos selectivos de iones para medir las concentraciones de sodio en las gotas secretadas. El tratamiento de DH31 en las MT no tuvo ningún efecto sobre la concentración de sodio en la gota secretada. Sin embargo, con la aplicación de AedaeCAPA-1, la concentración de sodio en el líquido secretado aumentó significativamente.Además, en comparación con los controles no estimulados, DH31 condujo a una tasa de transporte de sodio significativamente mayor, mientras que AedaeCAPA-1 abolió este aumento en los túbulos estimulados por DH31. El SIET se utilizó para evaluar los cambios en el transporte de sodio a lo largo del epitelial de la almohadilla rectal de los mosquitos hembra adultos. Se utilizó un análogo de leucoquinina para examinar los cambios en la absorción de sodio, lo que resultó en una disminución de cuatro veces en la absorción de sodio en comparación con el control salino.Para evaluar el papel de un neuropéptido piroquinina2 en la motilidad ileal, se utilizó un análogo de Rhodnius prolixus, que previamente se demostró que activaba el receptor A.aegypti PK2 enriquecido en el íleon del mosquito. En relación con los niveles basales, PK2 inhibe significativamente las contracciones ileales. Al realizar un ensayo de Ramsay con túbulos de Malpighian y medir las tasas de secreción de iones o líquidos, es imperativo que los túbulos no se dañen durante la disección o durante la transferencia al plato de ensayo.Después del ensayo de Ramsay, los transportadores de membrana específicos pueden ser dirigidos farmacológica o molecularmente utilizando técnicas genéticas inversas para discernir su contribución específica al transporte transepitelial de solutos en el epitelio simple.

Research

JoVE Journal

Biology

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Investigación

Biología

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

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Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

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