Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

نشكر البروفيسور إيفانا نوفاك والدكتورة نين مين كريستنسن (مركز التصوير الحيوي المتقدم (CAB)، جامعة كوبنهاغن) على توفير الوصول إلى المجهر. وقد دعم هذا العمل مجلس البحوث الأوروبي (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN؛ AEM-G، OW، RR و JTE)؛ منحة دكتوراه من مؤسسة لوندبيك (R286-2018-621؛ MR)؛ مجلس البحوث السويدي (2017-03389؛ آلية التنمية النظيفة)؛ الجمعية السويدية للسرطان، Cancerfonden (CAN 2016/783، 19 0632 Pj، 190007؛ آلية التنمية النظيفة)؛ المعونة الألمانية لمكافحة السرطان (دويتشه كريبشيلفي؛ RR)؛ وجمعية السرطان الدنماركية (R204-A12454; RR).

وقد تم استعراض جميع الإجراءات المدرجة هنا والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية التي تنظم الطب التجريبي في جامعة كوبنهاغن وتتفق مع التشريعات الدنماركية والأوروبية. لإثبات هذا البروتوكول ، استخدمنا فئران BALB / cJ الأنثوية من عمر 8-12 أسبوعا وفأرة أنثى MMTV-PyMT تبلغ من العمر 11 أسبوعا.
<p class="jove_...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

تقنيات إزالة الخلايا على أساس هياج الأنسجة تغيير هيكل ECM، مما يجعلها غير مناسبة لتحليل هيكل ECM4. الارتهاق الارتخائي ، باستخدام مسار تشريحي مثل الشريان الأورطي للرغامى ، يسمح بالوصول إلى السرير الشعري ، أو الحويصلات الهوائية الطرفية ، ويسهل تسليم عوامل التفكيك في جميع أنحاء ال...

و ECM هي شبكة ثلاثية الأبعاد مصنوعة من البروتينات والجلوكان التي تستوعب جميع الخلايا في كائن متعدد الخلايا، وإعطاء الأعضاء شكلها وتنظيم سلوك الخلية طوال الحياة1. من تخصيب البويضة فصاعدا، تقوم الخلايا ببناء وإعادة تشكيل ECM، وبالتالي يتم التحكم فيها بدقة من قبلها. الغرض من هذا البروتوكول هو فتح طريقة لتحليل خريطة الفأر ECM ، حيث أن الفئران هي الكائن الحي النموذجي الأكثر استخداما في الفيزيولوجيا المرضية للثدييات.
وكان الدافع وراء تطوير هذه الطريقة هو الحاجة إلى توصيف وعزل ECM2 الأصلي المرتبط بالنقائل. نظرا لأن الأورام تفتقر إلى الأوعية الدموية التشريحية المناسبة والفئران هي كائنات صغيرة نسبيا ، فقد تم تصميم الإجراءات الجراحية الدقيقة لقسطرة الشريان الأورطي إلى الوراء ، مع عزل دوران الأوعية الرئيسية المؤدية إلى الورم (على سبيل المثال ، الأوردة الرئوية) ، وبالتالي تركيز تدفق الكاشف والسماح بإزالة الورم. تنتج هذه الطريقة سقالات ECM مع هيكل محفوظ2 يمكن أن يكون ملطخا بالمناعة ومصورا ، مما يسمح برسم خرائط بنية ECM بتفاصيل submicron. لتنفيذ هذا البروتوكول، من الضروري اكتساب المهارات الجراحية والجراحية الدقيقة (تشريح، والتسوية الدقيقة والقسطرة) التي قد تمثل قيدا محتملا على استخدامه. على حد علمنا، تمثل هذه الطريقة أحدث ما في تحليل تصوير بنية ECM الأصلي2,3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

نقدم هنا بروتوكول التفكيك لقلب الفأر والرئتين. وتنتج سقالات ECM الهيكلية التي يمكن استخدامها لتحليل طوبولوجيا ECM وتكوينها. وهو يقوم على إجراء جراحي دقيق مصمم لقسطرة القصبة الهوائية والأورطة من فأر القتل الرحيم لتشويش القلب والرئتين مع عوامل التفكيك. يمكن أن يكون مجمع القلب الرئوي الديسيلي في وقت لاحق ملطخا بالمناعة للكشف عن موقع بروتينات ECM الهيكلية. يمكن الانتهاء من الإجراء بأكمله في 4 أيام.
سقالات ECM الناتجة عن هذا البروتوكول خالية من التشوهات الأبعاد. غياب الخلايا يتيح الفحص الهيكلي للهياكل ECM وصولا الى قرار submicron في 3D. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الأنسجة السليمة والمرضية من الفئران التي لا تتجاوز أعمارهم 4 أسابيع ، بما في ذلك نماذج الماوس من التليف والسرطان ، مما يفتح الطريق لتحديد إعادة عرض ECM المرتبطة بمرض القلب والكون.

