Name: automated gait analysis to assess functional recovery in rodents with peripheral nerve or spinal cord contusion injury
Uploaded: 2020-10-06T15:00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury at JoVE.com

De auteurs willen Karin Brenner bedanken voor haar gepassioneerde verzorging van de dieren. De auteurs willen ook Claudia Keibl, James Ferguson, Gabriele Leinfellner en Susanne Drechsler bedanken voor hun hulp tijdens de experimentele operaties.

De auteurs verklaren dat dit werk werd ondersteund door Noldus Inc door de dekking van de open access publicatie vergoeding. Geen van de auteurs ontving een persoonlijk salaris of enige vorm van financiële fooi. De auteurs hebben geen andere concurrerende belangen te verklaren.

De beoordeling van functioneel herstel in diermodellen van PNI en SCI blijft een uitdaging vanwege de grote verscheidenheid aan evaluatiemethoden, elk met individuele voor- en nadelen. Slechts weinig benaderingen zijn getest en gevalideerd in meerdere modellen van perifere en centrale zenuwverwondingen, hoewel veelbelovende nieuwe technieken die motion tracking en machine learning combineren neurogedragsonderzoek mogelijk naar het volgende niveau van functionele tests kunnen stuwen. Wij zijn ervan overtuigd dat geavanceerde methoden die breed toepasbaar zijn op een breed scala aan dier- en letselmodellen, binnenkort zullen opduiken. In het licht van deze overwegingen, een van de voordelen van AGA is de mogelijkheid om functioneel herstel te evalueren in meerdere modellen van zenuwletsel met behulp van slechts een apparaat. Sinds het begin van de jaren 2000 wordt deze aanpak gebruikt in experimentele modellen van PNI, zoals de heup37, peroneal38, en femorale zenuwletsel model22 evenals na wortel avulsie van zowel de lenden39 en de brachiale plexus40. Verschillende centrale zenuwletsels, waaronder ruggenmergkneuzing letsel zijn ook onderzocht met de methode41,42. Met dit document presenteerden we een gedetailleerd protocol over hoe we drie vaak bestudeerde zenuwletsels kunnen veroorzaken en hoe we functioneel herstel achteraf kunnen evalueren. Naar onze mening zou een hands-on-richtlijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn op het gebied van experimentele zenuwletsel, reparatie en regeneratie over hoe optimaal gebruik te maken van de voordelige kenmerken van de methode van grote hulp zijn.
Verschillende auteurs hebben het potentieel van AGA aangepakt om functioneel herstel bij knaagdieren te evalueren en wijzen op het voordeel van de methode om tegelijkertijd gangparameters met betrekking tot motorische en zintuiglijke reïnnervatie27,28te beoordelen . Bovendien maakt de vergelijking van gegevens van een experimentele poot, bijvoorbeeld gereconstrueerde zenuwletsel met een niet-geoperated poot, zoals werd aangetoond in beide gepresenteerde modellen, een opname van een intradierpositieve controle mogelijk. Omgekeerd kan een geopereerde poot zonder chirurgische reconstructie of aanvullende behandeling dienen als een intra-dierlijke negatieve controle. Ook werd aangetoond dat het mogelijk is om AGA te combineren met machine learning benaderingen43. Ondanks de voordelen van de methode heeft het ook verschillende beperkingen en nadelen, zoals de tijdrovende trainingsinspanningen, die verplicht zijn om het dier te wennen aan de aankoopprocedure28,44. Een andere beperking van AGA is de maximale grootte van de dieren die voor tests in aanmerking komen vanwege de beperkte afmetingen van het apparaat. Daarom is het gebruik van AGA momenteel beperkt tot dieren ter grootte van knaagdieren en fretten45. Bovendien kunnen onlangs opkomende benaderingen voor neurogedragsbeoordeling op het gebied van motion tracking die in staat zijn om machine learning te ontwikkelen AGA overtreffen in zowel volledigheid als mogelijke toepassingen18,19,46. Meest opmerkelijk, maar in overeenstemming met andere evaluatiemethoden, lijkt het erop dat functioneel herstel zoals beoordeeld door AGA is sterk beperkt-indien zelfs voorkomende-in modellen van heupzenuw neurotmesis47,48. Aan de andere kant, AGA zorgt voor een uitgebreide evaluatie van het verloop van functioneel herstel na femorale zenuw neurotmesis zoals blijkt uit onze gegevens. Met dit werk hebben we aangetoond dat Paw Print Area is een representatieve gang parameter beoordeeld via AGA, die exemplarisch is voor het verloop van functioneel herstel in de twee bovengenoemde perifere zenuwletsel modellen gepresenteerd door ons. Terwijl functioneel herstel ad integrum waarneembaar was na autograft reparatie van de femorale zenuw, werden AGA parameters nog steeds aanzienlijk veranderd van baseline aan het einde van de observatieperiode na autograft reparatie van de heupzenuw. Het is opmerkelijk in deze context dat ledematen contractures zijn een gemeenschappelijk fenomeen bij ratten met heupzenuwletsel en voorzichtigheid is noodzakelijk niet om deze tekenen van spieronbalans en verlamming te verwarren met de procedure functioneel herstel32. Dit aan de ene kant onderstreept het onvermogen van de AGA-methode om significant functioneel herstel na neurotmesisletsel in dit model te detecteren. Aan de andere kant roept het de vraag op of het haalbaar is om het heupzenuwletselmodel van de rat, dat nog steeds het meest gebruikte experimentele zenuwherstelmodel is, te evalueren door middel van loopanalyse in het algemeen voor het geval de zenuwblessure ernstiger is dan axonotmesis48. Gegevens over het oplossen van problemen worden vermeld in aanvullend bestand 1.
