Name: automated gait analysis to assess functional recovery in rodents with peripheral nerve or spinal cord contusion injury
Uploaded: 2020-10-06T15:00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury at JoVE.com

Gli autori ringraziano Karin Brenner per la sua appassionata cura degli animali. Gli autori ringraziano anche Claudia Keibl, James Ferguson, Gabriele Leinfellner e Susanne Drechsler per la loro assistenza durante gli interventi chirurgici sperimentali.

Gli autori dichiarano che questo lavoro è stato supportato da Noldus Inc. Nessuno degli autori ha ricevuto alcun salario personale o alcun tipo di gratuità finanziaria. Gli autori non hanno altri interessi concorrenti da dichiarare.

La valutazione del recupero funzionale nei modelli animali di PNI e SCI rimane impegnativa a causa della grande varietà di metodi di valutazione, ognuno con vantaggi e svantaggi individuali. Solo pochi approcci sono stati testati e convalidati in più modelli di lesioni nervose periferiche e centrali, anche se nuove promettenti tecniche che combinano il tracciamento del movimento e l'apprendimento automatico potrebbero potenzialmente spingere la ricerca neurocomportamentale al livello successivo di test funzionali. Siamo convinti che presto emergeranno metodi all'avanguardia ampiamente applicabili a un'ampia varietà di modelli di animali e lesioni. Alla luce di queste considerazioni, uno dei vantaggi dell'AGA è la possibilità di valutare il recupero funzionale in più modelli di lesione nervosa utilizzando un solo dispositivo. Fin dai primi anni 2000 questo approccio è stato utilizzato in modelli sperimentali di PNI come lo sciatico37,il peroneal38e la lesione nervosa femorale modello22, nonché dopo l'avulsione della radice sia del lombare39 che del plesso brachiale40. Con il metodo41 , 42sono state studiate anche varie lesioni nervose centrali, tra cui lesioni da contusione almidollo spinale. Con questo articolo, abbiamo presentato un protocollo dettagliato su come indurre tre lesioni nervose comunemente studiate e su come valutare il recupero funzionale in seguito. A nostro avviso, una linea guida pratica per i ricercatori interessati all'area della lesione nervosa sperimentale, della riparazione e della rigenerazione su come utilizzare al meglio le caratteristiche vantaggiose del metodo sarebbe di grande aiuto.
Diversi autori hanno affrontato il potenziale dell'AGA per valutare il recupero funzionale nei roditori, evidenziando il vantaggio del metodo di valutare contemporaneamente i parametri dell'andatura relativi alla reinnervazione motoria esensoriale 27,28. Inoltre, il confronto dei dati di una zampa sperimentale, ad esempio, la lesione nervosa ricostruita a una zampa non funzionante, come mostrato in entrambi i modelli presentati, consente l'inclusione di un controllo positivo intra-animale. Inversamente, una zampa operata senza ricostruzione chirurgica o trattamento aggiuntivo potrebbe servire come controllo negativo intra-animale. È stato anche dimostrato che è possibile combinare AGA con approcci di machine learning43. Nonostante i vantaggi del metodo, ha anche diversi limiti e svantaggi, come i lunghi sforzi di formazione, che sono obbligatori per abituare l'animale alla procedura diacquisizione 28,44. Un'altra limitazione dell'AGA è la dimensione massima degli animali ammissibili alla prova a causa delle dimensioni limitate dell'apparecchio. Pertanto, l'uso di AGA è attualmente limitato agli animali delle dimensioni di roditori e furetti45. Inoltre, gli approcci di valutazione neurocomportamentale recentemente emergenti nel campo del tracciamento del movimento in grado di apprendere automaticamente possono superare l'AGA sia nellacompletezza che nelle possibili applicazioni 18,19,46. La cosa più degna di nota, ma in accordo con altri metodi di valutazione, sembra che il recupero funzionale valutato dall'AGA sia fortemente limitato , se non addirittura presente, nei modelli di neurotmesi nervosa sciatica47,48. D'altra parte, L'AGA consente una valutazione completa del corso di recupero funzionale dopo la neurotmesi nervosa femorale come mostrato dai nostri dati. Con questo lavoro, abbiamo dimostrato che Paw Print Area è un parametro di andatura rappresentativo valutabile tramite AGA, che è esemplare per il corso del recupero funzionale nei due suddetti modelli di lesione nervosa periferica presentati da noi. Mentre il recupero funzionale ad integrum era osservabile dopo la riparazione autoinnesto del nervo femorale, i parametri AGA erano ancora significativamente cambiati dalla linea di base alla fine del periodo di osservazione dopo la riparazione dell'autoinnesto del nervo sciatico. È interessante notare in questo contesto che le contratture degli arti sono un fenomeno comune nei ratti con lesione nervosa sciatica e cautela è necessaria per non confondere questi segni di squilibrio muscolare e paralisi con il recupero funzionaleprocedente 32. Questo da un lato sottolinea l'incapacità del metodo AGA di rilevare un significativo recupero funzionale a seguito di lesioni da neurotmesi in questo modello. D'altra parte, solleva la questione se sia possibile valutare il modello di lesione nervosa sciatica del ratto, che è ancora il modello sperimentale di riparazione dei nervi più comunemente usato, attraverso l'analisi dell'andatura in generale nel caso in cui la lesione nervosa sia più grave dell'assonotmesi48. I dettagli sulla risoluzione dei problemi sono disponibili nel file complementare 1.
