Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Denna forskning finansierades av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants till AD och J-PP. AL och FS fick NSERC CGS-M-utmärkelser till stöd för sin forskarutbildning.

1. Göra silikonfodrade rätter
OBS: Detta steg bör göras före experimenten. Dessa rätter kommer att göras för att förbereda analysrätten för dissekeringar och för kontraktionsanalysexperiment.
<ol><li>Förbered silikonet med hjälp av ett silikonelastomersats enligt tillverkarens rekommendationer. Blanda de tvådelade flytande komponenterna i ett förhållande av 10 till 1. Blanda försiktigt och noggrant genom att invertera men se till att minimera bubbelbildningen.</li>
	<li>Hä...

Vid intag av en blodmåltid står hematofaginsekter inför utmaningen med överskott av lösgöring och vatten i deras hemolymf2. För att klara av detta har de ett specialiserat utsöndringssystem, som är tätt kontrollerat av hormonella faktorer, vilket gör det möjligt för insekterna att snabbt initiera post-prandial diuresis. Ramsay-analysen och användningen av jonselektiva mikroelektroder möjliggör mätning av vätskeutsöndringshastigheter tillsammans med jonkoncentrationer och transpo...

Underhåll av salt- och vattennivåer i insekter gör det möjligt för dem att lyckas i många ekologiska och miljömässiga nischer, med hjälp av en mängd olika utfodringsstrategier1. De flesta insekter har utvecklat mekanismer för att reglera sammansättningen av sin hemolymf inom snäva gränser för att motstå de olika utmaningarna i samband med deras speciella miljö2. Terrestra insekter står ofta inför utmaningen att bevara vatten och utsöndringssystemet genomgår anti-diuresis för att förhindra förlust av vatten och vissa väsentliga salter, vilket undviker uttorkning. Däremot uppstår diures när insekten matar och utmanas med överskott av vatten och potentiellt salter3,4. Genom sitt specialiserade och mycket aktiva utsöndringssystem har insekter utvecklat regleringsmekanismer som verkar för att motverka deras osmoregulatoriska utmaningar. Hos vuxna Aedes aegypti myggor består utsöndringssystemet av malpighiska tubuler (MTs) och hindgut, varav den senare består av det främre ileum och bakre ändtarmen5. MTs är ansvariga för att generera primär urin, vanligtvis rik på NaCl och/eller KCl. Den primära urinen modifieras sedan genom sekretoriska och reabsorptive processer när den färdas nedströms tubule och går in i bakgut5. Den slutliga utsöndring kan vara hyper- eller hypoosmotisk för hemolymfen, beroende på utfodring/ miljöförhållanden, och berikas i giftigt och kvävehaltigt avfall2.
MTs är idealiska för att studera många funktioner i epitelvätska och lösningstransport eftersom de utför ett stort utbud av transport- och utsöndringsfunktioner2,6. Genom hormonell reglering2 fungerar MTs genom att utsöndra joner och andra lösgöringar från blodet till tubule lumen7, vilket ger en osmotisk gradient som gör det möjligt att transportera vatten med aquaporins8,9, vilket tillsammans skapar den primära urinen, innan den reser mot den reabsorptive hindgut2. Således, genom att samla den utsöndrade vätskan från isolerade MTs, kan man kontinuerligt övervaka transepithelial transport av vätska och joner. Mätning av utsöndringshastighet och urinsammansättning ger insikt om mekanismer som ansvarar för transepithelial jon och vätsketransport. En populär metod för att studera vätskeutsöndringshastigheter är Ramsay-analysen, som först introducerades av Ramsay 195310. I denna metod behandlas tubuleens distala (slutna) ände med ett hormon (eller annan testförening/läkemedel), medan den proximala (öppna) änden lindas runt en stift i vattenmättad paraffinolja, som utsöndrar den primära urinen och ackumuleras som en droppe på stiftspetsen. Isolerade MTs kan överleva och fungera under långa perioder (upp till 24 h) under optimerade in vitro-förhållanden, vilket gör dem lämpliga och effektiva modeller för vätskeutsöndringsmätning. Insekter har öppna cirkulationssystem, så MTs dissekeras lätt och avlägsnas eftersom de vanligtvis flyter fritt i hemolymph6. Dessutom, med undantag för bladlöss - som saknar MTs11 - kan antalet MTs i en viss insektsart variera avsevärt från fyra till hundratals (fem i Aedes myggor) vilket möjliggör flera mätningar från en insekt.