We hebben ook voorbeeldige gegevens verstrekt over het gebruik van de methode om de motorische functie bij ratten met dwarslaesie te evalueren, wat mogelijk is zonder dat de hardware-installatie of de aanschafprocedure hoeft te worden gewijzigd. Hetzelfde principe geldt voor andere knaagdiermodellen van centrale zenuwletsel (CNI)26,49,50 en wortelavulsieletsel. In tegenstelling tot geïsoleerde PNO's zijn verwondingen van het ruggenmerg veel complexer in hun pathofysiologische gevolgen, omdat een veelheid van zeer belangrijke structuren beschadigd zijn, waarbij efferent paden zoals de corticospinale en rubrospinale traktaten en afferent paden zoals de dorsale kolommen en spinothalamische traktaten35. De uitdaging om deze pathologische veranderingen adequaat te beoordelen komt tot uiting in het uitgebreide bewapeningsarium van gedragstests, zoals de Basso, Beattie en Bresnahan (BBB) score36. De loopparameter Base of Support is gemeld te verhogen na centrale zenuwverwondingen, waarschijnlijk om rekening te houden met een resulterende instabiele gang. Basis van ondersteuning werd aanzienlijk veranderd van baseline van WPO10 tot WPO14 in ons model, ter ondersteuning van ons vermoeden dat deze parameter het mogelijk maakt de beoordeling van het verloop van functioneel herstel door AGA na thoracale dwarslaesie kneuzing letsel.
Wij zijn ervan overtuigd dat AGA een haalbaar hulpmiddel is om functioneel herstel bij knaagdieren met verwondingen van het zenuwstelsel te evalueren. Toch adviseren wij om de waargenomen veranderingen van gang zorgvuldig en grondig in elke respectieve experimentele setup weer te geven. Wijzigingen in gangparameters, bijvoorbeeld een toename van het afdrukgebied na een onmiddellijke postoperatieve decrementatie of een afname van de swingtijd die een onmiddellijke postoperatieve verhoging van deze parameter in gang stelt, hebben in de loop van de observatieperiode niet onvermijdelijk betrekking op functioneel herstel. In plaats daarvan kunnen deze veranderingen ook worden gerelateerd aan een mogelijke functionele aanpassing om een onopvallende gang te behouden, gezien het feit dat ratten een prooi zijn en proberen te voorkomen dat ze pijn of invaliditeit vertonen aan potentiële roofdieren51. Het wordt daarom aanbevolen om geautomatiseerde ganganalyse te gebruiken als een aanvullend instrument om veranderingen van gang te relateren aan andere uitkomstmaatregelen van perifere zenuwletsel en regeneratie21. Zoals eerder vermeld, zijn we ook van mening dat het zorgvuldig moet worden weerspiegeld als knaagdieren met heupzenuwneurotmesis moeten worden onderzocht door middel van AGA, omdat onze bevinding sterk aangeeft dat functioneel herstel in dit geval ernstig beperkt is.
Zoals blijkt uit ons werk, aga's belangrijkste troef is de mogelijkheid om zowel motorische en zintuiglijke reinnervatie te bestuderen in een veelheid van experimentele PNI-modellen en CNI, terwijl die slechts een setup. Daarom is de methode naar onze mening een zeer waardevol hulpmiddel voor uitgebreide neurogedragstesten. Een van de activa van AGA, die de mogelijkheid is om motorische en zintuiglijke reinnervatie te bestuderen in verschillende diermodellen van PNI en CNI, terwijl het vereisen van slechts een setup, is naar onze mening het belangrijkste voordeel van de methode in vergelijking met andere evaluatiemethoden om functioneel herstel te bestuderen, zoals walking track analyse52, Von Frey testen53, of gang kinematica16. Het potentieel om tegelijkertijd veranderingen van gang te evalueren die ofwel correleren met de resultaten van elektrofysiologische onderzoeken van gereïnnervateerde spier22 of evaluatiemethoden voor zintuiglijke functie54 is veelbelovend met betrekking tot toekomstige toepassingen van de methode. We raden daarom aan om AGA te gebruiken om functioneel herstel te onderzoeken in knaagdiermodellen van forelimb PNI, zoals de ulnar, radiale of mediane zenuw, of experimentele zenuwoverdrachtmodellen55, die nog niet met deze methode worden onderzocht.
Hierbij bieden we een gedetailleerd protocol over het gebruik van geautomatiseerde ganganalyse om functioneel herstel te bestuderen in drie knaagdiermodellen van zenuwletsel. Hoewel de methode zorgvuldige afweging vereist van verschillende belangrijke aspecten, zoals adequate training en zorgvuldige harde- en softwarekalibratie, is het een haalbaar en waardevol aanvullend hulpmiddel om zenuwregeneratie in knaagdiermodellen van centrale en perifere zenuwletsel te evalueren.

