Name: studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Bu araştırma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Discovery Grants tarafından AD ve J-PP'ye finanse edildi. AL ve FS, lisansüstü araştırmalarını desteklemek için NSERC CGS-M ödülleri aldı.

1. Silikon kaplı yemekler yapmak
NOT: Bu adım denemelerden önce yapılmalıdır. Bu yemekler, diseksiyonlar için ve kasılma tahlil deneyleri için tahlil yemeği hazırlamak için yapılacaktır.
<ol><li>Silikonu, üreticinin önerilerine uyarak silikon bir elastomer kiti kullanarak hazırlayın. İki parçalı sıvı bileşenleri 10 ila 1 oranında karıştırın. Ters çevirerek hafifçe ve iyice karıştırın, ancak kabarcık oluşumunu en aza indirdiğinden emin olun.</li>
	<li>Sil...

Bir kan unu yutarken, hematophagus böcekleri hemolimflerinde aşırı solut ve su zorluğuyla karşı karşıya kalır2. Bununla başa çıkmak için, hormonal faktörler tarafından sıkı bir şekilde kontrol edilen ve böceklerin prandial diürezi hızla başlatmasına izin veren özel bir boşaltım sistemine sahiptirler. Ramsay tahlilleri ve iyon seçici mikroelekrodların kullanımı, izole edilmiş böcek MT'lerindeki iyon konsantrasyonları ve taşıma oranları ile birlikte sıvı salgı...

Böceklerde tuz ve su seviyelerinin korunması, çeşitli beslenme stratejilerinden yararlanarak birçok ekolojik ve çevresel nişte başarılı olmalarını sağlar1. Çoğu böcek, kendi çevreleriyle ilgili farklı zorluklara dayanmak için hemolimflerinin bileşimini dar sınırlar içinde düzenlemek için mekanizmalar geliştirmişdir2. Karasal böcekler genellikle su tasarrufu zorluğu ile karşı karşıyadır ve boşaltım sistemi su kaybını ve bazı temel tuzları önlemek için anti-diürez geçirir, bu nedenle desiccation kaçınır. Buna karşılık, diürezi böcek beslendiğinde ve fazla su ve potansiyel olarak tuzlarla mücadele edildiğinde ortaya çıkar3,4. Özel ve son derece aktif boşaltım sistemleri sayesinde, böcekler osmoregulatory zorluklarına karşı koymak için hareket eden düzenleyici mekanizmalar geliştirmişlerdir. Yetişkin Aedes aegypti sivrisineklerinde, boşaltım sistemi Malpighian tübüllerinden (MTs) ve arkadan oluşur, ikincisi ön ileum ve posterior rektumdan oluşur5. MT'ler, genellikle NaCl ve/veya KCl bakımından zengin olan birincil idrar üretmektir. Birincil idrar daha sonra tübülün aşağı doğru ilerlerken ve arka kapıya girerken salgı ve reabsorptive süreçlerle değiştirilir5. Son atılım, beslenme/ çevre koşullarına bağlı olarak hemolimf için hiper veya hiposmotik olabilir ve toksik ve azotlu atıklarda zenginleştirilir2.
MTs, çok çeşitli taşıma ve boşaltım işlevlerini yerine getirmeleri nedeniyle epitel sıvısı ve çözünür taşımacılığın birçok özelliği üzerinde çalışmak için idealdir2,6. Hormonal düzenleme2 aracılığıyla, MTs, kandan tübül lümen7'ye iyonlar ve diğer solutlar salgılayarak işlev görür ve suyun, reabsorptive hindgut2'ye doğru seyahat etmeden önce, toplu olarak birincil idrarı oluşturan aquaporins8,9 tarafından taşınmasına izin veren ozmotik bir gradyan sağlar2. Böylece, salgılanan sıvıyı izole edilmiş MT'lerden toplayarak, sıvı ve iyonların transepithelial naklini sürekli olarak izleyebilirsiniz. Salgı oranının ve idrar bileşiminin ölçülmesi, transepithelial iyon ve sıvı taşınımından sorumlu mekanizmalar hakkında fikir sağlar. Sıvı salgılama oranlarını incelemek için popüler bir yöntem, ilk kez Ramsay tarafından 195310'da tanıtılan Ramsay tahlildir. Bu yöntemde, tübüllerin distal (kapalı) ucu bir hormon (veya başka bir test bileşiği / ilacı) ile tedavi edilirken, proksimal (açık) uç, birincil idrarı salgılayan, pimin ucunda bir damlacık olarak biriken su doymuş parafin yağını bir pimin etrafına sarılır. İzole MT'ler, optimize edilmiş in vitro koşullar altında uzun süre (24 saate kadar) hayatta kalabilir ve çalışabilir, bu da onları sıvı salgısı ölçümü için uygun ve verimli modeller haline getirir. Böcekler açık dolaşım sistemlerine sahiptir, bu nedenle MT'ler genellikle hemolimf6'da serbestçe yüzdükleri için kolayca parçalara çıkarılır ve çıkarılır. Ek olarak, MTs11'den yoksun yaprak bitleri hariç, belirli bir böcek türündeki MT sayısı, bir böcekten birden fazla ölçüme izin veren dört ila yüzlerce (Aedes sivrisineklerinde beş) arasında önemli ölçüde değişebilir.