MTs i Aedes myggor, i likhet med andra endopterygote insekter, består av två celltyper som bildar ett enkelt epitel2,12; stora huvudceller, som underlättar aktiv transport av katjoner (dvs. Na+ och K+) till lumen, och tunna stellatceller, vilket hjälper till vid transepithelial Cl-utsöndring13. MTs är inte innervated2, och regleras istället av flera hormoner inklusive både diuretiska och anti-diuretiska faktorer, vilket möjliggör kontroll av jontransport (främst Na +, K+, och Cl-) och osmotiskt skyldigt vatten2. Många studier har undersökt hormonella regleringen av Aedes MTs för att förstå betydelsen av endokrina faktorer på transepithelial transport14,15,16,17,18. Som framgår av de representativa resultaten visar protokollen häri effekterna av olika hormonella faktorer på isolerade MTs från vuxna kvinnliga A. aegypti myggor, inklusive både diuretisk och anti-diuretisk kontroll (figur 1). Ramsay-analysen används för att visa hur ett anti-diuretiskt hormon, AedaeCAPA-1, hämmar vätskeutsöndring av MTs stimuleras av diuretiskt hormon 31 (DH31) (figur 1).
Den mindre storleken på insekter har krävt utveckling av mikrometoder för att mäta jonisk aktivitet och koncentrationer i vätskeprover, eller nära ytan av isolerade vävnader som MTs och tarm. Olika metoder har implementerats, inklusive användning av radioisotoper av joner19, vilket kräver insamling av de utsöndrade vätskedropparna för mätning av jonkoncentrationer20. Stimulerade Aedes tubules in vitro utsöndrar vanligtvis ~ 0,5 nL / min21, vilket innebär att hantering av sådana små volymer kan utgöra en utmaning och potentiellt införa fel vid överföring. Till följd av detta har jonselektiva mikroelektroder (ISMEs) använts i stor utsträckning för att mäta jonkoncentrationer i utsöndrade droppar av MTs in vitro. I denna metod placeras en referenselektrod och ISME, fylld med lämplig återfyllningslösning och jonofor, i den utsöndrade urindroppen för att bestämma jonkoncentrationer22. Anpassat från Donini och kollegor23, använder detta nuvarande protokoll en Na + selektiv jonofor för att mäta jonaktivitet i utsöndrade droppar från stimulerade MTs hos vuxna Aedes myggor. Eftersom jonselektiva mikroelektroder mäter jonaktivitet kan dessa data uttryckas som jonkoncentrationer efter antagandet att kalibreringslösningarna och försöksproverna har samma jonaktivitetskoefficient21 (figur 1B,C).
Scanning Jonselektiv elektrodteknik (SIET) använder också ISMEs för att mäta jonkoncentrationsgradienter i det ofeldade skiktet intill organ, vävnader eller celler som transporterar joner. ISMEs mäter spänningsgradienter som sedan kan användas för att beräkna jonkoncentrationens gradienter och jonflödets riktning och storlek över organet, vävnaden eller cellen20. I denna teknik är ISME monterad på en manipulator med tre axlar som styrs av datoriserade mikrostegmotorer så att dess 3D-position styrs till mikrometernivån20. Spänningar mäts på två punkter i det oförtred skiktet med hjälp av ett provtagningsprotokoll som är programmerat till och styrt av datorprogramvara. De två punkterna separeras vanligtvis med ett avstånd på 20–100 μm med en punkt inom 5–10 μm från ytan på organet, vävnaden eller cellen och den andra punkten ytterligare 20–100 μm bort. Skillnaden i spänningsstorlek mellan de två punkterna