Abbiamo anche fornito dati esemplari sull'uso del metodo per valutare la funzione locomotoria nei ratti con lesione del midollo spinale, che è possibile senza alcuna modifica richiesta della procedura di configurazione o acquisizione hardware. Lo stesso principio si applica ad altri modelli di roditori di lesione nervosa centrale (CNI)26,49,50 e lesione da avulsione della radice. A differenza dei PNI isolati, le lesioni del midollo spinale sono molto più complesse nelle loro conseguenze fisiopatiche, poiché una moltitudine di strutture altamente importanti sono danneggiate, coinvolgendo vie efferente come i tratti corticospinale e rubrospinale e vie afferenti come le colonne dorsali e i tratti spinotalamici35. La sfida di valutare adeguatamente questi cambiamenti patologici si riflette nell'armamentario completo dei test comportamentali, come il Punteggio Basso, Beattie e Bresnahan (BBB)36. Il parametro dell'andatura Base of Support è stato segnalato per aumentare a seguito di lesioni nervose centrali, molto probabilmente per tenere conto di un'andatura instabile risultante. La base di supporto è stata significativamente cambiata dalla linea di base da WPO10 a WPO14 nel nostro modello, supportando la nostra presunzione che questo parametro consenta la valutazione del corso di recupero funzionale da parte dell'AGA a seguito di una lesione della contusione del midollo spinale toracico.
Siamo convinti che l'AGA sia uno strumento fattibile per valutare il recupero funzionale nei roditori con lesioni del sistema nervoso. Tuttavia, si consiglia di riflettere attentamente e accuratamente i cambiamenti osservati dell'andatura in ogni rispettiva configurazione sperimentale. Le alterazioni dei parametri dell'andatura, ad esempio un aumento dell'area di stampa a seguito di un decremento postoperatorio immediato o una diminuzione del tempo di oscillazione procedendo ad un'immediata elevazione postoperatoria di questo parametro, nel corso del periodo di osservazione non si riferiscono inevitabilmente al recupero funzionale. Invece questi cambiamenti possono anche essere correlati a un possibile adattamento funzionale per mantenere un'andatura poco appariscente, dato che i ratti sono una specie di preda e cercare di evitare di mostrare dolore o disabilità ai potenziali predatori51. Si raccomanda pertanto di utilizzare l'analisi automatizzata dell'andatura come strumento complementare per correlare i cambiamenti di andatura ad altre misure di risultato della lesione nervosa periferica e dellarigenerazione 21. Come accennato in precedenza, crediamo anche che dovrebbe essere attentamente riflesso se i roditori con neurotmesi nervosa sciatica dovrebbero essere studiati per mezzo dell'AGA poiché la nostra scoperta indica fortemente che il recupero funzionale è fortemente limitato in questo caso.
Come dimostrato nel nostro lavoro, l'asset principale di AGA è la possibilità di studiare la reinnervazione sia motoria che sensoriale in una moltitudine di modelli PNI sperimentali e CNI, richiedendo al contempo una sola configurazione. Pertanto, il metodo è, a nostro avviso, uno strumento altamente prezioso per test neurocomportamentali completi. Uno degli asset di AGA, che è la possibilità di studiare la reinnervazione motoria e sensoriale in vari modelli animali di PNI e CNI pur richiedendo una sola configurazione, è a nostro avviso il principale vantaggio del metodo rispetto ad altri metodi di valutazione per studiare il recupero funzionale, come l'analisi dei sentieri52,il test von Frey53o la cinematica dell'andatura16. La possibilità di valutare contemporaneamente i cambiamenti dell'andatura che sono correlati con i risultati di indagini elettrofisiologiche sul muscolo reinnervato22 o con metodi di valutazione per lafunzione sensoriale 54 è promettente per quanto riguarda le future applicazioni del metodo. Si consiglia pertanto di utilizzare l'AGA per studiare il recupero funzionale nei modelli di roditori del PNI dell'avaro, come il nervo ulnare, radiale o mediano, o i modelli sperimentalidi trasferimento nervoso 55, che rimangono ancora non studiato con questo metodo.