Aedes sivrisineklerindeki MT'ler, diğer endopterygot böcekleri ile ortak olarak, basit bir epitel oluşturan iki hücre türünden oluşur2,12; Lümene cations (na+ ve K+) aktif naklini kolaylaştıran büyük ana hücreler ve transepithelial Cl-secretion13'e yardımcı olan ince yıldız hücreleri. MT'ler innervated2 değildir ve bunun yerine hem idrar söktürücü hem de anti-diüretik faktörler de dahil olmak üzere çeşitli hormonlar tarafından düzenlenir, iyon taşımacılığının (özellikle Na+, K + ve Cl-) ve osmotik olarak zorunlu suyun kontrolüne izin verir2. Çok sayıda çalışma, endokrin faktörlerin transepithelial transport14,15,16,17,18 üzerindeki rolünü anlamak için Aedes MTs'nin hormonal düzenlemesini incelemıştır. Temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, buradaki protokoller, hem diüretik hem de anti-diüretik kontrol de dahil olmak üzere yetişkin dişi A. aegypti sivrisineklerinden izole EDILMIŞ MT'ler üzerindeki farklı hormonal faktörlerin etkilerini göstermektedir (Şekil 1). Ramsay tahlili, anti-diüretik hormon olan AedaeCAPA-1'in diüretik hormon 31 (DH31) tarafından uyarılan MT'lerin sıvı salgısını nasıl inhibe ettiğini göstermek için kullanılır (Şekil 1).
Böceklerin daha küçük boyutu, sıvı örneklerindeki iyonik aktiviteyi ve konsantrasyonları ölçmek için veya MT'ler ve bağırsak gibi izole dokuların yüzeyine yakın mikro yöntemlerin geliştirilmesini gerektirmektedir. İyon konsantrasyonlarının ölçümü için salgılanan sıvı damlalarının toplanmasını gerektiren iyon19 radyoisotoplarının kullanımı da dahil olmak üzere çeşitli yöntemler uygulanmıştır20. Uyarılmış Aedes tübülleri in vitro tipik olarak ~0.5 nL/ min21 salgılar, bu nedenle bu tür küçük hacimlerin işlenmesi bir zorluk oluşturabilir ve transfer sırasında potansiyel olarak hata verebilir. Sonuç olarak, iyon seçici mikroelekrodlar (ISME'ler), tüp bebek olarak salgılanan MT damlacıklarındaki iyon konsantrasyonlarını ölçmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu yöntemde, uygun dolgu çözeltisi ve iyonofor ile dolu bir referans elektrot ve ISME, iyon konsantrasyonlarını belirlemek için salgılanan idrar damlacıklarına konumlandırılmıştır22. Donini ve meslektaşlarından uyarlanmış23, bu mevcut protokol, yetişkin Aedes sivrisineklerinde uyarılmış MTs'den salgılanan damlacıklardaki iyon aktivitesini ölçmek için Na+seçici bir iyonofor kullanır. İyon seçici mikroelekrodlar iyon aktivitesini ölçttüklerinden, bu veriler kalibrasyon çözeltilerinin ve deneysel numunelerin aynı iyon aktivite katsayısını21 paylaştığı varsayımını takiben iyon konsantrasyonları olarak ifade edilebilir (Şekil 1B,C).