Verwondingen van het perifere en centrale zenuwstelsel worden vaak bestudeerd bij knaagdieren, wat resulteert in een grote hoeveelheid vergelijkende gegevens over het verloop van zenuwletsel, reparatie of neuroprotectie om verdere secundaire verwondingen en regeneratie1,2,3tegen te gaan . De uitkomst van experimentele behandelingsstrategieën in knaagdiermodellen kan worden beoordeeld aan de hand van verschillende technieken zoals histologie, immunohistochemie, elektrofysiologie en beeldvormingstechnieken zoals röntgenmicrotomografie (μCT) scans, maar het belangrijkste criterium om het succes van een behandeling te bepalen is - zoals bij menselijke patiënten — de mate van functioneel herstel4,5. De eerste studies naar de motorische prestaties bij knaagdieren dateren uit dejaren 40 6,7,8. Ratten en muizen werden onderworpen aan een grote hoeveelheid studies onderzoeken hun motorisch gedrag in de volgende decennia9,10,11. Tegenwoordig bestaat er een breed scala aan beoordelingstechnieken voor knaagdiermodellen van perifere en centrale zenuwletsels, variërend van wandelbaananalyse met inkt en papier12,13,14 over enkel en gang kinematica15,16,17 tot machine learning verbeterde methoden, die het mogelijk maken voor de complexe schatting van gang, ledematen en gewrichtstrajecten18,19.
Geautomatiseerde Automated Gait Analysis (AGA) wordt gebruikt om de motorische functie te evalueren na perifere en centrale zenuwverwondingen en mogelijke experimentele behandeling van dergelijke verwondingen. Het apparaat bestaat voornamelijk uit een glazen loopbrug en een lichtbron die de pootafdrukken van het knaagdier verlicht in correlatie met de druk die door hen wordt overschreden. Deze gegevens worden vervolgens geautomatiseerd om een breed scala aan statische en dynamische parameters te berekenen. Volgens Deumens kunnen deze parameters verder worden onderverdeeld in de categorieën algemene parameters, pijngerelateerde parameters en coördinatiegerelateerde parameters van gang20 (tabel 1). De haalbaarheid van AGA om veranderingen in ganggedrag op te sporen is bewezen in verschillende diermodellen van perifere zenuwletsel (PNI)21, zoals de heupzenuw20, femur zenuw22, en mediane zenuw23,24. Het wordt ook routinematig gebruikt om de motorische functie te beoordelen bij ratten met centrale zenuwverwondingen, bijvoorbeeld beroerte25 of dwarslaesie26. De vooruitgang van de methode ligt in de grote hoeveelheid vergelijkbare gegevens en de mogelijkheid om een overvloed aan parameters met betrekking tot gang27vast te leggen . Dit document heeft tot doel onderzoekers die geïnteresseerd zijn in diermodellen van PNI en dwarslaesie (SCI) te voorzien van een gedetailleerde en hands-on richtlijn om de motorische functie in dergelijke modellen te beoordelen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Categorie</td>
			<td>Parameter</td>
			<td colspan="2">Beschrijving</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Algemene parameters van de gang</td>
			<td>Afdrukgebied (afstandseenheid)</td>
			<td colspan="2">Gebied van de pootafdruk</td>
		</tr>
<tr>
<td>Afdruklengte (afstandseenheid)</td>
			<td colspan="2">Lengte van de pootafdruk</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steunbasis (BoS) (afstandseenheid)</td>
			<td colspan="2">Afstand tussen de twee achter- of voorpoten</td>
		</tr>
<tr>
<td>Paslengte (afstandseenheid)</td>
			<td colspan="2">Afstand tussen twee opeenvolgende plaatsingen van een poot</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Pijngerelateerde parameters van gang</td>
			<td>Swing Time (s)</td>
			<td colspan="2">Duur van de swingfase</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standtijd (s)</td>
			<td colspan="2">Duur van de houdingsfase</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mean Paw Print Intensiteit (willekeurige eenheid)</td>
			<td colspan="2">Gemiddelde iIntensity van de pootafdruk tijdens de houdingsfase</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Coördinatiegerelateerde parameters van de gang</td>
			<td>NSSP (Normale stapsequentiepatronen)</td>
			<td colspan="2">Specifieke sequenties van paw plaatsingen tijdens een stapcyclus</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fasedispersies (%)</td>
			<td colspan="2">Temporele verschillen tussen de stapcycli van twee specifieke poten</td>
		</tr>
<tr>
<td>Regelmatigheidsindex (RI) (%)</td>
			<td colspan="2">Kwantificering van interlimb coördinatie door het aantal foutloze NSSP-tijden 4 te delen door het totale aantal paw-plaatsing tijdens één stapcyclus</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Parameters van gang te beoordelen met de geautomatiseerde ganganalyse. De categorieën waarin de parameters worden ingedeeld, worden gekozen volgens Deumens et al.20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Saline</td>
			<td>B. Braun Austria</td>
			<td>3570410</td>
			<td>Vehicle for drug delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>B. Braun Austria</td>
			<td>9161708V</td>
			<td>Injecting device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>B. Braun Austria</td>
			<td>4606728 V</td>
			<td>Injecting device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin</td>
			<td>Gebro Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Alcoholic skin disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge (G) canula</td>
			<td>B. Braun Austria</td>
			<td>4657667</td>
			<td>Canula for s.c. injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26-gauge (G) canula</td>
			<td>B. Braun Austria</td>
			<td>4657683</td>
			<td>Canula for s.c. injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe</td>
