Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

We bedanken Prof. Ivana Novak en Dr. Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Universiteit van Kopenhagen) voor het bieden van microscooptoegang. Dit werk werd ondersteund door de Europese Onderzoeksraad (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR en JTE); een PhD fellowship van de Lundbeck Foundation (R286-2018-621; MR); de Zweedse Onderzoeksraad (2017-03389; CDM); de Zweedse kankervereniging, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, en 190007; CDM); Duitse kankerhulp (Deutsche Krebshilfe; RR); en de Deense kankervereniging (R204-A12454; RR).

Alle procedures die hier zijn opgenomen, zijn beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie voor experimentele geneeskunde aan de Universiteit van Kopenhagen en zijn in overeenstemming met de Deense en Europese wetgeving. Om dit protocol aan te tonen, hebben we vrouwelijke BALB / cJ-muizen van 8-12 weken oud en een MMTV-PyMT vrouwelijke muis van 11 weken oud gebruikt.
OPMERKING: Het vermijden van bacteriële besmetting van de gedecellulariseerde ECM-steiger geeft het beste beeldvormings...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

Decellularisatietechnieken op basis van weefselagitatie veranderen de ECM-structuur, waardoor ze ongeschikt zijn voor ECM-structuuranalyse4. Perfusie-decellularisatie, met behulp van een anatomische route zoals de aorta van de luchtpijp, maakt het mogelijk om het capillaire bed of de terminale longblaasjes te bereiken en vergemakkelijkt de afgifte van decellulariserende middelen in het hele orgaan. Het gebruik van zwitterionische, anionische en niet-ionische detergentia om weefsel te decellularise...

De ECM is een driedimensionaal netwerk gemaakt van eiwitten en glycanen dat alle cellen in een meercellig organisme herbergt, organen hun vorm geeft en het celgedrag gedurende het hele leven reguleert1. Vanaf de eicelbevruchting bouwen en hermodelleren cellen de ECM en worden er op hun beurt streng door gecontroleerd. Het doel van dit protocol is om een manier te openen om muis-ECM te analyseren en in kaart te brengen, omdat muizen het meest gebruikte modelorganisme zijn in de pathofysiologie van zoogdieren.
De ontwikkeling van deze methode werd gedreven door de noodzaak om metastase-geassocieerde native ECM2 te karakteriseren en te isoleren. Omdat tumoren geen goede anatomische vascularisatie hebben en muizen relatief kleine organismen zijn, werden microchirurgische procedures ontworpen om de aorta retrograde te katheteriseren, terwijl de circulatie van het belangrijkste vat dat naar een tumor leidt (bijvoorbeeld de longaders) wordt geïsoleerd, waardoor de reagensstroom wordt geconcentreerd en tumordecellularisatie mogelijk wordt. Deze methode produceert ECM-steigers met een geconserveerde structuur2 die immunostained en afgebeeld kunnen worden, waardoor ECM-structuur in submicron detail in kaart kan worden gebracht. Om dit protocol uit te voeren, is het noodzakelijk om chirurgische en microchirurgische vaardigheden te verwerven (dissectie, micros hechten en katheterisatie) die een mogelijke beperking van het gebruik ervan kunnen vormen. Voor zover wij weten, vertegenwoordigt deze methode de state-of-the-art voor native ECM-structuurbeeldvormingsanalyse2,3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

We presenteren hier een decellularisatieprotocol voor muizenhart en -longen. Het produceert structurele ECM-steigers die kunnen worden gebruikt om ECM-topologie en -samenstelling te analyseren. Het is gebaseerd op een microchirurgische procedure die is ontworpen om de luchtpijp en aorta van een geëuthanaseerde muis te katheteriseren om het hart en de longen te perfuseren met decellulariserende middelen. Het gedecellulariseerde cardiopulmonale complex kan vervolgens immunosijfd worden om de locatie van structurele ECM-eiwitten te onthullen. De hele procedure kan in 4 dagen worden voltooid.
De ECM-steigers die uit dit protocol voortkomen, zijn vrij van dimensionale vervormingen. De afwezigheid van cellen maakt structureel onderzoek van ECM-structuren tot submicronresolutie in 3D mogelijk. Dit protocol kan worden toegepast op gezond en ziek weefsel van muizen zo jong als 4 weken oud, inclusief muismodellen van fibrose en kanker, waardoor de weg wordt geopend om ECM-remodellering geassocieerd met cardiopulmonale ziekte te bepalen.

