Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

Nous remercions les professeurs Ivana Novak et Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Université de Copenhague) d’avoir fourni un accès au microscope. Ces travaux ont été soutenus par le Conseil européen de la recherche (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR et JTE); une bourse de doctorat de la Fondation Lundbeck (R286-2018-621; MR); le Conseil suédois de la recherche (2017-03389; MDP); la Société suédoise du cancer, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, et 190007; MDP); Aide allemande contre le cancer (Deutsche Krebshilfe; RR); et la Société danoise du cancer (R204-A12454; RR).

Toutes les procédures incluses ici ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique réglementant la médecine expérimentale de l’Université de Copenhague et sont conformes à la législation danoise et européenne. Pour démontrer ce protocole, nous avons utilisé des souris femelles BALB/cJ âgées de 8 à 12 semaines et une souris femelle MMTV-PyMT âgée de 11 semaines.
REMARQUE: Éviter la contamination bactérienne de l’échafaudage ECM décellularisé donne le meil...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

Les techniques de décellularisation basées sur l’agitation tissulaire modifient la structure de l’ECM, ce qui les rend impropres à l’analyse de la structure de l’ECM4. La décellularisation par perfusion, utilisant une voie anatomique telle que l’aorte de la trachée, permet d’atteindre le lit capillaire, ou alvéole terminale, et facilite l’administration d’agents décellularisants dans tout l’organe. L’utilisation de détergents zwittérioniques, anioniques et non ioniques...

L’ECM est un réseau tridimensionnel composé de protéines et de glycanes qui accueille toutes les cellules d’un organisme multicellulaire, donnant aux organes leur forme et régulant le comportement cellulaire tout au long de la vie1. À partir de la fécondation des ovules, les cellules construisent et remodèlent l’ECM, et sont à leur tour strictement contrôlées par celui-ci. Le but de ce protocole est d’ouvrir la voie à l’analyse et à la cartographie de l’ECM de la souris, car les souris sont l’organisme modèle le plus utilisé en physiopathologie des mammifères.
Le développement de cette méthode a été motivé par la nécessité de caractériser et d’isoler l’ECM2 natif associé aux métastases. Comme les tumeurs manquent de vascularisation anatomique appropriée et que les souris sont des organismes relativement petits, les procédures microchirurgicales ont été conçues pour cathétériser rétrogradement l’aorte, tout en isolant la circulation du vaisseau majeur menant à une tumeur (par exemple, les veines pulmonaires), concentrant ainsi le flux de réactif et permettant la décellularisation tumorale. Cette méthode produit des échafaudages ECM avec une structure conservée2 qui peut être immunocolorée et imagée, permettant une cartographie de la structure ECM dans des détails submicroniques. Pour réaliser ce protocole, il est nécessaire d’acquérir des compétences chirurgicales et microchirurgicales (dissection, microsuturing et cathétérisme) qui peuvent représenter une limitation potentielle à son utilisation. À notre connaissance, cette méthode représente l’état de l’art pour l’analyse d’imagerie de structure ECM native2,3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

Nous présentons ici un protocole de décellularisation pour le cœur et les poumons des souris. Il produit des échafaudages ECM structurels qui peuvent être utilisés pour analyser la topologie et la composition ECM. Il est basé sur une procédure microchirurgicale conçue pour cathétériser la trachée et l’aorte d’une souris euthanasiée afin de perfuser le cœur et les poumons avec des agents décellularisants. Le complexe cardiopulmonaire décellularisé peut ensuite être immunocoloré pour révéler l’emplacement des protéines ECM structurelles. L’ensemble de la procédure peut être complété en 4 jours.
Les échafaudages ECM résultant de ce protocole sont exempts de distorsions dimensionnelles. L’absence de cellules permet l’examen structurel des structures ECM jusqu’à une résolution submicronique en 3D. Ce protocole peut être appliqué aux tissus sains et malades de souris aussi jeunes que 4 semaines, y compris des modèles murins de fibrose et de cancer, ouvrant la voie à la détermination du remodelage ECM associé à la maladie cardiopulmonaire.

Décellularisation cardiopulmonaire Après avoir terminé avec succès le protocole, le cœur et les poumons, ainsi que le tissu annexe tel que l’arc aortique, seront exempts de cellules. La décellularisation peut être validée par coloration à l’hématoxyline-éosine (Figure 1) des échafaudages ECM montrant l’élimination des noyaux par rapport au tissu natif. Ces échafaudages conservent les dimensions des organes frais et sa s...

Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Ce protocole vise à décellulariser le cœur et les poumons des souris. Les échafaudages de matrice extracellulaire (ECM) qui en résultent peuvent être immunocolorés et imagés pour cartographier l’emplacement et la topologie de leurs composants.

Décellularisation du complexe cardiopulmonaire murin

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Ce protocole est la passerelle vers la matrice extracellulaire. Sa complexité et sa structure jusqu’à l’échelle submicronique. Le principal avantage de cette méthode est donc qu’elle permet d’obtenir une matrice extracellulaire qui conserve son intégrité structurelle ouvrant ainsi la voie à l’analyse biochimique et anatomique.Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten et Maria Rafaeva, actuellement dans mon laboratoire et Chris Madsen et qui était dans mon laboratoire et a continué le travail à l’Université de Lund, feront la démonstration de la procédure. Commencez par raser le thorax, l’abdomen et le dos de la souris euthanasiée avec une tondeuse à cheveux. Désinfectez la zone avec de l’éthanol à 70%.Épinglez ensuite la souris à un plateau en polystyrène, en étendant ses quatre membres postérieurs d’extrémité, ainsi que sa tête et sa queue. Placez-le sous le microscope de microchirurgie. À l’aide d’un ciseau à motif droit Mayo, faites une incision cutanée allant de la région sous-mandibulaire au bas-ventre et disséquez par voie sous-cutanée pour exposer la paroi thoracique et le péritoine.Utilisez ensuite des ciseaux microchirurgicaux pour couper les muscles pectoraux majeurs et pectoraux mineurs le long du sixième espace intercostal des deux côtés de la paroi thoracique. Coupez le sternum le long des incisions précédentes avec des ciseaux à motif droit. Complétez ensuite une sternotomie en coupant le sternum le long de son long axe.Élevez et épinglez les deux côtés de la paroi thoracique pour exposer le complexe cardiopulmonaire. Utilisez des micro-pinces à pointe ronde pour exciser le thymus et le tissu adipeux environnant en les retirant délicatement de leurs attaches. Et coupez l’œsophage avec des micro-ciseaux.Séparer les veines brachiocéphales et l’artère brachiocéphale à l’aide de micro-pinces pointues. Ensuite, séparez les artères carotide commune gauche et sous-clavière gauche du tissu sous-jacent pour faciliter la ligature et la cautérisation. Utilisez un porte-micro-aiguilles et des micro-pinces pointues et une suture de neuf oh pour placer des points de suture au-dessus de l’émergence des artères carotides communes gauches et sous-clavières gauches brachiocéphales, cautériser les veines brachiocéphales.À l’aide de micro-ciseaux, ouvrez une entrée en sectionnant le ligament. Introduisez un cathéter de calibre 27 dans la trachée et poussez délicatement jusqu’à ce que la trachée se ramifie dans les bronches, en prenant soin de ne pas perturber les bronches. À l’aide d’une suture six O, placez trois points de suture autour de la trachée pour fixer le cathéter.Sectionnez la souris à la hauteur de la 12ème vertèbre thoracique, l’aorte descendante court antérieurement à la colonne vertébrale et doit être sectionnée ici avec la colonne vertébrale. Cathétériser rétrogradement l’aorte et pousser le cathéter jusqu’à ce qu’il atteigne l’arc aortique. À l’aide d’une suture, placez quatre points de suture autour de l’aorte, en commençant cinq millimètres sous la pointe du cathéter.Connectez la souris à un système de pompe à l’aide de tubes en silicone et de connecteurs inférieurs. Perfuser avec de l’eau désionisée à 200 microlitres par minute pendant 15 minutes. Ensuite, changez l’agent de perfusion à 0,5% DOC, dilué dans de l’eau désionisée et perfusez pendant la nuit.Le lendemain, changez l’agent de perfusion à 0,1% SDS dilué dans de l’eau désionisée et perfusez pendant huit heures. Ensuite, perfuser avec de l’eau désionisée pendant 24 heures pour laver la FDS et le DOC. Réséquez le cœur et les poumons décellularisés en sectionnant ses attaches au thorax.Conservez le tissu dans un tube cryogénique stérile dans de l’eau désionisée avec 1% de streptomycine de pénicilline et 0,3 azoture de sodium micromolaire à quatre degrés Celsius. Pour effectuer une coloration immunologique, bloquez l’échantillon en l’incubant dans un tube cryogénique contenant 6% de sérum d’âne et 3% de BSA pendant la nuit. Ensuite, incuber avec un anticorps primaire dans du sérum d’âne à 3% dans le PBS pendant 24 heures.Après l’incubation, lavez l’échantillon cinq fois dans du PBST pendant une heure par lavage. Incuber l’échantillon avec un anticorps secondaire conjugué par fluorescence dans du sérum d’âne à 3% dans le PBS pendant 24 heures. Répétez ensuite