الديسيلولارات القلبية الرئوية بعد الانتهاء بنجاح من البروتوكول، والقلب والرئتين، فضلا عن الأنسجة الملحقة مثل القوس الأبهري، وسوف تكون خالية من الخلايا. يمكن التحقق من صحة Decellularization عن طريق تلطيخ hematoxylin-eosin (الشكل 1) من سقالات ECM التي تظهر إزالة ?...

Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

يهدف هذا البروتوكول إلى تداعي قلب ورئتي الفئران. يمكن أن تكون سقالات المصفوفة خارج الخلية الناتجة (ECM) ملطخة بالمناعة ومصورة لرسم خريطة لموقع وتضاريم مكوناتها.

إلغاء التفكيك لمجمع مورين لأمراض القلب والعقد

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

هذا البروتوكول هو بوابة المصفوفة خارج الخلية. انها التعقيد وهيكلها وصولا الى نطاق دون ميكرون. وبالتالي فإن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يجعل من الممكن الحصول على مصفوفة خارج الخلية التي تحتفظ بسلامتها الهيكلية وبالتالي فتح الطريق للتحليل الكيميائي الحيوي والتشريحي.وسيكون من بين التدليل على الإجراء، أليخاندرو مايوركا جيلاني، ورافائيل توتن، وماريا رافايفا، الموجودون حاليا في مختبري وكريس مادسن، والذي كان في مختبري وواصل العمل في جامعة لوند. ابدأ بحلق الصدر والبطن وظهر الماوس القتل الرحيم بمقص شعر. تطهير المنطقة مع 70٪ الإيثانول.ثم دبوس الماوس إلى صينية البوليسترين، وتمديد أطرافه الخلفية نهاية أربعة، فضلا عن رأسه والذيل. ضعه تحت مجهر الجراحة المجهرية. باستخدام مقص نمط مستقيم مايو، وجعل شق جلدي يمتد من المنطقة السفلية الفك السفلي إلى أسفل البطن وتشريح تحت الجلد لفضح جدار الصدر والحمور.ثم استخدم مقص الجراحة الدقيقة لقطع العضلات الصدرية الرئيسية والصدرية البسيطة على طول المساحة الوربية السادسة على جانبي الجدار الصدري. قطع القص على طول الشقوق السابقة مع مقص نمط مستقيم. ثم إكمال استئصال القص عن طريق قطع القص على طول محورها الطويل.رفع ودبوس، كلا الجانبين من الجدار الصدري لفضح مجمع القلب والعقدة الرئوية. استخدام ملقط صغير مستدير يميل لاستئصال الغدة الصعترية والأنسجة الدهنية المحيطة بها عن طريق سحب بدقة لهم قبالة المرفقات الخاصة بهم. وقطع المريء بمقص صغير.فصل الأوردة brachiocephalic والشريان العضدي مع ملقط صغير حاد. ثم فصل السباتية الشائعة اليسرى والشرايين تحت الترقوة اليسرى من الأنسجة الأساسية لتسهيل الربط والكي. استخدام حامل microneedle والملقط الدقيق الحاد وتسعة يا خياطة لوضع غرز فوق ظهور brachiocephalic اليسار السباتية المشتركة والشرايين تحت الترقوة اليسرى، الكي الأوردة brachiocephalic.باستخدام مقص صغير، افتح مدخلا عن طريق تقسيم الرباط. إدخال قسطرة قياس 27 في القصبة الهوائية ودفع بدقة حتى فروع القصبة الهوائية في القصبات الهوائية، مع الحرص على عدم تعطيل القصبات الهوائية. باستخدام ستة خياطة O، ضع ثلاث غرز حول القصبة الهوائية لتأمين القسطرة.قسم الماوس في ذروة الفقرة الصدرية 12th ، الشريان الأورطي التنازلي يمتد من قبل إلى العمود الفقري ، وينبغي تقسيم هنا جنبا إلى جنب مع العمود الفقري. القسطرة إلى الوراء الشريان الأورطي ودفع القسطرة حتى تصل إلى القوس الأبهري. باستخدام خياطة، ضع أربع غرز حول الشريان الأورطي، بداية من خمسة ملليمترات تحت طرف القسطرة.قم بتوصيل الماوس بنظام مضخة باستخدام أنابيب السيليكون والموصلات السفلية. Perfuse مع الماء deionized في 200 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة لمدة 15 دقيقة. ثم تغيير عامل التشوه إلى 0.5٪ DOC، مخففة في الماء deionized وتغلغل بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، تغيير عامل التشوه إلى 0.1٪ SDS المخفف في الماء deionized، و perfuse لمدة ثماني ساعات. ثم perfuse مع الماء deionized لمدة 24 ساعة لغسل SDS وDOC. إعادة استئصال القلب والرئتين decellularized عن طريق تقسيم ملحقاتها إلى الصدر.تخزين الأنسجة في أنبوب التبريد العقيم في الماء deionized مع 1٪ ستريبتوميسين البنسلين و 0.3 ميكرومولار الصوديوم azide في أربع درجات مئوية. لإجراء تلطيخ المناعة، قم بحجب العينة عن طريق احتضانها في أنبوب التبريد الذي يحتوي على مصل حمار بنسبة 6٪ و3٪ BSA بين عشية وضحاها. ثم احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في مصل حمار 3٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة.بعد الحضانة غسل العينة خمس مرات في PBST لمدة ساعة واحدة لكل غسل. احتضان العينة مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة الفلورية في مصل حمار 3٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة. ثم كرر يغسل في PBST.