Cardiopulmonale decellularisatie Na het succesvol voltooien van het protocol zullen het hart en de longen, evenals het annexweefsel zoals de aortaboog, vrij zijn van cellen. Decellularisatie kan worden gevalideerd door hematoxyline-eosinekleuring (figuur 1) van de ECM-steigers die verwijdering van de kernen laten zien in vergelijking met het inheemse weefsel. Deze steigers behouden de afmetingen van verse organen en de onoplosbare ECM-stru...

Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Dit protocol heeft tot doel het hart en de longen van muizen te decellulariseren. De resulterende extracellulaire matrix (ECM) steigers kunnen immunos gekleurd en afgebeeld worden om de locatie en topologie van hun componenten in kaart te brengen.

Decellularisatie van het Murine Cardiopulmonaal Complex

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Dit protocol is de toegangspoort tot de extracellulaire matrix. Het is complexiteit en zijn structuur tot op sub micron schaal. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dus dat het mogelijk is om een extracellulaire matrix te verkrijgen die zijn structurele integriteit behoudt en zo de weg vrijmaakt voor biochemische en anatomische analyse.Het demonstreren van de procedure zal zijn, Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten en Maria Rafaeva, momenteel in mijn laboratorium en Chris Madsen en die in mijn laboratorium was en het werk aan de universiteit van Lund voortzette. Begin met het scheren van de thorax, buik en rug van de geëuthanaseerde muis met een tondeuse. Desinfecteer het gebied met 70% ethanol.Pin de muis vervolgens vast aan een polystyreenbak en verleng de vier achterpoten, evenals de kop en staart. Plaats het onder de microchirurgiemicroscoop. Maak met behulp van een Mayo-schaar met recht patroon een cutane incisie die van het submandibulaire gebied naar de onderbuik loopt en ontleed subcutaan om de thoracale wand en het peritoneum bloot te leggen.Gebruik vervolgens een microchirurgische schaar om de pectoralis major en pectoralis minor spieren langs de zesde intercostale ruimte aan beide zijden van de thoracale wand te knippen. Knip het borstbeen langs de vorige incisies met een rechte patroonschaar. Voltooi vervolgens een sternotomie door het borstbeen langs zijn lange as te snijden.Verheffen en pinnen, beide zijden van de thoracale wand om het cardiopulmonale complex bloot te leggen. Gebruik microtangen met ronde punt om de thymus en het omliggende vetweefsel weg te snijden door ze voorzichtig van hun aanhechtingen te trekken. En knip de slokdarm af met een microschaar.Scheid de brachiocephalische aderen en brachiocephalische slagader met een scherpe microtang. Scheid vervolgens de linker gemeenschappelijke halsslagader en linker subclavia slagaders van het onderliggende weefsel om ligatie en cauterisatie te vergemakkelijken. Gebruik een micronaaldhouder en scherpe microtang en een negen oh hechting om hechtingen boven de opkomst van de brachiocephalische linker gemeenschappelijke halsslagaders en linker subclavia slagaders te plaatsen, cauteriseer de brachiocephalische aderen.Open met behulp van een microschaar een ingang door het ligament te snijden. Breng een 27 gauge katheter in de luchtpijp en duw voorzichtig tot de luchtpijp zich in de bronchiën vertakt, zorg ervoor dat de bronchiën niet worden verstoord. Gebruik een zes O-hechting om drie hechtingen rond de luchtpijp om de katheter vast te zetten.Sectie de muis ter hoogte van de 12e thoracale wervel, de dalende Aorta loopt anterieur naar de wervelkolom en moet hier samen met de wervelkolom worden gesneden. Katheteriseer de Aorta retrograde en duw de katheter totdat deze de aortaboog bereikt. Plaats met behulp van een hechting vier hechtingen rond de Aorta, beginnend vijf millimeter onder de katheterpunt.Sluit de muis aan op een pompsysteem met behulp van siliconen buizen en onderste connectoren. Perfuseer met gedeïoniseerd water met 200 microliter per minuut gedurende 15 minuten. Verander vervolgens het perfusiemiddel in 0,5% DOC, verdund in gedeïoniseerd water en perfuseer 's nachts.Verander de volgende dag het perfusiemiddel in 0,1% SDS verdund in gedeïoniseerd water en perfundeer gedurende acht uur. Perfuseer vervolgens gedurende 24 uur met gedeïoniseerd water om de SDS en DOC weg te spoelen. Reseceer het gedecellulariseerde hart en de longen door de aanhechtingen aan de thorax te snijden.Bewaar het weefsel in een steriele cryobuis in gedeïoniseerd water met 1% penicilline streptomycine en 0,3 micromolair natriumazide bij vier graden Celsius. Om immunokleuring uit te voeren, blokkeert u het monster door het 's nachts te incuberen in een cryobuis met 