			<td>B. Braun Austria</td>
			<td>4606710 V</td>
			<td>Injecting device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9275</td>
			<td>Analgetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs for Micro Drill</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>19007-29</td>
			<td>Drilling of a hole inside the lamina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprofen</td>
			<td>Zoetis Austria</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Analgetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catwalk Automated gait analysis system</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Automatic analysis software of animal gait</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cauterizer Kit</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterization of vessels during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin</td>
			<td>Bayer Austria</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon (10-0)</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>2810G</td>
			<td>Suture material for neurrorhaphy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon (11-0)</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>EH7465G</td>
			<td>Suture material for neurrorhaphy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Fresenius Kabi Austria</td>
			<td>4302436</td>
			<td>Eye protection during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>16221-14</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gabapentin</td>
			<td>Wedgewood Pharmacy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Analgetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goldstein retractor</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>17003-03</td>
			<td>Retraction of tissues during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair trimmer</td>
			<td>Aescular</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad for rodents</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Regulation of body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impactor</td>
			<td>Precision Systems and Instrumentation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Induction of spinal cord contusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis rat (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61852/61852equ01.jpg" />)</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Experimental animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Fixator Retraction System</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>18200-50</td>
			<td>Retraction of tissues during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Baby Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14019-13</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill</td>
			<td>Word Precision Instruments</td>
			<td>503599</td>
			<td>Instrument for bone drilling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12076-12</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-scissors (curved)</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15023-10</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-scissors (straight)</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15007-08</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror Finish Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11251-23</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12002-12</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M651 MSD</td>
			<td>Magnification of the operative site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iod</td>
			<td>B. Braun Melsungen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Non-alcoholic skin disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Oximeter</td>
			<td>STARR Life Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Surveillance of heart rate and oxygen saturation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent thermometer</td>
			<td>BIOSEB</td>
			<td>BIO-TK8851</td>
			<td>Surveillance of body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10010-00 (#10)</td>
			<td>Surgical instrument to make an incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12 (#3)</td>
			<td>Surgical instrument to make an incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>HDG9117A</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula &#38; Probe</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10090-13</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley rat (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61852/61852equ01.jpg" />)</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Experimental animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterila gauze 5x5cm</td>
			<td>EVAC MEDICAL</td>
			<td>E010.03.00215</td>
			<td>Sterile gauze compress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11021-12</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl (4-0)</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>V3040H</td>
			<td>Suture material for subcutaneous sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl (5-0)</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>V303H</td>
			<td>Suture material for subcutaneous sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl cutting needle (4-0)</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>V392ZH</td>
			<td>Suture material for skin sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl cutting needle (5-0)</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>V391H</td>
			<td>Suture material for skin sutures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated gait analysis to assess functional recovery in rodents with peripheral nerve or spinal cord contusion injury