Tarama İyon seçici Elektrot Tekniği (SIET), iyonları taşıyan organlara, dokulara veya hücrelere bitişik bozulmamış katmandaki iyon konsantrasyon gradyanlarını ölçmek için ISME'lerden de yararlanır. ISME'ler, daha sonra iyon konsantrasyon gradyanlarını ve organ, doku veya hücredeki iyon akısının yönünü ve büyüklüğünü hesaplamak için kullanılabilecek voltaj gradyanlarını ölçer20. Bu teknikte, ISME, bilgisayarlı mikro-step motorlar tarafından kontrol edilen üç eksenli bir manipülatöre monte edilir, böylece 3B konumu mikrometre seviyesine kontrol edilir20. Gerilimler, bilgisayar yazılımı tarafından programlanmış ve kontrol edilen bir örnekleme protokolü kullanılarak karıştırılmamış katman içinde iki noktada ölçülür. İki nokta tipik olarak 20-100 μm'lik bir mesafe ile ayrılır ve organ, doku veya hücrenin yüzeyinin 5-10 μm içinde bir nokta ve ikinci nokta 20-100 μm daha uzaktadır. İki nokta arasındaki gerilimlerin büyüklüğü farkı, daha sonra Fick Yasası24,27 kullanılarak konsantrasyon gradyanını ve daha sonra net akıyı hesaplamak için kullanılan bir voltaj gradyanı24,25,26 elde etmek için hesaplanır. Bu yöntem, belirli iyonların böcek bağırsağı ve MT'lerin farklı bölgelerinde veya kan metrini veya tedavi maruziyetini takiben belirli zaman noktalarında taşınmasını değerlendirmek için yararlıdır. Örneğin, SIET, sivrisinek boşaltım sistemindeki emilimsel ve salgı süreçlerinin hormonlar28'in yanı sıra farklı beslenme davranışları ve yetiştirme koşulları25 tarafından nasıl düzenlendiğini anlamak için kullanılabilir. SIET'i kullanan önceki çalışmalar, larva ve yetişkin sivrisineklerin anal papilla ve rektum boyunca iyon taşımacılığında yer alan alanları ortaya çıkardı24,28. Paluzzi ve meslektaşları26 tarafından daha önce açıklanan mevcut protokol, yetişkin kadın rektumunun rektal ped epitelinde Na+ akısını ölçer (Şekil 2).
Sivrisinek boşaltım sisteminin son bölümü, yiyecekleri karıştırmaya ve atık salgılaya yardımcı olmak için koordineli kas hareketi gerektirir26. Midguttan emilemeyen sindirim ürünleri, MTs tarafından salgılanan birincil idrarla birlikte, pilorik kapaktan geçirilir ve arka cama teslim edilir2. Spontan arka kapak kasılmaları pilorik kapakta başlar ve epitel hücrelerinin bazal yüzeyini çevreleyen dairesel ve boyuna kasların koordineli kasılması yoluyla ileum üzerinden aktarılan peristaltik dalgalarda meydana gelir26. Son olarak, rektum içindeki kaslar anal kanaldan atıkların itmeye ve ortadan kaldırılmasına yardımcı olur. Böcek arkagözü hareketliliği miyojenik olmasına rağmen, spontan kasılmalar üretmek için hücre dışı Ca2+ gerektirse de, bu süreçler nöronally olarak da düzenlenebilir26,29,30. Sinir sistemi tarafından yapılan bu eksojen düzenleme, beslenmeden sonra önemlidir, çünkü hayvanın atıkları bağırsaktan atmalı ve hemolimf dengesini geri kazanmalıdır31. Sonuç olarak, miyostimülatör veya miyoinhibitory nöropeptidleri tanımlamak için in vitro biyoassayların gerçekleştirilmesi, nörokimyasalların hindgut hareketliliğini nasıl etkilediğini değerlendirmede yararlıdır. Lajevardi ve Paluzzi28 tarafından gerçekleştirilen mevcut protokol, nöropeptitlere yanıt olarak ileal hareketliliği incelemek için video kayıtlarını kullanır (Şekil 3). Benzer şekilde, bir veri toplama yazılımı aracılığıyla kasılma izlerini gözlemlemek için bir kuvvet dönüştürücüsü veya empedans dönüştürücüsü de kullanılabilir32,33. Bununla birlikte, video teknolojisini kullanmak, organı görsel olarak değerlendirmemize ve hormonların arka motilite üzerindeki rolünü tanımlamak için bir parametre alt kümesi kullanarak daha fazla analiz etmemize izin verir.