6% ezelserum en 3% BSA. Incubeer vervolgens met primair antilichaam in 3% ezelserum in PBS gedurende 24 uur.Na de incubatie was het monster vijf keer in PBST gedurende één uur per wasbeurt. Incubeer het monster met fluorescerend geconjugeerd secundair antilichaam in 3% ezelserum in PBS gedurende 24 uur. Herhaal vervolgens de wasbeurten in PBST.Voeg het geïoniseerde water toe en bewaar het monster bij vier graden Celsius uit de buurt van direct licht. Om het monster in beeld te brengen, plaatst u het in een glazen schaal en bevochtigt u het met twee druppels bewaaroplossing. Stel het doel in en inspecteer het monster met behulp van fluorescentielicht.Schakel over naar computerbesturing, schakel lasers in en pas de laserintensiteit, pinhole-opening, detectorgolflengte, versterking, resolutie en zoom aan. Stel het aantal en de stapgrootte voor Z-stapel in en begin met acquisitie. Snijd een longkwab van een geëuthanaseerde muis en plaats deze in een cryomal van 10 bij 10 bij vijf millimeter.Bedek het met ongeveer 500 mijl microliter OCT-compound en vries het in op droogijs. Houd het monster op die temperatuur. Snijd een gedecellulariseerde longkwab uit een verwerkte muis, plaats deze in een cryomal met het grootste oppervlak naar beneden en bedek het met OCT-verbinding.Vries het monster in op droogijs en houd het op die temperatuur totdat het anders nodig is. Het monster kan minstens 12 weken worden bewaard. Gebruik een cryostaat om bevroren weefselblokken in vijf micrometersecties te snijden bij min 20 graden Celsius.En plaats de secties op zelfklevende glasplaten. Breng de glaasjes op kamertemperatuur tot ze aan de lucht zijn gedroogd. Dompel de dia's kort onder in PBS, gevolgd door 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten.Was eenmaal in PBS en vervolgens twee keer in gedestilleerd water gedurende vijf minuten per wasbeurt. Dompel de dia's gedurende 10 minuten onder in de hematoxyline-oplossing van Myer. Was vervolgens de glaasjes in een Copeland-pot onder stromend gedestilleerd water gedurende 10 minuten en dompel ze zeven minuten onder in eosine-oplossing.Dip in xyleen meerdere keren. Breng een paar druppels DPX-montagemedium aan en plaats een glazen afdekslip. Laat de dia's een nacht drogen onder een chemische kap en scan ze vervolgens in een diascanner.Na het succesvol afronden van het protocol zijn het hart en de longen en het NX-weefsel vrij van cellen. Decellularisatie kan worden gevalideerd door hematoxyline eosine kleuring van de ECM steigers. De steigers behouden de afmetingen van verse organen en de onverbezelbare ECM-structuur is intact.ECM-steigers vertoonden een verhoogde permeabiliteit en lichtdoordringbaarheid. Het gebruik van dit protocol met een gemotoriseerde microscooptrap maakt driedimensionale betegelde beeldvorming van hele mount-monsters met een submicronresolutie mogelijk. Het is essentieel om stroming naar de organen van belang te vermijden om volledige uniforme decellurisatie te bereiken.De microchirurgische dissectie en ligatie van bloedvaten moet effectief zijn. En respecteer tegelijkertijd de doelweefsels om de inheemse VCM-structuur te behouden. Na deze procedure worden de steigers verrijkt voor structurele ECM-eiwitten en kunnen ze worden gebruikt voor massaspectrometrie of tissue engineering.Deze techniek effent de weg naar hoge resolutie mapping van de extracellulaire matrix.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Een muismodel van vermoeidheid geïnduceerd door Peripheral Bestraling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Generatie en isolatie van de celcyclus-gearresteerd cellen met complexe Karyotypes

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Een bioluminescente en fluorescerende Orthotopic Syngeneic lymfkliertest Model van androgeen-afhankelijke en castratie-resistente prostaatkanker

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virus levering van CRISPR gidsen voor de lymfkliertest prostaat voor Gene wijziging

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Snelle aanmaak van primaire Murine melanocyten en fibroblast-culturen

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Murine model van gemetastaseerde lever tumoren in de setting van ischemie reperfusie letsel

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Detectie van celvrij DNA in bloedplasmamonsters van kankerpatiënten

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantatie en evaluatie van melanoom in het muizenvlies via optische coherentietomografie

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Transmitochondriale Cybride generatie met behulp van kankercellijnen

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...