Perifere en centrale zenuwverwondingen worden meestal bestudeerd bij knaagdieren, met name ratten, gezien het feit dat deze diermodellen zowel kosteneffectief zijn als veel vergelijkende gegevens in de literatuur zijn gepubliceerd. Dit omvat een veelheid van beoordelingsmethoden om functioneel herstel te bestuderen na zenuwletsel en reparatie. Naast evaluatie van zenuwregeneratie door middel van histologie, elektrofysiologie en andere in vivo en in vitro beoordelingstechnieken, is functioneel herstel het belangrijkste criterium om de mate van neurale regeneratie te bepalen. Geautomatiseerde ganganalyse maakt het mogelijk om een enorme hoeveelheid ganggerelateerde parameters zoals Paw Print Area en Paw Swing Speed op te nemen, evenals maatregelen voor interlede-ledcoördinatie. Bovendien biedt de methode digitale gegevens van de poten van de ratten na neuronale schade en tijdens zenuwregeneratie, wat bijdraagt aan ons begrip van hoe perifere en centrale zenuwverwondingen hun bewegingsgedrag beïnvloeden. Naast het overwegend gebruikte heupzenuwletselmodel kunnen andere modellen van perifere zenuwletsel zoals de dijbeenzenuw met deze methode worden bestudeerd. Naast verwondingen van het perifere zenuwstelsel kunnen laesies van het centrale zenuwstelsel, bijvoorbeeld, ruggenmergkneuzing worden geëvalueerd. Valide en reproduceerbare gegevensbeoordeling is sterk afhankelijk van een zorgvuldige aanpassing van de hard- en software-instellingen voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Daarnaast is een goede opleiding van de proefdieren van cruciaal belang. Dit werk heeft tot doel het gebruik van geautomatiseerde geautomatiseerde ganganalyse te illustreren om functioneel herstel te beoordelen in verschillende diermodellen van perifere zenuwletsel en dwarslaesieletsel. Het benadrukt ook de beperkingen van de methode, bijvoorbeeld, evaluatie van zenuwregeneratie bij ratten met heupzenuwneurotmesis als gevolg van beperkt functioneel herstel. Daarom wordt dit protocol gedacht om onderzoekers die geïnteresseerd zijn in perifere en centrale zenuwverwondingen te helpen om functioneel herstel in knaagdiermodellen te beoordelen.