Con la presente forniamo un protocollo dettagliato su come utilizzare l'analisi automatizzata dell'andatura per studiare il recupero funzionale in tre modelli di roditori di lesione nervosa. Mentre il metodo richiede un'attenta considerazione di vari aspetti chiave come un allenamento adeguato e una meticolosa calibrazione dura e software, è uno strumento complementare fattibile e prezioso per valutare la rigenerazione nervosa nei modelli di roditori di lesione nervosa centrale e periferica.

Le lesioni del sistema nervoso periferico e centrale sono spesso studiate nei roditori, con conseguente grande quantità di dati comparativi riguardanti il decorso della lesione nervosa, della riparazione o della neuroprotezione per contrastare ulteriori lesionisecondarie e rigenerazione 1,2,3. Il risultato delle strategie di trattamento sperimentale nei modelli di roditori può essere valutato da una varietà di tecniche come istologia, immunoistochimica, elettrofisiologia e tecniche di imaging come le scansioni di microtomografia a raggi X (μCT), ma il criterio più importante per determinare il successo di un trattamento è - come nei pazienti umani - il grado di recupero funzionale4,5. I primi studi che studiano le prestazioni locomotorie nei roditori risalgono agli anni'40 6,7,8. Ratti e topi sono stati sottoposti a una grande quantità di studi che hanno studiato il loro comportamento locomotorenei decenni successivi 9,10,11. Al giorno d'oggi esiste una vasta gamma di tecniche di valutazione per modelli di roditori di lesioni nervose periferiche e centrali, che vanno dall'analisi dei percorsi pedonali con inchiostro e carta12,13,14 sulla cinematica della caviglia e dell'andatura15,16,17 ai metodi potenziati di machine learning, che consentono la complessa stima delle traiettorie di andatura, arto earticolazione 18,19.
L'analisi automatizzata computerizzata dell'andatura (AGA) viene utilizzata per valutare la funzione locomotoria a seguito di lesioni nervose periferiche e centrali e potenziale trattamento sperimentale di tali lesioni. Il dispositivo è costituito principalmente da una passerella di vetro e una fonte di luce che illumina le impronte delle zampe del roditore in correlazione con la pressione superata da loro. Questi dati vengono quindi computerizzati per calcolare un'ampia gamma di parametri statici e dinamici. Secondo Deumens, questi parametri possono essere ulteriormente suddivisi nelle categorie di parametri generali, parametri correlati al dolore e parametri correlati alla coordinazione dell'andatura20 (tabella 1). La fattibilità dell'AGA per rilevare cambiamenti nel comportamento dell'andatura è stata dimostrata in vari modelli animali di lesione nervosa periferica (PNI)21, come il nervo sciatico20, nervo femorale22e nervo mediano23,24. Viene anche usato regolarmente per valutare la funzione locomotoria nei ratti con lesioni nervose centrali, ad esempio ictus25 o contusione del midollo spinale26. I progressi del metodo risiedono nella grande quantità di dati comparabili e nella sua possibilità di registrare una pletora di parametri relativi all'andatura27. Questo documento mira a fornire ai ricercatori interessati ai modelli animali di PNI e lesioni del midollo spinale (SCI) una linea guida dettagliata e pratica per valutare la funzione locomotoria in tali modelli.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Categoria</td>
			<td>Parametro</td>
			<td colspan="2">Descrizione</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Parametri generali dell'andatura</td>
			<td>Area di stampa (unità di distanza)</td>
			<td colspan="2">Area della stampa della zampa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lunghezza stampa (unità di distanza)</td>
			<td colspan="2">Lunghezza dell'impronta della zampa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Base di supporto (BoS) (unità di distanza)</td>
			<td colspan="2">Distanza tra le due zampe posteriori o anteriori</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lunghezza falcata (unità di distanza)</td>
			<td colspan="2">Distanza tra due posizionamenti consecutivi di una zampa</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Parametri correlati al dolore dell'andatura</td>
			<td>Tempo di oscillazione (s)</td>
			<td colspan="2">Durata della fase di oscillazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di stand (s)</td>
			<td colspan="2">Durata della fase di stance</td>
		</tr>
<tr>
<td>Intensità media stampa zampa (unità arbitraria)</td>
			<td colspan="2">Media iIntensità della stampa della zampa durante la fase di posizione</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Parametri relativi al coordinamento dell'andatura</td>
			<td>Modelli di sequenza passo normale (NSSP)</td>
			<td colspan="2">Sequenze specifiche di posizionamenti delle zampe durante un ciclo a gradini</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispersioni di fase (%)</td>
			<td colspan="2">Differenze temporali tra i cicli dei gradini di due zampe specifiche</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indice di regolarità (RI) (%)</td>