Bu tekniklerin kullanılması, boşaltım sistemi boyunca sıvı ve iyon taşımacılığını düzenleyen ve koordine eden faktörlerin ve arka cam hareketliliğinin karakterize edilmesine yardımcı olabilir. Daha da önemlisi, MTs tarafından diüretik yanıt ve hindgut hareketliliği arasında fonksiyonel bir bağlantı desteklenir, çünkü DH31 ve 5HT gibi diüretik hormonlar, MTs tarafından sıvı salgısını uyarma yetenekleri ile karakterizedir, ayrıca sivrisinek arkagözü boyunca miyotropik eylemler sergilediği bulunmuştur21,34,35 . Bu bulgular, hızlı atık eliminasyonu gerektiren böceklerde post-prandial diürezi gibi olaylar sırasında MTs ve hindgut arasındaki sıkı koordinasyonun önemini vurgulamaktadır.
Burada, sivrisinekteki sıvı salgı oranını ölçmek için Ramsay tahlil tekniğinin arkasındaki ayrıntılı yaklaşım, A. aegypti ve MTs'nin salgılanan sıvısı içindeki Na+ konsantrasyonlarını belirlemek için iyon seçici mikroelektodların kullanımı açıklanmıştır, bu da birleştirildiğinde transepithelial iyon taşıma oranlarının belirlenmesine izin verir. Ek olarak, Tarama İyon seçici Elektrot Tekniği ve hindgut kasılma tahlilleri, sırasıyla iyon akısını ve hareketliliği ölçmek için tanımlanmıştır, bu da arkagının hormonal regülasyonunu hafifletmeye yardımcı olur (Şekil 4).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td>
			<td>C351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>used for ISME reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary filamented tubes 
			(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B200F-4</td>
			<td>used for SIET reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary unfilamented tubes 
			(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>used for ISME and SIET electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Diamed</td>
			<td>GEN59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyltrimethylsilylamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Can be fabricated by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-748A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrated mineral oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INFINITY1-2CB video camera</td>
			<td>Luminera</td>
			<td>INFINITY1-2CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators (left and right handed)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MMJL and MMJR</td>
			<td>Specific brand is not important so long as high quality manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0121-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1 mm stainless steel)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-hardening modeling clay</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td></td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus light microscope (FOR SIET)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>customized system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur (transfer) pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-005-M</td>
			<td>84 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIET system</td>
			<td>Applicable Electronics</td>
			<td>customized system</td>
			<td>Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>AGW1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II cocktail A</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>99357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard polystyrene Petri (culture) dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012921</td>
			<td>Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with ocular micrometer</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FGPN7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR advanced hotplate stirrer - aluminum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9578</td>
			<td>Specific brand is not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito

Böcek fizyolojisi çalışmaları, özellikle insanlarda ve diğer omurgalılarda hastalığa neden olan patojenlerin vektörleri olan türlerde, haşere kontrolü için yeni stratejiler geliştirmek için temel sağlar. Burada, nöropeptitlerin ve diğer nöronal faktörlerin (yani biyojenik aminlerin) sivrisinek, Aedes aegypti'nin boşaltım sistemindeki fonksiyonel rollerini belirlemek için rutin olarak kullanılan bir dizi yöntem açıklanmaktadır. Birincil idrar oluşumundan sorumlu malpighian tübülleri (MTs), sivrisinekten çıkarıldığında saatlerce çalışmaya devam edebilir ve hormon tedavilerini takiben sıvı salgısı ölçümlerine izin verebilir. Bu nedenle, Ramsay tahlili izole MTs'den salgı oranlarını ölçmek için yararlı bir tekniktir. İyon seçici mikroelekrodlar (ISME), salgılanan sıvıdaki iyon konsantrasyonlarını (yani Na+ ve K+) ölçmek için ardışık olarak kullanılabilir. Bu tahlil, çeşitli hormonların ve ilaçların etkilerini belirleyerek belirli bir zamanda birkaç MT'nin ölçülecekliğine izin verir. Tarama İyon seçici Elektrot Tekniği, iyonların neredeyse gerçek zamanlı olarak transepithelial taşınmasını belirlemek için iyon taşıma organlarının yüzeyine bitişik bozulmamış tabakadaki iyonik aktivitenin voltaj temsilcisini ölçmek için ISME kullanır. Bu yöntem, hormonların ve diğer düzenleyicilerin epitel boyunca iyon emilimi veya salgılanması üzerindeki rolünü anlamak için kullanılabilir. Hindgut kasılma tahlilleri, bu organın fazla sıvı ve atıkları giderme yeteneğini artırabilecek veya azaltabilecek miyoaktif nöropeptidleri karakterize etmek için de yararlı bir araçtır. Toplu olarak, bu yöntemler boşaltım sisteminin yetişkin sivrisineklerde nasıl düzenlendiği hakkında fikir sağlar. Bu önemlidir, çünkü boşaltım organlarının fonksiyonel koordinasyonu, eklozyondan sonra ve kan metrini elde etmek için uygun bir omurgalı konakçı bulmadan önce desiccation stresi gibi zorlukların üstesinden gelmede çok önemlidir.