12 ratten ondergingen experimentele perifere zenuwchirurgie. Sciatische zenuwresectie(figuur 2A) werd uitgevoerd bij 7 ratten, terwijl femorale zenuwneurotmesis (figuur 2B) werd geïnduceerd bij 5 ratten. Bij alle dieren werd het zenuwdefect gereconstrueerd door middel van een autologe zenuwtransplantatie. Ruggenmergkneuzingletsel (Figuur 2C) op niveau11 werd geïnduceerd bij 6 ratten, wat resulteerde in een totaal van 18 ratten.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig02.jpg"> Figuur 2: Operatieve locaties na zenuwreconstructie. Zenuwreconstructie met autografts in de heupzenuw(A) en dijbeenzenuw(B)en na dwarslaesieletsel(C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Alle dieren herstelden goed van een operatie en er traden geen gevallen van zelfverminking op. Een dier van de heupzenuwletselgroep ontwikkelde in de loop van de postoperatieve observatieperiode sterke contracturen van de rechterachterpoot en moest worden uitgesloten van verdere gegevensanalyse.
Heupzenuw neurotmesis Aangezien de heupzenuw gespierde en zintuiglijke innervatie biedt aan de meerderheid van de achterpoot, resulteert de resectie ervan in een ernstige aantasting van de motorische functie. Na letsel, ratten gebruiken de hiel van de poot voor gewicht ondersteuning alleen(Figuur 3B-E) en de ledemaat wordt verplaatst in een vegen omtrek beweging. Daarom worden de via AGA beoordeelde bewegingsveranderingen duidelijk door middel van een aanzienlijk verminderd afdrukgebied(figuur 4A) en aanzienlijk toegenomen swingtijd (figuur 4B). Beide parameters werden nog steeds aanzienlijk gewijzigd in vergelijking met pre-OP-metingen aan het einde van de observatieperiode. Opmerkelijk, ontwikkelde één dier sterke contracturen van de juiste achterpoot die bij postoperatieve week (WPO) begint 10. Dit resulteerde in een toename van het afdrukgebied van de rechter achterpoot tot meer dan 150% in vergelijking met de linkspoot bij WPO12 (figuur 5). Aangezien dit een extremum was in vergelijking met alle andere dieren die in deze studie werden beoordeeld, hebben we dit dier uitgesloten van gegevensanalyse met betrekking tot Print Area.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig03.jpg"> Figuur 3: Representatieve pootafdrukken voorafgaand aan en na de kritische grootte resectie van de rechter heupzenuw en autograft reparatie. Let op de sterke afname van printruimte na zenuwletsel(B) in vergelijking met preoperatief (A). Ondanks een lichte toename in printgebied in de loop van de observatieperiode(C-E)bleven de pootafdrukken van de rechterachterpoot met name veranderd ten opzichte van basisregistraties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig04.jpg"> Figuur 4: Het verloop van functioneel herstel na kritische grootteresectie en autograft reparatie van de heupzenuw. Print Area Ratio(A) en Swing Time Ratio(B) werden statistisch aanzienlijk gewijzigd van Pre-OP waarden onmiddellijk na heupzenuw resectie. Hoewel Print Area aanzienlijk daalde ten opzichte van baseline tot WPO10, werd swing time nog steeds aanzienlijk verhoogd tot pre-OP waarden bij WPO12. *: p < 0,05 in vergelijking met Pre-OP, **: p < 0,01 in vergelijking met Pre-OP. Foutbalken geven gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig05.jpg"> Figuur 5: Boxplot van de loop van Print Area na heupzenuwletsel. Let op het extremum (rode ellips) bij WPO12, wat wordt verklaard door het feit dat één dier sterke contracturen van de rechter achterpoot ontwikkelde die van WPO10 begint. Het dier werd derhalve uitgesloten van de statistische analyse van figuur 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Femorale zenuwneurotmesis Femorale zenuwresectie resulteert in denervatie van de quadriceps spier van de dij33,34. Bijgevolg is de knieverlenging verminderd, wat resulteert in hyperflexie van het enkelgewricht met opeenvolgende opheffing van de hiel van de poot. Daarom wordt de respectievelijke paw's Print Area (Figuur 6B), sterk verminderd na de operatie. Print Gebied van de linker achterpoot wordt verhoogd als gevolg van een compenserende verschuiving van het gewicht naar links. Dit moet in gedachten worden gehouden, omdat dit fenomeen rechtstreeks van invloed is op de berekende verhouding tussen de "experimentele" en "controle" poot. Vanaf WPO4 reinnervation van de quadriceps door de regenererende femorale zenuw leidt tot omkering van deze veranderingen wat resulteert in een verhoogde Paw Print Area van de rechter achterpoot (Figuur 7A). Als de quadriceps spier van de dij speelt ook een rol in de swing fase van de respectieve poot, Swing Time (Figuur 7B) is sterk verlengd bij ratten met dijbeen zenuwletsel. Spiegelen van de terugkeer van Print Area, Swing Time vermindert als de regenererende femorale zenuw bereikt de quadriceps spier van de dij. Bij WPO10 keerden beide parameters van de gang terug naar de basislijn, wat een volledig functioneel herstel signaleert.