les lavages dans PBST.Ajouter l’eau ionisée et conserver l’échantillon à quatre degrés Celsius de la lumière directe. Pour imager l’échantillon, placez-le dans un plat à fond de verre et humidifiez-le avec deux gouttelettes de solution de stockage. Définissez l’objectif et inspectez l’échantillon à l’aide de la lumière de fluorescence.Passez au contrôle informatique, allumez les lasers et ajustez l’intensité du laser, l’ouverture du sténopé, la longueur d’onde des détecteurs, le gain, la résolution et le zoom. Définissez le nombre et la taille de l’étape pour la pile Z, puis commencez l’acquisition. Excisez un lobe pulmonaire d’une souris euthanasiée et placez-le dans un moule cryogénique de 10 x 10 x cinq millimètres.Couvrez-le avec environ 500 milles de microlitres de composé OCT et congelez-le sur de la glace carbonique. Maintenez l’échantillon à cette température. Excisez un lobe pulmonaire décellularisé d’une souris traitée, placez-le dans un moule cryogénique avec la plus grande surface vers le bas et recouvrez-le de composé OCT.Congelez l’échantillon sur de la glace carbonique et maintenez-le à cette température jusqu’à ce qu’il en soit autrement. L’échantillon peut être conservé pendant au moins 12 semaines. Utilisez un cryostat pour sectionner des blocs de tissus congelés en cinq sections micrométriques à moins 20 degrés Celsius.Et placez les sections sur des lames de verre adhésif. Transférer les lames à température ambiante jusqu’à ce qu’elles sèchent à l’air. Immergez brièvement les diapositives dans PBS, suivies de 4% de paraformaldéhyde dans PBS pendant 15 minutes.Laver une fois dans du PBS, puis deux fois dans de l’eau distillée pendant cinq minutes par lavage. Immergez les lames dans la solution d’hématoxyline de Myer pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les lames dans un pot Copeland sous de l’eau distillée courante pendant 10 minutes et immergez-les dans une solution d’éosine pendant sept minutes.Tremper dans le xylène plusieurs fois. Appliquez quelques gouttes de support de montage DPX et placez un couvercle en verre. Laissez les lames sécher pendant la nuit sous une hotte chimique, puis scannez-les dans un scanner à diapositives.Après avoir terminé avec succès le protocole, le cœur, les poumons et le tissu NX seront exempts de cellules. La décellularisation peut être validée par coloration à l’hématoxyline éosine des échafaudages ECM. Les échafaudages conservent les dimensions des organes frais et sa structure ECM insolable est intacte.Les échafaudages ECM ont montré une perméabilité accrue et une pénétrabilité légère. L’utilisation de ce protocole avec un étage de microscope motorisé permet une imagerie en mosaïque tridimensionnelle d’échantillons de montage entiers à une résolution inférieure au micron. Il est essentiel d’éviter le flux vers les organes d’intérêt pour obtenir une décellurisation uniforme complète.La dissection microchirurgicale et la ligature des vaisseaux doivent être efficaces. Et en même temps respecter les tissus cibles pour maintenir la structure VCM native. Suite à cette procédure, les échafaudages seront enrichis pour les protéines ECM structurelles et pourront être utilisés pour la spectrométrie de masse ou l’ingénierie tissulaire.Cette technique ouvre la voie à la cartographie à haute résolution de la matrice extracellulaire.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Un modèle de souris de la fatigue induite par périphérique Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Génération et l’isolement des cellules Cycle cellulaire-arrêté avec caryotypes complexes

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Un modèle murin syngénique bioluminescentes et Fluorescent orthotopique du Cancer de la Prostate androgéno-dépendants et résistant à la Castration

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Livraison de virus de CRISPR Guides pour la Prostate Murine pour modifications géniques

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Génération rapide de cultures de murine primaire et de fibroblaste

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Modèle de Murine des tumeurs métastatiques de foie dans le cadre des dommages de reperfusion d'ischémie

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Détection de l’ADN sans cellules dans les échantillons de plasma sanguin des patients atteints de cancer

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation et évaluation du mélanome dans la choroïde murine par tomographie par cohérence optique

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Génération transmitochondriale de Cybrides à l’aide de lignées cellulaires cancéreuses

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...