Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

Vi takker professor Ivana Novak og Dr. Nynne Meyn Christensen (Center for Advanced Bioimaging (CAB), Københavns Universitet) for at have givet mikroskopadgang. Dette arbejde blev støttet af Det Europæiske Forskningsråd (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR og JTE); ph.d.-stipendium fra Lundbeckfonden (R286-2018-621; HR); det svenske forskningsråd (2017-03389; CDM); Kræftens Bekæmpelse, Kræftens Bekæmpelse (CAN 2016/783, 19 0632 Pj og 190007; CDM); German Cancer Aid (Deutsche Krebshilfe; RR); kræftforeningen (R204-A12454; RR).

Alle procedurer, der indgår her, er gennemgået og godkendt af det etiske udvalg, der regulerer eksperimentel medicin på Københavns Universitet og er enige i dansk og europæisk lovgivning. For at demonstrere denne protokol har vi brugt kvindelige BALB / cJ-mus på 8-12 uger og en MMTV-PyMT kvindelig mus på 11 uger.
BEMÆRK: Undgå bakteriel forurening af det decellulære ECM-stillads giver det bedste billeddannelsesresultat og giver mulighed for langtidsprøveopbevaring. Det er derfor vig...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

Decellulariseringsteknikker baseret på vævs agitation ændrer ECM-strukturen, hvilket gør dem uegnede til ECM-strukturanalyse4. Perfusion decellularisering, ved hjælp af en anatomisk rute som aorta af luftrøret, gør det muligt at nå kapillær seng, eller terminal alveol, og letter leveringen af decellulariserende midler i hele organet. Brugen af zwitterioniske, anioniske og ikke-ioniske rengøringsmidler til at decellulisere væv er rapporteret4,5,6, dog, natrium dodecyl sulfat (SDS, anioni...

ECM er et tredimensionelt netværk lavet af proteiner og glycaner, der rummer alle celler i en flercellet organisme, hvilket giver organer deres form og regulerer celleadfærd gennem hele livet1. Fra ægbefrugtning og fremefter bygger og ombygger cellerne ECM og kontrolleres igen strengt af den. Formålet med denne protokol er at åbne en måde at analysere og kortlægge mus ECM, da mus er den mest anvendte modelorganisme i pattedyrs patofysiologi.
Udviklingen af denne metode var drevet af behovet for at karakterisere og isolere metastaser-associerede indfødte ECM2. Da tumorer mangler korrekt anatomisk vascularization og mus er relativt små organismer, mikrokirurgiske procedurer blev designet til retrogradely kateterisere aorta, samtidig med at cirkulationen af de store fartøj, der fører til en tumor (f.eks lungevener), således at fokus reagens flow og tillader tumor decellularisering. Denne metode producerer ECM stilladser med en bevaret struktur2, der kan immun farves og afbildes, så ECM struktur kortlægning i submicron detaljer. For at udføre denne protokol er det nødvendigt at erhverve kirurgiske og mikrokirurgiske færdigheder (dissektion, mikrosuturing og kateterisering), der kan udgøre en potentiel begrænsning af dets anvendelse. Så vidt vi ved, repræsenterer denne metode den nyeste teknologi til native ECM struktur imaging analysis2,3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

Vi præsenterer her en decellularisering protokol for mus hjerte og lunger. Det producerer strukturelle ECM stilladser, der kan bruges til at analysere ECM topologi og sammensætning. Det er baseret på en mikrokirurgisk procedure designet til at kateterisere luftrøret og aorta af en aflivet mus til at gennemtrænge hjerte og lunger med decellulariserende midler. Det decellulære kardiopulmonalkompleks kan efterfølgende immunplettet for at afsløre placeringen af strukturelle ECM-proteiner. Hele proceduren kan afsluttes om 4 dage.
ECM-stilladserne som følge af denne protokol er fri for dimensionelle forvrængninger. Fraværet af celler muliggør strukturel undersøgelse af ECM-strukturer ned til submicronopløsning i 3D. Denne protokol kan anvendes på sundt og sygt væv fra mus så unge som 4 uger gamle, herunder musemodeller af fibrose og kræft, åbner vejen for at bestemme ECM remodeling forbundet med kardiopulmonal sygdom.