beräknas för att erhålla en spänningsgradient24,25,26, som sedan används för att beräkna koncentrationsgradienten och därefter nettoflödet med ficks lag24,27. Denna metod är användbar för att bedöma transport av specifika joner över olika regioner i insektsmagen och MTs, eller vid specifika tidpunkter efter blodmjöl eller behandlingsexponering. Till exempel kan SIET användas för att förstå hur absorptiv och sekretoriska processer i myggsöndringssystemet regleras av hormoner28 samt olika utfodringsbeteenden och uppfödningsförhållanden25. Tidigare arbete med hjälp av SIET avslöjade platser som är involverade i jontransport längs analpapillen och ändtarmen av larval och vuxna myggor24,28. Det nuvarande protokollet, som tidigare beskrivits av Paluzzi och kollegor26, mäter Na+ fluss över rektal pad epithelia för den vuxna kvinnliga ändtarmen (figur 2).
Det sista segmentet av myggutsöndringssystemet kräver samordnad muskelrörelse för att hjälpa till att blanda mat och utsöndra avfall26. Icke-absorberbara produkter av matsmältningen från midgut, tillsammans med primär urin som utsöndras av MTs, passerar genom pylorisk ventil och levereras till bakgut2. Spontana hindgut sammandragningar börjar vid pyloric ventilen och förekommer i peristaltiska vågor, som vidarebefordras över ileum genom samordnad sammandragning av cirkulära och längsgående muskler som omger den basala ytan av epitelceller26. Slutligen hjälper musklerna i ändtarmen till att driva och eliminera avfall genom analkanalen. Även om insekt hindgut motility är myogena, kräver extracellulär Ca2 + för att producera spontana sammandragningar, kan dessa processer också regleras neuronally26,29,30. Denna exogena reglering av nervsystemet är viktig efter utfodring, eftersom djuret måste utvisa avfall från tarmen och återställa hemolymfbalansen31. Som ett resultat, utföra in vitro bioassays för att identifiera myostimulatory eller myoinhibitory neuropeptides är användbart för att bedöma hur neurokemikalier påverkar hindgut motility. Det nuvarande protokollet, som utförs av Lajevardi och Paluzzi28, använder videoinspelningar för att undersöka ileal motilitet som svar på neuropeptider (figur 3). På samma sätt kan en kraftgivare eller impedansomvandlare också användas för att observera spår av sammandragningar genom en programvara för datainsamling32,33. Men med hjälp av videoteknik kan vi visuellt bedöma organet och ytterligare analysera med hjälp av en delmängd parametrar för att identifiera hormonernas roll på hindgutmotilitet.
Att använda dessa tekniker kan hjälpa till att karakterisera faktorer som reglerar och samordnar vätske- och jontransport längs utsöndringssystemet tillsammans med hindgutmotilitet. Viktigt är att en funktionell koppling mellan det diuretiska svaret från MTs och hindgut motility stöds, eftersom diuretiska hormoner, såsom DH31 och 5HT, kännetecknas av deras förmåga att stimulera vätskeutsöndring av MTs, har också visat sig uppvisa myotropa åtgärder längs mygga hindgut21,34,35 . Dessa resultat belyser vikten av strikt samordning mellan MTs och hindgut under händelser såsom post-prandial diuresis i insekter som kräver snabb avfall eliminering.
Häri beskrivs det detaljerade tillvägagångssättet bakom Ramsay-analystekniken för att mäta vätskeutsöndringshastigheten i myggan, A. aegypti, och användningen av jonselektiva mikroelektroder för att bestämma Na + koncentrationer inom den utsöndrade vätskan i MTs, vilket när de kombineras gör det möjligt att fastställa transepithelial jontransporthastigheter. Dessutom beskrivs scanning jonselektiv elektrodteknik och hindgutkontraktionsanalyser för att mäta jonflöde respektive motilitet, vilket hjälper till att klargöra hormonell reglering av bakguten (figur 4).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