DH31'in uyarılmamış MTs'ye karşı uygulanması, akışkan salgılama oranında önemli bir artışa neden olur ve Aedes sivrisineklerinde idrar söktürücü hormon olarak rolünü doğrular (Şekil 1A). Tübüller AedaeCAPA-1 ile tedavi edildiğinde, DH31 uyarılmış MTs'de salgılama oranında bir azalma gözlenir. Şekil 1B, salgılanan damlacıklardaki Na+ konsantrasyonlarını ölçmek için iyon seçi...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito at JoVE.com

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Bu protokol, Ramsay tahlilinin arkasındaki metodolojileri, iyon seçici mikroelekrodları, Tarama İyon seçici Elektrot Tekniğini (SIET) ve in vitro kasılma testlerini özetlemektedir, Malpighian tübülleri ve arkalarından oluşan yetişkin sivrisinek boşaltım sistemini incelemek için uygulanan, iyon ve akışkan salgı oranlarını, kontinentil aktiviteyi ve transepithelial iyon taşımacılığını toplu olarak ölçmek için.

Yetişkin Sivrisinekte Nöropeptitlerin ve Boşaltım Sisteminin Diğer Düzenleyicilerinin Aktivitesinin Incelenmesi

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Bu protokol, küçük hayvan fizyologları tarafından sindirim ve boşaltım sistemini düzenleyen nöropeptidlerin ve diğer hormonal faktörlerin rolünü aydınlatmak için kullanılabilecek teknikleri açıklar. Bu teknikler, kemirgenler ve teleus da dahil olmak üzere daha büyük hayvan modelleri için özel olarak tasarlanmış teknikler kullanılarak mümkün olmayacak mikro boyutlu biyolojik örneklerin ölçülmesine izin verir. Bu yöntem, epitel taşıma da dahil olmak üzere bağırsak endokrin düzenlemesinin yanı sıra böceklerde ve benzer büyüklükteki böcek olmayan türlerde gastrointestinal sistemle ilişkili düz kas hakkında fikir verebilir.Böcek renal tubal prosedürlerini gösteren farwa Sajadi olacak, laboratuvarımdan bir doktora adayı. Ayrıca, laboratuvarımdan aryan Lajevardi'den eski bir yüksek lisans öğrencisi arka odaklı protokolleri gösterecek. Ramsay'i hazırlayarak başlayın ve daralma deneyler için yemekleri test eder.Pipet kullanın ve kuyuları 20 mikrolitreye kadar çözelti ile doldurun. Uyarılmamış kontroller için kuyuları 20 mikrolitre Aedes saline Schneider'ın ortamıyla doldurun. Tüm kuyular doldurulduktan sonra, kuyular ve Minutien pimleri suya gömülene kadar nemlendirilmiş mineral yağı test kabına dökün.Tübülleri kuyuya batırdıktan sonra, tübüllerin proksimal ucunun toparlama ile alın, banyo damlacığı çıkarın ve ucunun pimin etrafına sarın. Boruyu, banyo damlacığında kalan tübül uzunluğunu diğer tübüllerle tutarlı tutarak iki kez pimin etrafına sarın. Sodyum seçici bir mikroelektorit yapmak için, elektrodu 100 milimoler sodyum klorürle doldurmak için bir mililitre şırınga kullanın.Dolgu çözeltisinin elektrot ucuna kadar dolduğundan emin olun. Hava kabarcıkları ortaya çıkarsa, mikroelekrodu hafifçe hareket ettirin veya çözeltiyi çıkarın ve yeniden doldurun. Sodyum seçici iyonofor çözeltisine 10 mikroliter pipet ucu batırın.Elektrodu pipete dik olarak hizalayın, ardından basınç oluşturmak ve küçük bir damla iyonophore atmak için ucun altına eldivenli bir parmak yerleştirin. İyonofor damlasına mikroelektofit ucuna dikkatlice dokunun, kırılmamasını kesin. Küçük bir kabın yarısını 100 milimolar sodyum klorürle doldurun ve kabın üst kısmına bir miktar modelleme kili yerleştirin.