Kardiopulmonal decellularisering Efter en vellykket fuldførelse af protokollen, hjerte og lunger, samt bilag væv såsom aorta bue, vil være fri for celler. Decellularisering kan valideres ved hæmatoxylin-eosin farvning (figur 1) af ECM stilladser viser fjernelse af kerner sammenligne med det indfødte væv. Disse stilladser bevarer dimensionerne af friske organer og dens uopløselige ECM struktur er intakt2. <st...

Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Denne protokol har til formål at decellularisere hjertet og lungerne af mus. Den resulterende ekstracellulære matrix (ECM) stilladser kan immunstained og afbildet til at kortlægge placeringen og topologi af deres komponenter.

Decellularisering af Murine Cardiopulmonal Complex

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Denne protokol er porten til den ekstracellulære matrix. Det er kompleksitet og dets struktur ned til sub mikron skala. Så den største fordel ved denne metode er, at det gør det muligt at opnå en ekstracellulær matrix, der bevarer sin strukturelle integritet og dermed åbner vejen for biokemisk og anatomisk analyse.Det vil være Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten og Maria Rafaeva, der i øjeblikket er i mit laboratorium og Chris Madsen, og som var i mit laboratorium og fortsatte arbejdet på Lunds Universitet. Begynd med at barbere brystkassen, maven og bagsiden af den aflivede mus med en hårklipper. Desinficer området med 70% ethanol.Derefter pin musen til en polystyren bakke, udvide sine fire ende bagben, samt dens hoved og hale. Placer det under mikrokirurgi mikroskop. Ved hjælp af en Mayo lige mønster saks, lav en kutan snit løber fra den sub mandibulære region til underlivet og dissekere subkutant at udsætte brystvæggen og bughinden.Brug derefter mikrokirurgisk saks til at skære pectoralis store og pectoralis mindre muskler langs det sjette interkostalale rum på begge sider af brystvæggen. Skær brystbenet langs de tidligere snit med lige mønster saks. Afslut derefter en sternotomi ved at skære brystbenet langs sin lange akse.Løft og pin, begge sider af brystvæggen for at udsætte kardiopulmonalkomplekset. Brug runde tippet mikrotant til at punktafgifter thymus og omgivende fedtvæv ved forsigtigt at trække dem ud af deres vedhæftede filer. Og skær spiserøret med mikrosaks.Adskil brachiocephalic vener og brachiocephalic arterie med skarpe mikro-sammentak. Derefter adskille venstre fælles halspulsåren og venstre subclavian arterier fra det underliggende væv for at lette ligation og cauterization. Brug en microneedle holder og skarpe mikro-sammenkævninger og en ni oh sutur til at placere sting over fremkomsten af brachiocephalic venstre fælles halspulsåren og venstre subclavian arterier, cauterize brachiocephalic vener.Ved hjælp af mikro saks, åbne en indgang ved at dele ledbåndet. Indføre en 27 gauge kateter i luftrøret og forsigtigt skubbe indtil luftrør grene i bronkierne, idet sørge for ikke at forstyrre bronkierne. Brug en seks O sutur, placere tre sting omkring luftrøret for at sikre kateteret.Del musen i højden af den 12. brysthvirvel, den faldende Aorta løber forreste til rygsøjlen og skal sektioneres her sammen med rygsøjlen. Retrogradely kateterisere Aorta og skubbe kateteret, indtil det når aortabuen. Ved hjælp af en sutur skal du placere fire sting omkring Aorta, der begynder fem millimeter under kateteretspidsen.Tilslut musen til et pumpesystem ved hjælp af silikone slanger og lavere stik. Gennemsyt med deioniseret vand ved 200 mikroliter i minuttet i 15 minutter. Skift derefter perfusionsmidlet til 0,5%DOC, fortyndet i deioniseret vand og gennemtræng natten over.På den næste dag, ændre perfusion agent til 0,1% SDS fortyndet i deioniseret vand, og gennemtrænge i otte timer. Derefter gennemgå med deioniseret vand i 24 timer for at vaske væk SDS og DOC. Resect decellulariserede hjerte og lunger ved at dele sine vedhæftede filer til brystkassen.Opbevar vævet i et sterilt kryorør i deioniseret vand med 1% penicillin streptomycin og 0,3 mikromolar natrium azid ved fire grader Celsius. For at udføre immunfarvning skal prøven blokeres ved at inkubere den i et kryorør, der indeholder 6% æselserum og 3% BSA natten over. Inkuber derefter med primært antistof i 3% æselserum i PBS i 24 timer.Efter inkubationen vaskes prøven fem gange i PBST i en