			<td colspan="2">Quantificazione della coordinazione interlimb dividendo la quantità di NSSP impeccabile per 4 per il numero complessivo di posizionamento della zampa durante un ciclo a gradini</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Parametri dell'andatura valutabili con l'analisi automatizzata dell'andatura. Le categorie in cui i parametri sono classificati sono scelte in base a Deumens etal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Saline</td>
			<td>B. Braun Austria</td>
			<td>3570410</td>
			<td>Vehicle for drug delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>B. Braun Austria</td>
			<td>9161708V</td>
			<td>Injecting device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>B. Braun Austria</td>
			<td>4606728 V</td>
			<td>Injecting device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin</td>
			<td>Gebro Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Alcoholic skin disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge (G) canula</td>
			<td>B. Braun Austria</td>
			<td>4657667</td>
			<td>Canula for s.c. injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26-gauge (G) canula</td>
			<td>B. Braun Austria</td>
			<td>4657683</td>
			<td>Canula for s.c. injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe</td>
			<td>B. Braun Austria</td>
			<td>4606710 V</td>
			<td>Injecting device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9275</td>
			<td>Analgetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs for Micro Drill</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>19007-29</td>
			<td>Drilling of a hole inside the lamina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprofen</td>
			<td>Zoetis Austria</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Analgetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catwalk Automated gait analysis system</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Automatic analysis software of animal gait</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cauterizer Kit</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterization of vessels during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin</td>
			<td>Bayer Austria</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon (10-0)</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>2810G</td>
			<td>Suture material for neurrorhaphy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon (11-0)</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>EH7465G</td>
			<td>Suture material for neurrorhaphy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Fresenius Kabi Austria</td>
			<td>4302436</td>
			<td>Eye protection during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>16221-14</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gabapentin</td>
			<td>Wedgewood Pharmacy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Analgetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goldstein retractor</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>17003-03</td>
			<td>Retraction of tissues during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair trimmer</td>
			<td>Aescular</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad for rodents</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Regulation of body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impactor</td>
			<td>Precision Systems and Instrumentation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Induction of spinal cord contusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis rat (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61852/61852equ01.jpg" />)</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Experimental animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Fixator Retraction System</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>18200-50</td>
			<td>Retraction of tissues during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Baby Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14019-13</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill</td>
			<td>Word Precision Instruments</td>
			<td>503599</td>
			<td>Instrument for bone drilling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12076-12</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-scissors (curved)</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15023-10</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-scissors (straight)</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15007-08</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror Finish Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11251-23</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12002-12</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M651 MSD</td>
			<td>Magnification of the operative site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iod</td>
			<td>B. Braun Melsungen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Non-alcoholic skin disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Oximeter</td>
			<td>STARR Life Sciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Surveillance of heart rate and oxygen saturation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent thermometer</td>