Studier av insektsfysiologi, särskilt i de arter som är vektorer av patogener som orsakar sjukdom hos människor och andra ryggradsdjur, ger grunden för att utveckla nya strategier för skadedjursbekämpning. Här beskrivs en serie metoder som rutinmässigt används för att bestämma de funktionella rollerna för neuropeptider och andra neuronala faktorer (dvs. biogena aminer) på myggans utsöndringssystem, Aedes aegypti. Malpighian tubules (MTs), som ansvarar för primär urinbildning, kan fortsätta att fungera i timmar när de avlägsnas från myggan, vilket möjliggör vätskeutsöndringsmätningar efter hormonbehandlingar. Ramsay-analysen är därför en användbar teknik för att mäta utsöndringshastigheter från isolerade MTs. Jonselektiva mikroelektroder (ISME) kan sekventiellt användas för att mäta jonkoncentrationer (dvs. Na+ och K+) i den utsöndrade vätskan. Denna analys möjliggör mätning av flera MTs vid en given tidpunkt, bestämma effekterna av olika hormoner och läkemedel. Scanning jonselektiv elektrodteknik använder ISME för att mäta spännings representativ för jonisk aktivitet i det oförändrat skiktet intill ytan av jontransportande organ för att bestämma transepithelial transport av joner i nära realtid. Denna metod kan användas för att förstå rollen av hormoner och andra regulatorer på jonabsorption eller utsöndring över epitel. Hindgut kontraktionsanalyser är också ett användbart verktyg för att karakterisera myoaktiva neuropeptider, som kan förbättra eller minska detta organs förmåga att ta bort överskott av vätska och avfall. Sammantaget ger dessa metoder insikt i hur utsöndringssystemet regleras hos vuxna myggor. Detta är viktigt eftersom funktionell samordning av utsöndringsorganen är avgörande för att övervinna utmaningar som uttorkning stress efter eklosion och innan du hittar en lämplig ryggradsdjur värd för att få ett blodsocker.