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig06.jpg"> Figuur 6: Representatieve pootafdrukken. Representatieve pootafdrukken voorafgaand aan (A) en volgende (B-E) rechter femorale zenuw resectie en autograft reparatie. Print Gebied van RH sterk gedaald bij WPO2(B), terwijl een toename van Print Area van de linker achterpoot (LH) als gevolg van verhoogde gewichtsbelasting zichtbaar werd. RH Print Area begon te verhogen vanaf WPO6 (C) vergezeld van een daling van print gebied van LH. Bij WPO8 (D) en WPO10 (E) Print Area van RH hersteld terug dicht bij preoperatieve niveaus. (Aangepast met toestemming van Heinzel et al.22, gelicentieerd onder CC BY 4.0.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig07.jpg"> Figuur 7: Het verloop van functioneel herstel na 7 mm resectie en autograft reparatie van de femorale zenuw. Het verloop van Print Area Ratio(A) en Swing Time Ratio(B)bleek een sterke verandering onmiddellijk na femorale zenuw resectie, maar waarden hersteld terug naar preoperatieve waarden op WPO8. #: p < 0,05. Foutbalken geven gemiddelde ± SEM. (Aangepast met toestemming van Heinzel et al.22, licentie onder CC BY 4.0.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Ruggenmergkneuzing Gait analyse bleek duidelijk veranderd poot afdrukken na thoracale ruggenmerg kneuzing letsel (Figuur 8), meest opmerkelijke een decrement in Print Area en een duidelijke interne rotatie van de achterpoten op WPO2 (Figuur 8B). Opmerkelijk is dat de pootrotatie ook wordt geïmplementeerd als een beoordelingsfunctie in de BBB, wat de toepasbaarheid van geautomatiseerde ganganalyse onderstreept om veranderingen van gang te evalueren die oorspronkelijk werden geëvalueerd met Open Field-tests. Wat betreft het verloop van de individuele gangparameters, resulteerde ruggenmergkneuzing op het th11-niveau in een afname van de Print Area Ratio(figuur 9A) en toename van de Swing Time Ratio (figuur 9B). Beide parameters trendeerden in de richting van basisniveaus tijdens het verdere verloop van de observatieperiode, maar er waren geen statistisch significante veranderingen waarneembaar. Ook bij WPO2 daalde de coördinatiegerelateerde parameter Regularity Index (figuur 9C),maar de mate varieerde sterk tussen dieren. Het ook trended in de richting van preoperatieve waarden tot WPO16. Basis van steun van de achterpoten (Figuur 9D), een algemene parameter van gang volgens Deumens, toonde een duidelijke stijging, die statistisch significant was van WPO10 tot WPO14. Het trendeerde naar basislijnniveaus op WPO16 en werd op dit moment niet meer significant gewijzigd ten opzichte van de Pre-OP-waarde.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig08.jpg"> Figuur 8: Representatieve pootafdrukken van de twee achterpoten. Paw drukt preoperatief(A) en na thoracale dwarslaesieletsel(B-F). Let op de vermindering van het afdrukgebied vanaf WPO2(B)vergezeld van een opmerkelijke interne rotatie van de poten. In de loop van de observatieperiode(C–F)is een toename van het afdrukgebied waarneembaar, evenals de speling van de interne rotatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig09.jpg"> Figuur 9: Ruggenvlieskneuzing op het niveau van 11 th. Ruggenmergkneuzing op 11 th resulteerde in waarneembare veranderingen van Print Area Ratio(A) en Swing Time (B) en de Regularity Index(C), maar deze veranderingen waren niet statistisch significant. Na de schade vertoonde de basis van de steun van de achterpoten een duidelijke stijging ten opzichte van de basislijn, wat statistisch significant was bij WPO10 tot WPO14. *: p < 0,05 in vergelijking met Pre-OP. Foutbalken geven aan dat ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Aanvullende bestand 1: Details voor het oplossen van problemen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61852/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury at JoVE.com