			<td>BIOSEB</td>
			<td>BIO-TK8851</td>
			<td>Surveillance of body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10010-00 (#10)</td>
			<td>Surgical instrument to make an incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12 (#3)</td>
			<td>Surgical instrument to make an incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>HDG9117A</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula &#38; Probe</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10090-13</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley rat (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61852/61852equ01.jpg" />)</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Experimental animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterila gauze 5x5cm</td>
			<td>EVAC MEDICAL</td>
			<td>E010.03.00215</td>
			<td>Sterile gauze compress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11021-12</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl (4-0)</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>V3040H</td>
			<td>Suture material for subcutaneous sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl (5-0)</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>V303H</td>
			<td>Suture material for subcutaneous sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl cutting needle (4-0)</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>V392ZH</td>
			<td>Suture material for skin sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl cutting needle (5-0)</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>V391H</td>
			<td>Suture material for skin sutures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated gait analysis to assess functional recovery in rodents with peripheral nerve or spinal cord contusion injury

Le lesioni nervose periferiche e centrali sono per lo più studiate nei roditori, in particolare nei ratti, dato che questi modelli animali sono sia economici che molti dati comparativi sono stati pubblicati in letteratura. Ciò include una moltitudine di metodi di valutazione per studiare il recupero funzionale dopo la lesione nervosa e la riparazione. Oltre alla valutazione della rigenerazione nervosa mediante istologia, elettrofisiologia e altre tecniche di valutazione in vivo e in vitro, il recupero funzionale è il criterio più importante per determinare il grado di rigenerazione neurale. L'analisi automatizzata dell'andatura consente la registrazione di una grande quantità di parametri correlati all'andatura come Paw Print Area e Paw Swing Speed, nonché misure di coordinazione tra gli arti. Inoltre, il metodo fornisce dati digitali delle zampe dei ratti dopo il danno neuronale e durante la rigenerazione nervosa, aggiungendo alla nostra comprensione di come le lesioni nervose periferiche e centrali influenzano il loro comportamento locomotore. Oltre al modello di lesione nervosa sciatica utilizzato prevalentemente, altri modelli di lesione nervosa periferica come il nervo femorale possono essere studiati con questo metodo. Oltre alle lesioni del sistema nervoso periferico, è possibile valutare le lesioni del sistema nervoso centrale, ad esempio la contusione del midollo spinale. Una valutazione dei dati valida e riproducibile dipende fortemente da una meticolosa regolazione delle impostazioni rigide e software prima dell'acquisizione dei dati. Inoltre, un'adeguata formazione degli animali da esperimento è di importanza cruciale. Questo lavoro ha lo scopo di illustrare l'uso dell'analisi automatizzata computerizzata dell'andatura per valutare il recupero funzionale in diversi modelli animali di lesione nervosa periferica e lesioni da contusione del midollo spinale. Sottolinea anche i limiti del metodo, ad esempio la valutazione della rigenerazione nervosa nei ratti con neurotmesi nervosa sciatica a causa del limitato recupero funzionale. Pertanto, si pensa che questo protocollo aiuti i ricercatori interessati alle lesioni nervose periferiche e centrali a valutare il recupero funzionale nei modelli di roditori.

12 ratti sono stati sottoposti a chirurgia sperimentale del nervo periferico. La resezione del nervo sciatico (Figura 2A) è stata eseguita in 7 ratti, mentre la neurotmesi nervosa femorale (Figura 2B) è stata indotta in 5 ratti. In tutti gli animali, il difetto nervoso è stato ricostruito per mezzo di un innesto nervoso autologo. La lesione da contusione del midollospinale (figura 2C)al livello Th11 è stata indotta in 6 ratti, per un totale di 18 ratti.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig02.jpg"> Figura 2: Siti operativi dopo la ricostruzione nervosa. Ricostruzione nervosa con autoinnesti nel nervo sciatico (A) e nervo femorale (B) così come dopo la lesione da contusione del midollo spinale (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tutti gli animali si sono ripresi bene dall'intervento chirurgico e non si sono verificati casi di automutilazione. Un animale del gruppo delle lesioni nervose sciatiche ha sviluppato forti contratture della zampa posteriore destra durante il periodo di osservazione postoperatoria e ha dovuto essere escluso da ulteriori analisi dei dati.