İyonofor alındıktan sonra, elektrot ucunu kabın duvarına yerleştirin ve uçları sodyum klorür içinde bırakarak yerleştirin. İsME'yi kullanıma hazır olana kadar kabın içinde tutun. ISME referans elektrotunu yapmak için, bir elektrodu 500 milimolar potasyum klorürle doldurun ve bir beherde saklayın.Elektrot uçlarını, parafin yağına batırıldığında iyonoforenin yer değiştirmesini önlemek için tetrahidrofuranda çözünmüş yaklaşık% 3,5 polivinil klorür çözeltisi kullanarak kaplayın. Sodyum elektrodu kalibre etmek için, 10 mikroliter sodyum klorür standart konsantrasyonu damlacığını, kuluçkalanmış Malpighian tübülleri ile Ramsey çanağının kenarına yerleştirin. Standart damlacıkları iki santimetre arayla, üstüne daha yüksek konsantrasyonla yerleştirin.Klorür gümüş tellerinin üzerine hem referans elektrot hem de iyon seçici elektrot yerleştirin ve mikro manipülatörlere bağlı elektrot tutucuları kullanarak güvenli bir şekilde sabitleyin. Mikro manipülatörleri kullanarak her iki elektrodu da 200 milimolar sodyum klorür damlacığı doğru yönlendirin ve elektro uçların çanağın dibine dokunmamasını sağlayın. Kayda başlamak ve okumanın sabitlenmesine izin vermek için elektrometreyi açın.Okumayı kaydedin ve bir sonraki standarda devam edin. Sıvı salgılama oranının ölçümlerini aldıktan sonra, referans ve iyon seçici elektrotları mikro manipülatörleri kullanarak salgılanan damlacığa dikkatlice taşıyın. Kaydı açın ve okumanın sabitlenmesine izin verin, sonra kaydedin.IPA-2 İyon/Polarografik Amplifikatörü, ışık mikroskobu ve bilgisayarları açın. Sodyum seçici mikroelekrotu gümüş bir klorür telden oluşan bir tutucuya yerleştirin ve dişi konektör jakına takın. Potasyum klorür ile beherden bir referans elektrodu çıkarın, bir parmağınızı bir ucuna yerleştirin ve agarın düşmesini önlemek için cam kılcal damarı bu parmağa doğru yatırın.Bir ucunu tutucuya dikkatlice yerleştirin, kabarcık oluşmamasını sağlayın. Bir kabarcık varsa, referans elektrotu çıkarın, tutucuyu üç azı dişi potasyum klorürle yeniden doldurun ve tekrarlayın. Elektrot tutucuyu dişi konektör jakına yerleştirin.Kalibrasyondan sonra organı parçalara ayrıştırın. Poli-L-lizin çanağı, parçalanmış numune ile mikroskop aşamasına yerleştirin ve referans elektrodun ucunu salinin içine yerleştirin. İyon seçici mikroelekrod ucunu saline batırın, ucu kırmamaya dikkat edin.Işık mikroskobu altında bakarken mikroelekrod konumunu ayarlamak için manuel ayar düğmelerini kullanın. Mikroelekrod'un dikey konumunu, ucu organ veya dokuyla aynı düzlemde olacak şekilde ayarlayın, ardından motor anahtarını etkinleştirecek şekilde çevirin. Bilgisayar ok tuşlarını kullanarak, arka plan kayıtlarını ölçmek için mikroelekrodi yatay olarak dokudan üç milimetre uzağa taşıyın.Hazır olduğunuzda, F5 tuşuna basarak kayda başlayın, beş arka plan etkinliği ölçümü elde edin. Mikroelekrod ucunu organı delmemeye dikkat ederek dokuya yaklaştırın. Mikroelektrod ucunu dokuya dik, doğrudan sağa doğru iki mikrometre yerleştirmek için tuş isabet hassasiyetini azaltın.En büyük iyon aktivitesinin yerini belirlemek için rektal ped boyunca