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Geautomatiseerde loopanalyse is een haalbaar hulpmiddel om functioneel herstel te evalueren in knaagdiermodellen van perifere zenuwletsel en dwarslaesie. Hoewel het slechts één opstelling vereist om de motorische functie in verschillende experimentele modellen te beoordelen, is nauwgezette hard- en soft-ware aanpassing en training van de dieren zeer belangrijk.

Geautomatiseerde ganganalyse om functioneel herstel bij knaagdieren met perifere zenuw- of ruggenmergkvochtletsel te beoordelen

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...

Geautomatiseerde ganganalyse is een veelgebruikte methode voor het evalueren van functionele herstel inschrijving modellen van perifere zenuwletsel, reparatie, en regeneratie. De methode kan worden gebruikt om veranderingen in gang te bestuderen na perifere zenuwletsel, met betrekking tot zowel motorische als zintuiglijke zenuwfunctie. Onderzoekers die nieuw zijn op de methode kunnen problemen ondervinden bij het verkrijgen van gegevens van hoge kwaliteit.Typische hindernissen zijn adequate diertraining en nauwkeurige hardware- en softwarekalibratie. Schakel tijdens trainingen en op de testdag alle lichtbronnen in de gedragstestruimte uit en kijk naar het computerscherm voor gegevensverwerving uit de buurt van de camera om te voorkomen dat het licht de camera verstoort. Bevestig dat het apparaat is geïnstalleerd in een stabiele positie op een manier die elke vorm van trillingen voorkomt, en breng de ratten in de gedragstestruimte in hun eigen huis kooi gedurende ten minste 30 minuten voor de test, Op de eerste dag van de opleiding, voorzichtig grijpen een dier onder zijn romp en zorgvuldig plaats het in de loopbrug ingang.Laat de rat de opening van de gang zonder enige inmenging verkennen en wacht tot het dier vrijwillig de loopbrug oversteekt om zijn kooi te bereiken zonder enige externe prikkel of motivatie. Op de tweede dag van de training, laat de dieren gewend raken aan het invoeren van de loopbrug en terug te keren naar hun huis kooi zonder aarzeling. Op de derde dag van de training, bevestigen dat de dieren hebben geleerd om de loopbrug over te steken op een uniforme snelheid zonder aarzeling, snuiven, of andere verkennende bewegingen.Herhaal bij de vierde en vijfde de training om de testprocedure te versterken. Op de dag van het experiment, gebruik commerciële glasreiniger en een squeegee om de boven-en onderkant van de loopbrug te reinigen en ervoor te zorgen om alle vloeistof te verwijderen uit de uiteinden van de loopbrug. Plaats zowel de lichtste als de zwaarste ratten op de loopbrug en selecteer een geregistreerde camera op het tabblad setup om de camera te krijgen, rood plafondlicht, groen loopbruglicht en groene intensiteitsdrempel aan te passen om een optimale paw print detectie voor alle dieren in de analyse te garanderen.Klik vervolgens op open acquisitie en verwerf een momentopname van de lege opgeschoonde loopbrug die als referentie kan worden gebruikt tijdens de procedure voor het verzamelen van gegevens. De status verandert van wachten op momentopname naar klaar voor acquisitie. Klik op acquisitie starten.De status verandert van klaar voor acquisitie naar wachten op het starten van de run. Wanneer de camera klaar is, plaatst u een rat op de loopbrug en volg de beweging van het dier op het computerscherm. Let op, de status verandert van wachten tot het uitvoeren van de opname wordt uitgevoerd.Klik aan het einde van de analyse op classificeren in het tabblad experimentele ontdekkingsreiziger van de te classificeren proefversie en speel de verkregen run op normale snelheid af om te bepalen of de gegevens voldoen aan de classificatievereisten. Klik op automatisch classificeren voor automatische classificatie van de pootafdrukken door de software. Voor een correcte berekening van de normale stapsequentiepatronen moet u ervoor zorgen dat het classificerende algoritme niet wordt verward door niet-zichtbare pootafdrukken, wat leidt tot gebrekkige NSSP en dat alleen pootafdrukken die detecteerbaar zijn terwijl de contralaterale poot ook zichtbaar is voor NSSP-berekeningen, zijn opgenomen.Voor statistische analyse van de gegevens klikt u op statistieken voor het uitvoeren van weergaven om een uitgebreid overzicht van de runstatistieken te verkrijgen. Selecteer vervolgens bestand en export om de run- of proefstatistieken te exporteren naar een spreadsheetsoftware. Na heupzenuwletsel, ratten gebruiken de hiel van de poot voor gewicht ondersteuning alleen en de ledemaat wordt verplaatst in een ingrijpende omtrek beweging.Daarom worden bewegingsveranderingen die via geautomatiseerde ganganalyse worden beoordeeld, duidelijk door een aanzienlijk verminderd afdrukgebied en een aanzienlijk langere swingtijd. Femorale zenuwresectie resulteert in denervatie van de quadriceps spier van de dij, afbreuk te doen aan de knieverlenging en het induceren van hyperbuiging van het enkelgewricht met opeenvolgende opheffing van de overeenkomstige hiel. Vanaf postoperatieve week vier leidt reenervation van de quadriceps door de regenererende femorale zenuw tot omkering van deze veranderingen.Als de quadriceps spier van de dij speelt ook een rol in de swing fase van de respectieve poot, de swing tijd is sterk verlengd bij ratten met femorale zenuwletsel. Gang analyse onthult duidelijk veranderde poot afdrukken na thoracale ruggenmerg kneuzing. Ruggenmergkneuzing op het thoracale 11-niveau resulteert ook in een afname van de afdrukverhouding, een toename van de swingtijdverhouding.De coördinatiegerelateerde regelmatigheidsindex neemt ook af na de postoperatieve week twee, terwijl de steunbasis van de achterpoten een duidelijke stijging laat zien. Bij het gebruik van geautomatiseerde poortanalyse om functioneel herstel bij knaagdieren te evalueren, moet u de dieren zorgvuldig trainen en nauwgezet zijn bij het maken van software- of hardwareaanpassingen. Door gebruik te maken van geautomatiseerde ganganalyse kunnen letsel en regeneratie van het centrale en perifere zenuwstelsel worden geëvalueerd in verschillende knaagdiermodellen, waaronder nog niet-onderzochte formele zenuwmodellen, zoals de mediane zenuw.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantatie van olfactorische Ensheathing Cellen tot functioneel herstel Evalueer na perifere zenuwschade

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-induced Spinal Cord Injury Model Mechanismen van axonale degeneratie Beoordeel in real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging neurale activiteit in de primaire somatosensorische Cortex met behulp van Thy1-GCaMP6s transgene muizen

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

Geautomatiseerde ganganalyse in muizen met chronische vernauwing blessure

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Activity-based Training op een loopband met ruggenmerg gewond Wistar ratten

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse voor de functionele evaluatie in het Rattenmodel van Sciatische Zenuwbrekerletsel

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Inductie van volledige transsectie-type ruggenmergletsel bij muizen

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

Comprehensive Understanding of Inactivity-Induced Gait Alteration in Rodents

Uitgebreid begrip van door inactiviteit geïnduceerde gangverandering bij knaagdieren

It is well known that disuse affects neural systems and that joint motions become altered; however, which outcomes properly exhibit these characteristics ...

Establishing a Mouse Contusion Spinal Cord Injury Model Based on a Minimally Invasive Technique

Het opzetten van een muiskneuzingsletselmodel op basis van een minimaal invasieve techniek

Using minimally invasive methods to model spinal cord injury (SCI) can minimize behavioral and histological differences between experimental animals, ...