Neurotmesi nervosa sciatica Poiché il nervo sciatico fornisce innervazione muscolare e sensoriale alla maggior parte dell'arto posteriore, la sua resezione si traduce in una grave compromissione della funzione locomotoria. A seguito di lesioni, i ratti usano il tallone della zampa solo per il supporto delpeso (Figura 3B-E) e l'arto viene spostato in un movimento circonduttivo ampio. Pertanto, i cambiamenti locomotori valutati tramite AGA diventano evidenti attraverso un'area di stampasignificativamente ridotta (figura 4A)e un tempo di oscillazione significativamente aumentato (Figura 4B). Entrambi i parametri sono stati ancora significativamente modificati rispetto alle misurazioni Pre-OP alla fine del periodo di osservazione. Degno di nota, un animale ha sviluppato forti contratture della zampa posteriore destra a partire dalla settimana postoperatoria (WPO) 10. Ciò ha comportato un aumento dell'area di stampa della zampa posteriore destra a oltre il 150% rispetto alla zampa sinistra al WPO12 (Figura 5). Poiché si trattava di un estremo rispetto a tutti gli altri animali valutati in questo studio, abbiamo escluso questo animale dall'analisi dei dati relativi all'area di stampa.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig03.jpg"> Figura 3: Impronte rappresentative delle zampe prima e dopo la resezione delle dimensioni critiche del nervo sciatico destro e della riparazione dell'autoinnesto. Si noti la forte diminuzione dell'area di stampa a seguito dilesioni nervose( B ) rispetto a preoperatoriamente (A). Nonostante un leggero incremento nell'area di stampa durante il periodo di osservazione(C-E),le impronte delle zampe dell'arto posteriore destro rimasero notevolmente modificate rispetto alle registrazioni di base. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig04.jpg"> Figura 4: Il corso del recupero funzionale dopo la resezione delle dimensioni critiche e la riparazione dell'autoinnesto del nervo sciatico. Il rapporto area di stampa (A) e lo swing time ratio (B) sono stati statisticamente modificati in modo significativo dai valori Pre-OP immediatamente dopo la resezione del nervo sciatico. Mentre l'area di stampa è rimasta significativamente diminuita rispetto alla linea di base fino a WPO10, Swing Time è stato ancora significativamente aumentato a valori Pre-OP a WPO12. *: p < 0,05 rispetto a Pre-OP, **: p < 0,01 rispetto al Pre-OP. Le barre di errore indicano ± errore standard della media (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig05.jpg"> Figura 5: Boxplot del corso dell'area di stampa a seguito di una lesione del nervo sciatico. Si noti l'estremo (ellisse rossa) al WPO12, che è spiegato dal fatto che un animale ha sviluppato forti contratture della zampa posteriore destra a partire da WPO10. L'animale è stato quindi escluso dall'analisi statistica mostrata nella figura 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Neurotmesi nervosa femorale La resezione del nervo femorale provoca la denervazione del muscolo quadricipite della coscia33,34. Di conseguenza, l'estensione del ginocchio è compromessa, con conseguente iperflessione dell'articolazione della caviglia con sollevamento consecutivo del tallone della zampa. Pertanto, l'area di stampa della rispettiva zampa (Figura 6B), è fortemente ridotta dopo l'intervento chirurgico. L'area di stampa della zampa posteriore sinistra è aumentata a causa di uno spostamento compensativo del peso a sinistra. Questo dovrebbe essere tenuto a mente, poiché questo fenomeno influenza direttamente il rapporto calcolato tra la zampa "sperimentale" e "di controllo". A partire dalla reinnervazione WPO4 del quadricipite da parte del nervo femorale rigenerante porta all'inversione di questi cambiamenti con conseguente aumento dell'area di stampa delle zampe della zampa posteriore destra (Figura 7A). Poiché anche il muscolo quadricipite della coscia gioca un ruolo nella fase di oscillazione della rispettiva zampa, Swing Time (Figura 7B) è notevolmente prolungato nei ratti con lesione del nervo femorale. Rispecchiando il ritorno dell'area di stampa, Swing Time diminuisce man mano che il nervo femorale rigenerante raggiunge il muscolo quadricipite della coscia. Al WPO10, entrambi i parametri dell'andatura sono tornati alla linea di base, segnalando il pieno recupero funzionale.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig06.jpg"> Figura 6: Impronte rappresentative delle zampe. Impronte rappresentative della zampa prima della (A) e seguenti (B–E) resezione del nervo femorale destro e riparazione dell'autograft. L'area di stampa di RH è diminuita fortemente a WPO2 (B), mentre è diventato visibile un aumento dell'area di stampa della zampa posteriore sinistra (LH) a causa dell'aumento del carico di peso. L'area di stampa RH ha iniziato ad aumentare a partire dal WPO6 (C) accompagnato da una diminuzione dell'area di stampa di LH. A WPO8 (D) e WPO10 (E) L'area di stampa di RH è tornata vicino ai livelli preoperatori. (Adattato con il permesso di Heinzel et al.22, concesso in licenza sotto CC BY 4.0.