sahada üç kayıt elde edin, ardından en büyük aktiviteyi görüntüleyen sahada temel salin ölçümleri elde edin. Arkadaki kasılmaları kaydetmek için, yemekteki kuyulardan birini bilinen bir Aedes salin hacmi ile doldurun. Diseksiyondan sonra, orta bağırsağa bağlı parçalanmış arkalığı dikkatlice başka bir tabaktaki bir kuyuya aktarın ve ileumu çimdiklememeye dikkat edin.Bağırsakları kuyunun içindeki saline batırın ve Minutien pimlerini orta bağırsak ve rektum içine yerleştirin. İleum gerginlik altında olmamalıdır ve ön ileumdaki pilorik kapaktan kaynaklanan spontan kasılmalar gözlenmelidir. Video kamerayı stereoskopik mikroskopa bağlayın.Daha sonra parçalanmış organı içeren kabı mikroskop altına yerleştirin ve iki dakika boyunca bir video kaydedin. DH31'in uyarılmamış Malpighian tübüllerine karşı uygulanması, Aedes sivrisineklerinde idrar söktürücü hormon olarak rolünü doğrulayan sıvı salgılama oranında önemli bir artışa neden olur. Tübüller AedaeCAPA-1 ile tedavi edildiğinde, DH31 uyarılmış Malpighian tübüllerinde salgı oranında bir azalma gözlenir.Salgılanan damlacıklardaki sodyum konsantrasyonlarını ölçmek için iyon seçici elektrotlar kullanıldı. DH31'in MT'ler üzerinde tedavisinin salgılanan damlacıktaki sodyum konsantrasyonu üzerinde hiçbir etkisi olmadı. Bununla birlikte, AedaeCAPA-1 uygulaması ile salgılanan sıvıdaki sodyum konsantrasyonu önemli ölçüde artmıştır.Ek olarak, uyarılmamış kontrollerle karşılaştırıldığında, DH31 önemli ölçüde daha fazla sodyum taşıma oranına yol ken, AedaeCAPA-1 DH31'deki bu artışı kaldırmıştır. SIET, yetişkin dişi sivrisineklerin rektal ped epitel boyunca sodyum taşımacılığındaki değişiklikleri değerlendirmek için kullanıldı. Sodyum emiliminde yapılan değişiklikleri incelemek için bir lökokinin analog kullanıldı, bu da sodyum emiliminde salin kontrolüne kıyasla dört kat azalmaya neden oldu.Bir nöropeptid pyrokinin2'nin ileal hareketlilik üzerindeki rolünü değerlendirmek için, daha önce sivrisinek ileumda zenginleştirilmiş A.aegypti PK2 reseptörini aktive ettiği gösterilen bir Rhodnius prolixus analogu kullanıldı. Temel seviyelere göre, PK2 ileal kasılmaları önemli ölçüde inhibe eder. Malpighian tübülleri ile Ramsay tahlilini yaparken ve iyon veya sıvı salgılama oranlarını ölçerken, tübüllerin diseksiyon sırasında veya tahlil çanağına transfer sırasında zarar görmemesi zorunludur.Ramsay tahlilinin ardından, spesifik membran taşıyıcıları, basit epiteldeki solutların transepithelial taşınmasına özel katkılarını ayırt etmek için ters genetik teknikler kullanılarak farmakolojik veya moleküler olarak hedeflenebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

KRİYOPREZERVE Numune Kurtarma için Do-It-Yourself Aygıt yanlışlıkla Kriyojenik Depolama Tankları içine Dropped

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Gavaging Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fizyolojik Kayıtlar ve Sarı-ateş Sivrisinek Tat Çıkıntılara RNA Sıralama<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Larvaların Faaliyet Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Reseptör-Ligand etkileşimleri çalışmak için bir BW muhabir sistemi

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...