Tillämpning av DH31 mot ostimulerade MTs resulterar i en betydande ökning av vätskesekrendehastigheten, vilket bekräftar dess roll som ett diuretiskt hormon i Aedes myggor (figur 1A). När tubuler behandlas med AedaeCAPA-1 observeras en minskning av utsöndringshastigheten i DH31-stimulerade MTs. Figur 1B visar användningen av jonselektiva elektroder för att mäta Na+ koncentrationer i de utsöndrade dropp...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Detta protokoll beskriver metoder bakom Ramsay-analysen, jonselektiva mikroelektroder, scanning jonselektiv elektrodteknik (SIET) och in vitro-kontraktionsanalyser, som tillämpas för att studera det vuxna myggutsöndringssystemet, bestående av malpighiska tubuler och hindgut, för att kollektivt mäta jon- och vätskeutsöndringshastigheter, kontraktil aktivitet och transepithelial jontransport.

Studera aktiviteten hos Neuropeptider och andra tillsynsmyndigheter i utsöndringssystemet hos den vuxna myggan

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Detta protokoll beskriver tekniker som kan användas av smådjur fysiologer för att klargöra rollen av neuropeptider och andra hormonella faktorer som reglerar matsmältningssystemet och eller utsöndringssystemet. Dessa tekniker möjliggör mätningar av biologiska prover av mikrostorlek som annars inte skulle vara möjliga med hjälp av tekniker som utformats speciellt för större djurmodeller, till exempel gnagare och teleus. Denna metod kan ge insikt i tarmens endokrina reglering, inklusive transport av epitelial, liksom glatta muskler associerade med mag-tarmkanalen i insekter och i liknande storlek icke-insektsarter.Farwa Sajadi, doktorand från mitt laboratorium, demonstrerar insektsrenalrörsprocedurerna. Dessutom kommer en före detta doktorand från mitt labb Aryan Lajevardi att demonstrera de hindgutfokuserade protokollen. Börja med att förbereda Ramsay och sammandragningsanalyser för experimenten.Använd pipetter och fyll brunnar med upp till 20 mikroliter lösning. För ostimulerade kontroller, fyll brunnarna med 20 mikroliter av Aedes saltlösning Schneiders medium. När alla brunnar är fyllda, häll hydratiserad mineralolja i analysrätten tills brunnarna och Minutien-stiften är nedsänkta.Efter nedsänkning av tubule i brunnen, plocka upp den proximala änden av tubule med tång, ta bort den från baddroppen och linda änden runt stiftet. Linda tubule runt stiftet två gånger och håll längden på tubule kvar i baddroppen överensstämmer med de andra tubules. För att göra en natriumselektiv mikroelektrod, använd en en milliliter spruta för att fylla elektroden med 100 millimolar natriumklorid.Se till att återfyllningslösningen fylls tills elektrodens spets. Om luftbubblor uppstår, snärta försiktigt mikroelektroden eller ta bort lösningen och fyll på. Doppa en 10 mikroliter pipettspets i den natriumselektiva jonoforlösningen.Rada upp elektroden vinkelrätt mot pipetten, placera sedan ett handske finger över botten av spetsen för att skapa tryck och utvisa en liten droppe jonofor. Rör försiktigt jonoforen till mikroelektrodspetsen och se till att inte bryta den. Fyll en liten bägare halvvägs med 100 millimolar natriumklorid och placera lite modelleringslera på insidan högst upp på bägaren.När jonoforen har tagits upp, placera elektrodspetsen ner på bägarens vägg och låt spetsarna i natriumkloriden. Håll ISME i bägaren tills den är klar att användas. För att göra ISME-referenselektroden, fyll i en elektrod med 500 millimolar kaliumklorid och förvara den i en bägare.Täck elektrodspetsarna med en lösning på cirka 3,5% polyvinylklorid, upplöst i tetrahydrofuran, för att undvika förskjutning av jonoforen när den är nedsänkt i paraffinolja. För att kalibrera natriumelektroden, placera 10 mikroliter droppar natriumkloridstandardkoncentrationer på kanten av Ramsey-skålen med de inkuberade malpighiska tubulerna. Placera standarddropparna två centimeter ifrån varandra med den högre koncentrationen ovanpå.För in både referenselektroden och jonelektiv elektrod över kloridsilvertrådarna och fäst dem säkert med hjälp av elektrodhållare som är fästa vid mikromanipulatorer. Navigera båda elektroderna mot den 200 millimolära natriumkloriddropleten med hjälp av mikromanipulatorerna, så att elektrospetsarna inte vidrör botten av skålen. Slå på elektrometern för att börja spela in och låt avläsningen stabiliseras.Spela in läsningen och fortsätt till nästa standard. Efter att ha förvärvat mätningar av vätskesekreationen, flytta försiktigt referens- och jonselektiva elektroder till den utsöndrade droppen med hjälp av mikromanipulatörerna. Slå på inspelningen och låt avläsningen stabiliseras och spela sedan in.Slå på IPA-2 Jon/Polarografisk förstärkare, ljusmikroskopet och datorerna. Placera natriumselektiv mikroelektrod på en hållare som består av en silverkloridtråd och fäst den i honkontaktuttaget. Ta bort en referenselektrod från bägaren med kaliumkloriden, placera ett finger i ena änden och luta glaskapillären mot detta finger för att förhindra att agaren faller ut.Placera försiktigt ena änden i hållaren och se till att inga bubblor bildas. Om det finns en