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig07.jpg"> Figura 7: Il corso del recupero funzionale dopo la resezione di 7 mm e la riparazione dell'autoinnesto del nervo femorale. Il corso di Print Area Ratio (A) e Swing Time Ratio (B) ha rivelato un forte cambiamento immediatamente dopo la resezione del nervo femorale, ma i valori sono tornati ai valori preoperatori al WPO8. #: p < 0,05. Le barre di errore indicano ± SEM. (Adattato con il permesso di Heinzel et al.22, concesso in licenza sotto CC BY 4.0.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Contusione del midollo spinale L'analisi dell'andatura ha rivelato impronte di zampe marcatamente alterate dopo una lesione da contusione del midollo spinale toracico (Figura 8), il più degno di nota è un decremento nell'area di stampa e una marcata rotazione interna delle zampe posteriori al WPO2 (Figura 8B). Degno di nota, la rotazione della zampa è anche implementata come caratteristica valutabile nella BBB, sottosegnala l'applicabilità dell'analisi computerizzata dell'andatura per valutare i cambiamenti di andatura che sono stati originariamente valutati con i test Open Field. Per quanto riguarda il corso dei singoli parametri dell'andatura, la contusione del midollo spinale al livello di Th11 ha comportato una diminuzione del Rapporto area di stampa (Figura 9A) e un incremento del rapporto di tempo oscillante(Figura 9B). Entrambi i parametri tendevano verso i livelli di riferimento durante l'ulteriore corso del periodo di osservazione, ma non vi sono stati cambiamenti statisticamente significativi osservabili. Anche l'indice di regolarità dei parametri correlati al coordinamento (Figura 9C) è diminuito al WPO2, ma il grado variava notevolmente tra gli animali. Ha anche orientato verso valori preoperatori fino a WPO16. La base di supporto delle zampe posteriori (Figura 9D), un parametro generale dell'andatura secondo Deumens, ha mostrato un marcato aumento, che è stato statisticamente significativo da WPO10 a WPO14. Si è orientato verso i livelli di base a WPO16 e non è stato più modificato in modo significativo dal valore Pre-OP in questo momento.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig08.jpg"> Figura 8: Impronte rappresentative delle zampe posteriori. Paw stampa preoperatoriamente (A) e a seguito di una lesione alla contusione del midollo spinale toracico (B-F). Si noti la riduzione dell'area di stampa a partire dal WPO2 (B) accompagnata da una notevole rotazione interna delle zampe. Nel corso del periodo di osservazione (C-F) è osservabile un incremento dell'area di stampa e il gioco della rotazione interna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig09.jpg"> Figura 9: Contusione del midollo spinale al livello th 11. La contusione del midollo spinale all'11° th ha provocato alterazioni osservabili del Print Area Ratio (A) e swing time (B) e dell'indice di regolarità (C), ma questi cambiamenti non sono stati statisticamente significativi. A seguito di lesioni, la base di supporto delle zampe posteriori ha mostrato un marcato aumento rispetto al basale, ciò che era statisticamente significativo al WPO10 fino al WPO14. *: p < 0,05 rispetto al Pre-OP. Le barre di errore indicano ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File aggiuntivo 1: Dettagli sulla risoluzione dei problemi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61852/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

L'analisi automatizzata dell'andatura è uno strumento fattibile per valutare il recupero funzionale nei modelli di roditori di lesioni nervose periferiche e lesioni da contusione del midollo spinale. Mentre richiede una sola configurazione per valutare la funzione locomotoria in vari modelli sperimentali, è molto importante una meticolosa regolazione e formazione di prodotti duri e morbidi degli animali.

Analisi automatizzata dell'andatura per valutare il recupero funzionale nei roditori con lesione da contusione del nervo periferico o del midollo spinale

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...

L'analisi automatizzata dell'andatura è un metodo ampiamente utilizzato per valutare i modelli di registrazione del recupero funzionale delle lesioni nervose periferiche, della riparazione e della rigenerazione. Il metodo può essere utilizzato per studiare i cambiamenti nell'andatura dopo la lesione del nervo periferico, relativi sia alla funzione motoria che sensoriale del nervo. I ricercatori nuovi al metodo potrebbero avere difficoltà nell'acquisire dati di alta qualità.Gli ostacoli tipici sono un'adeguata formazione degli animali e un'accurata calibrazione hardware e software. Durante le sessioni di allenamento e il giorno del test, spegnere tutte le sorgenti luminose nella sala prove comportamentale e affrontare lo schermo del computer per l'acquisizione dei dati lontano dalla fotocamera per evitare che la sua luce interferisca con la fotocamera. Confermare che il dispositivo è installato in una posizione stabile in modo da prevenire qualsiasi forma di vibrazione e portare i ratti nella sala prove comportamentale nella propria