أضف الماء المؤين وخزن العينة على بعد أربع درجات مئوية من الضوء المباشر. لتصوير العينة، ضعها في طبق زجاجي أسفل وترطيبها برذاذين من محلول التخزين. حدد الهدف وافحص العينة باستخدام ضوء الفلورسينس.التبديل إلى التحكم في الكمبيوتر، وتشغيل أشعة الليزر وضبط كثافة الليزر، فتحة الثقب، والكاشفات الطول الموجي، وكسب، والقرار والتكبير. تعيين رقم وحجم الخطوة مكدس Z، ثم ابدأ اقتناء. استئصال فص الرئة واحد من فأر القتل الرحيم ووضعه في 10 في 10 في خمسة ملليمتر قالب التبريد.تغطية ذلك مع ما يقرب من 500 ميل ميكرولتر من مركب أكتوبر وتجميده على الجليد الجاف. حافظ على العينة عند درجة الحرارة تلك. استئصال واحد فص الرئة decellularized من الماوس المعالجة، ووضعه في قالب التبريد مع أكبر مساحة السطح إلى أسفل وتغطيتها مع مركب أكتوبر.تجميد العينة على الجليد الجاف والحفاظ عليها في درجة الحرارة تلك حتى المطلوبة خلاف ذلك. يمكن تخزين العينة لمدة 12 أسبوعا على الأقل. استخدام cryostat إلى قسم كتل الأنسجة المجمدة في خمسة أقسام ميكرومتر في ناقص 20 درجة مئوية.ووضع المقاطع على الشرائح الزجاجية اللاصقة. نقل الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة حتى يجف الهواء. تزج لفترة وجيزة الشرائح في برنامج تلفزيوني، تليها 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.يغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني، ثم مرتين في الماء المقطر لمدة خمس دقائق لكل غسل. تزج الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين ماير لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اغسل الشرائح في جرة كوبلاند تحت الماء المقطر الجاري لمدة 10 دقائق وانغمس في محلول eosin لمدة سبع دقائق.تراجع في الزيلين عدة مرات. تطبيق بضع قطرات من DPX تصاعد المتوسطة ووضع زلة غطاء زجاجي. اترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي ثم قم بمسحها ضوئيا في ماسح ضوئي للشرائح.بعد الانتهاء بنجاح من البروتوكول، والقلب والرئتين والأنسجة NX تكون خالية من الخلايا. يمكن التحقق من صحة إزالة الخلايا عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين إيوزين من سقالات ECM. تحتفظ السقالات بأبعاد الأعضاء الطازجة وهيكل ECM القابل للانزيم سليم.وأظهرت سقالات ECM زيادة نفاذية و penetrability الخفيفة. باستخدام هذا البروتوكول مع مرحلة المجهر الآلي يسمح للتصوير البلاط ثلاثي الأبعاد من عينات جبل كله في دقة ميكرون الفرعية. من الضروري تجنب التدفق نحو الأجهزة ذات الاهتمام لتحقيق التكبيل الموحد الكامل.يجب أن يكون تشريح الأوعية وربطها جراحيا فعالا. وفي الوقت نفسه احترام الأنسجة المستهدفة للحفاظ على بنية VCM الأصلية. بعد هذا الإجراء، سيتم إثراء السقالات لبروتينات ECM الهيكلية ويمكن استخدامها لقياس الطيف الكتلي أو هندسة الأنسجة.تمهد هذه التقنية الطريق إلى رسم خرائط عالية الدقة للمصفوفة خارج الخلية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

نموذج الفأر من التعب المستحث بواسطة الطرفية تشعيع

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

جيل وعزل الخلايا القبض على دورة الخلية مع كاريوتيبيس المعقدة

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

نموذج أورثوتوبيك طرحه ونيون مورين سينجينيك المعتمدة على الاندروجين والاخصاء مقاومة سرطان البروستاتا

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

فيروس تقديم أدلة كريسبر للبروستاتا موريني لتحوير الجينات

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

الجيل السريع من الخلايا الصباغية الأولية Murine والثقافات الليفية

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

نموذج مورين من أورام الكبد النقيلي في وضع إصابة نقص تروية التسريب

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

في المختبر إنشاء خط الخلايا السرطانية للراس والرقبة المهندسة جينيا باستخدام نظام كاس 9 الفيروسات المرتبطة Adeno

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

الكشف عن الحمض النووي خالية من الخلايا في عينات بلازما الدم من مرضى السرطان

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

زرع وتقييم سرطان الجلد في المشيمية الفئران عن طريق التصوير المقطعي للتماسك البصري

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

جيل سايبريد ناقل الغضروف باستخدام خطوط الخلايا السرطانية

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...