time pr. vask. Inkuberes prøven med fluorescerende konjugeret sekundært antistof i 3% æselserum i PBS i 24 timer. Gentag derefter vaskerne i PBST.Tilsæt det Ioniserede vand og opbevar prøven ved fire grader Celsius væk fra direkte lys. For at forestille prøven skal du placere den i en glasbundsfad og befugte den med to dråber opbevaringsopløsning. Sæt målet, og undersøg prøven ved hjælp af fluorescenslys.Skift til computerstyring, tænd lasere og juster laserintensitet, pinhole blænde, detektorer bølgelængde, gain, opløsning og zoom. Angiv antallet og trinstørrelsen for Z-stakken, og begynd derefter anskaffelsen. Punktafgifter en lunge lap fra en aflivet mus og placere den i en 10 af 10 af fem millimeter cryo skimmel.Dæk det med ca 500 mile mikroliter af OCT sammensatte og fryse det på tøris. Hold prøven ved den temperatur. Punktafgifter en decelluliseret lungelap fra en forarbejdet mus, placere den i en kryo skimmel med det største overfladeareal ned og dække det med OCT sammensatte.Frys prøven på tøris, og hold den ved denne temperatur, indtil det ellers er nødvendigt. Prøven kan opbevares i mindst 12 uger. Brug en kryostat til at opdele frosne vævsblokke i fem mikrometer sektioner ved minus 20 grader Celsius.Og læg sektionerne på klæbende glasrutschebaner. Overfør lysbillederne til stuetemperatur, indtil luften er tørret. Sænk kortvarigt diasene i PBS, efterfulgt af 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter.Vask en gang i PBS, derefter to gange i destilleret vand i fem minutter pr vask. Fordyb rutsjebanerne i Myers hæmatoxylinopløsning i 10 minutter. Vask derefter diasene i en Copeland-krukke under kørende destilleret vand i 10 minutter og nedsænkes i eosinopløsning i syv minutter.Dyp i xylen flere gange. Påfør et par dråber DPX montering medium og placere et glas dække slip. Lad rutsjebanerne tørre natten over under en kemisk hætte og derefter scanne dem i en diasscanner.Efter en vellykket fuldførelse af protokollen, hjerte og lunger og NX væv vil være fri for celler. Decellularisering kan valideres ved hæmatoxylin eosin farvning af ECM stilladser. Stilladserne bevarer dimensionerne af friske organer og dens uoliable ECM struktur er intakt.ECM stilladser viste øget gennemtrængelighed og let penetrability. Brug af denne protokol med et motoriseret mikroskopstadium giver mulighed for tredimensionel flisebelagt billeddannelse af hele mountprøver ved submikronopløsning. Det er vigtigt at sky flow mod organer af interesse for at opnå fuldstændig ensartet decellurization.Den mikrokirurgiske dissektion og ligation af fartøjer skal være effektiv. Og samtidig respektere målet væv til at opretholde indfødte VCM struktur. Efter denne procedure vil stilladserne blive beriget til strukturelle ECM-proteiner og kan bruges til massespektrometri eller vævsteknik.Denne teknik baner vejen for høj opløsning kortlægning af den ekstracellulære matrix.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En mus Model af træthed induceret af perifere Bestråling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Generation og Isolation af cellecyklus-anholdt celler med komplekse Karyotypes

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

En bioluminescerende og fluorescerende Orthotopic Syngeneic Murine Model af Androgen-afhængige og kastration-resistente prostatakræft

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virus levering af CRISPR Guides til Murine prostata for gen ændring

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Hurtig generering af primære murine melanocyte og fibroblast kulturer

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Murine model af metastatisk levertumorer i fastsættelsen af ischemia reperfusion skade

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In vitro etablering af en genetisk manipuleret murine hoved og hals Cancer cellelinje ved hjælp af en adeno-associeret virus-Cas9 system

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Påvisning af cellefri DNA i blodplasmaprøver af kræftpatienter

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation og evaluering af melanom i murine choroid via optisk kohærenstomografi

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Transmitochondrial Cybrid Generation ved hjælp af kræftcellelinjer

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...