bubbla, ta bort referenselektroden, fyll på hållaren med tre molar kaliumklorid och upprepa. Placera elektrodhållaren i honkontaktuttaget.Efter kalibrering dissekerar du organet. Placera poly-L-lysinformen med det dissekerade provet på mikroskopstadiet och sätt in spetsen på referenselektroden inuti saltlinjen. Sänk ner spetsen på jonselektiv mikroelektrod i saltlinjen och var försiktig så att du inte bryter spetsen.Använd de manuella justeringsknapparna för att justera mikroelektrodpositionen medan du tittar under ljusmikroskopet. Justera mikroelektrodens vertikala position så att spetsen är på samma plan som organet eller vävnaden och vrid sedan motoromkopplaren för att aktivera. Använd datorpiltangenterna och flytta mikroelektroden horisontellt till en position tre millimeter från vävnaden för att mäta bakgrundsinspelningar.När du är klar, börja spela in genom att trycka på F5, få fem mätningar av bakgrundsaktiviteten. Flytta mikroelektrodspetsen nära vävnaden och var försiktig och var försiktig och genomborra inte organet. Minska nyckelträffkänsligheten för att placera mikroelektrodspetsen två mikrometer direkt till höger, vinkelrätt mot vävnaden.Skaffa tre inspelningar på plats längs rektalplattan för att identifiera platsen för den största jonaktiviteten och få sedan baslinjemätningar av koksaltlösning på den plats som visar störst aktivitet. För att spela in hindgutkontraktioner, fyll en av brunnarna i skålen med en känd volym Aedes saltlösning. Efter dissekering överför du försiktigt den dissekerade bakguten fäst vid mitten av tarmen till en brunn i en annan maträtt och se till att inte nypa ileum.Sänk ner tarmen i saltlösning inuti brunnen och placera Minutien-stift i mitten av tarmen och ändtarmen. Ileum bör inte vara under spänning och spontana sammandragningar med ursprung vid pyloriska ventilen vid det främre ileum bör observeras. Anslut videokameran till det stereoskopiska mikroskopet.Placera sedan skålen som innehåller det dissekerade organet under mikroskopet och spela in en video i två minuter. Tillämpning av DH31 mot ostimulerade Malpighian tubules resulterar i en betydande ökning av vätskor utsöndringshastighet, bekräftar dess roll som ett diuretiskt hormon i Aedes myggor. När tubuler behandlas med AedaeCAPA-1 observeras en minskning av utsöndringshastigheten i DH31 stimulerade malpighiska tubules.Jon selektiva elektroder användes för att mäta natriumkoncentrationer i de utsöndrade dropparna. Behandling av DH31 på MTs hade ingen effekt på natriumkoncentrationen i den utsöndrade droppen. Med tillämpning av AedaeCAPA-1 ökades natriumkoncentrationen i den utsöndrade vätskan dock avsevärt.Dessutom, jämfört med ostimulerade kontroller, DH31 ledde till en betydligt högre natrium transport hastighet, medan AedaeCAPA-1 avskaffade denna ökning av DH31 stimulerade tubules. SIET användes för att bedöma förändringar i natriumtransport längs rektal pad epitelial av vuxna kvinnliga myggor. En leucokinin analog användes för att undersöka förändringar i natrium absorption, vilket resulterade i en fyrfaldig minskning av natrium absorption jämfört med saltlösning kontroll.För att bedöma rollen av en neuropeptide pyrokinin2 på ileal motility, en Rhodnius prolixus analog användes, som tidigare visat sig aktivera A.aegypti PK2 receptorn berikad i myggan ileum. I förhållande till utgångsnivåerna hämmar PK2 signifikant ileala sammandragningar. När du utför en Ramsay-analys med malpighiska tubuler och mäter jon- eller vätskeutsöndringshastigheter är det absolut nödvändigt att tubuler inte skadas under dissekering eller under överföringen till analys skålen.Efter Ramsay-analysen kan specifika membrantransportörer riktas antingen farmakologiskt eller molekylärt med hjälp av omvänd genetisk teknik för att urskilja deras specifika bidrag till transepithelial transport av löstor i det enkla epitelet.

Research

JoVE Journal

Biology

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneal injektion i vuxen Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabil Isotopic Profilering av förmedlande Metabola Flux i utvecklingsländer och vuxna Stage Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gör-det-själv Device för återhämtning av kryokonserverade prover Tappade misstag i Kryogena Lagringstankar

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging vuxna zebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

En experimentell och bioinformatik Protokoll för RNA-seq Analyser av fotoperiodisk diapaus i den asiatiska tigern Mosquito,<em&gt; Asiatisk tigermygga</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fysiologiska Inspelningar och RNA sekvensering av de smak bihang till Gula-febern Mosquito<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Mätning av Larvernas aktivitet i<em&gt; Drosophila</em&gt; Aktivitetskontroll

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Avbildning Rumslig Reorganisation av ett MAPK-signalvägen Använda Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Ett BW Reporter System för att studera Receptor-Ligand interaktioner

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...