gabbia di casa per almeno 30 minuti prima del test, Il primo giorno di allenamento, afferrare delicatamente un animale sotto il suo tronco e posizionarlo con cura nell'ingresso della passerella.Lascia che il topo esplori l'apertura del corridoio senza alcuna interferenza e attendi che l'animale attraversi volontariamente la passerella per raggiungere la sua gabbia domestica senza alcun stimolo o motivazione esterna. Il secondo giorno di allenamento, consenti agli animali di abituarsi ad entrare nella passerella e tornare alla loro gabbia di casa senza esitazione. Il terzo giorno di allenamento, conferma che gli animali hanno imparato ad attraversare la passerella a una velocità uniforme senza esitazione, annusare o altri movimenti esplorativi.Il quarto e il quinto, ripetere la formazione per rafforzare la procedura di prova. Il giorno dell'esperimento, utilizzare un detergente commerciale per vetri e uno squeegee per pulire la parte superiore e inferiore della passerella facendo attenzione a rimuovere tutto il fluido dalle estremità della passerella. Posiziona sia i ratti più leggeri che più pesanti sulla passerella e seleziona una fotocamera registrata dalla scheda di configurazione per consentire di regolare il guadagno della fotocamera, la luce rossa del soffitto, la luce verde della passerella e la soglia di intensità verde per garantire un rilevamento ottimale della stampa della zampa per tutti gli animali nell'analisi.Fare quindi clic su acquisizione aperta e acquisire un'istantanea della passerella pulita vuota da utilizzare come riferimento durante tutta la procedura di acquisizione dei dati. Lo stato cambierà dall'attesa dell'istantanea a pronto per l'acquisizione. Fare clic su Avvia acquisizione.Lo stato cambierà da pronto per l'acquisizione a in attesa dell'inizio dell'esecuzione. Quando la fotocamera è pronta, posizionare un topo sulla passerella e seguire il movimento dell'animale sullo schermo del computer. Si noti che lo stato cambia dall'attesa dell'inizio dell'esecuzione all'esecuzione della registrazione.Al termine dell'analisi, fare clic su classifica nella scheda esploratore sperimentale della versione di valutazione da classificare e riprodurre l'esecuzione acquisita a velocità normale per determinare se i dati sono conformi ai requisiti di classificazione. Fare clic su classifica automaticamente per la classificazione automatica delle impronte dei pedoni da parte del software. Per il calcolo corretto dei normali modelli di sequenza dei gradini, assicurarsi che l'algoritmo di classificazione non sia confuso da impronte di zampe non visibili, portando a NSSP difettosi, e che siano incluse solo le impronte dei pedoni rilevabili mentre la zampa contralto è visibile anche per i calcoli NSSP.Per l'analisi statistica dei dati, fare clic su Visualizza statistiche di esecuzione per ottenere una panoramica completa delle statistiche di esecuzione. Quindi selezionare file ed esportare, per esportare le statistiche di esecuzione o di valutazione in un software per fogli di calcolo. A seguito di una lesione del nervo sciatico, i ratti usano il tallone della zampa solo per il supporto del peso e l'arto viene spostato in un movimento circonduttivo ampio.Pertanto, i cambiamenti locomotori valutati tramite l'analisi automatizzata dell'andatura diventano evidenti da un'area di stampa significativamente ridotta e da un tempo di oscillazione significativamente aumentato. La resezione del nervo femorale provoca la denervazione del muscolo quadricipite della coscia, compromettendo l'estensione del ginocchio e inducendo iperflessione dell'articolazione della caviglia con sollevamento consecutivo del tallone corrispondente. A partire dalla quarta settimana post-operatoria, il reenervation del quadricipite da parte del nervo femorale rigenerante porta all'inversione di questi cambiamenti.Poiché anche il muscolo quadricipite della coscia gioca un ruolo nella fase di oscillazione della rispettiva zampa, il tempo di oscillazione è notevolmente prolungato nei ratti con lesione del nervo femorale. L'analisi dell'andatura rivela impronte di zampe marcatamente alterate dopo la contusione del midollo spinale toracico. La contusione del midollo spinale a livello toracico 11 comporta anche una diminuzione del rapporto area di stampa, un incremento del rapporto di tempo di oscillazione.L'indice di regolarità correlato al coordinamento diminuisce anche alla seconda settimana post-operatoria, mentre la base di supporto delle zampe posteriori mostra un marcato aumento. Quando si utilizza l'analisi automatica del cancello per valutare il recupero funzionale nei roditori, assicurarsi di addestrare attentamente gli animali e di essere meticolosi quando si apportano modifiche software o hardware. Utilizzando l'analisi automatizzata dell'andatura, la lesione e la rigenerazione del sistema nervoso centrale e periferico possono essere valutate in vari modelli di roditori, inclusi i modelli nervosi formali ancora non uditi, come il nervo mediano.

Research

JoVE Journal

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